脂多糖改变牙髓干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2044

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (13): 2028-2033.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2044

脂多糖改变牙髓干细胞的生物学特性

刘影¹，高杰²，吴补领^3，4

¹南方医科大学口腔医院(广东省口腔医院)，广东省广州市 510280；²德仁口腔医院，广东省广州市 510620；³南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515；⁴南方医科大学南方医院口腔科，广东省广州市 510515

收稿日期:2019-04-08 修回日期:2019-04-18 接受日期:2019-07-15 出版日期:2020-05-08 发布日期:2020-03-09
通讯作者: 吴补领，博士，主任医师，教授，南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515；南方医科大学南方医院口腔科，广东省广州市 510515
作者简介:刘影，女，1985 年生，山东省济南市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事牙体牙髓专业研究。
基金资助:
广东省自然科学基金项目(2015A030310071)；广东省医学科学技术研究基金项目(A2019485)

Biological characteristics of dental pulp stem cells induced by lipopolysaccharide

Liu Ying¹, Gao Jie², Wu Buling^{3, 4}

¹Stomatological Hospital of Southern Medical University & Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; ²Deren Stomatological Hospital, Guangzhou 510620, Guangdong Province, China; ³School of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; ⁴Department of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2019-04-08 Revised:2019-04-18 Accepted:2019-07-15 Online:2020-05-08 Published:2020-03-09
Contact: Wu Buling, MD, Chief physician, Professor, School of Stomatology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; Department of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Liu Ying, MD, Attending physician, Stomatological Hospital of Southern Medical University & Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030310071; the Medical Science and Technology Research Project of Guangdong Province, No. A2019485

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙髓干细胞：2000年由GRONTHOS等首次分离培养，与骨髓基质干细胞比较，具有更强的自我更新能力，经体外诱导可以分化为成牙本质细胞样细胞，移植至小鼠体内可以形成典型的牙髓牙本质复合体样结构。已经证实牙髓干细胞经诱导后可以向脂肪细胞、神经细胞、成牙本质细胞及软骨细胞分化。在牙髓受到损伤时牙髓干细胞可以分化为包括成牙本质细胞在内的各种细胞成分以补充受损细胞，在牙髓组织的修复和再生过程中起关键作用，牙髓干细胞的多项分化潜能是构建生物性牙髓牙本质复合体的生物基础。
脂多糖：是革兰阴性菌胞壁的重要组分，是细菌的主要毒力因子亦是牙髓炎症的重要刺激因素。脂多糖是Toll样受体4最重要的激动剂，可以引起细胞的迁移、侵袭并释放大量免疫调节因子，已经发现脂多糖存在于深龋的牙髓组织中。

背景：龋病发生时，包括细菌在内的各种刺激沿牙本质小管传导至牙髓，牙髓组织中的牙髓干细胞受到刺激后增殖迁移至受损的牙本质下方，形成修复性牙本质以补充和修复受损组织。在此过程中，脂多糖作为细菌的主要毒力因子，是否可以影响牙髓干细胞增殖、迁移及成牙本质向分化等生物学行为，还有待研究。

目的：观察脂多糖对牙髓干细胞增殖能力、迁移能力和成牙本质向分化能力的影响。

方法：组织块酶消化法培养牙髓干细胞，给予0，0.1，1，10 mg/L脂多糖刺激后，采用MTT法检测牙髓干细胞增殖情况，划痕实验和Transwell 实验检测牙髓干细胞的迁移能力；给予1 mg/L脂多糖和矿化诱导液刺激21 d后，茜素红染色检测细胞矿化结节形成能力，RT-PCR检测成牙本质相关基因的表达。

结果与结论：①0.1，1，10 mg/L脂多糖组的吸光度值在第1，3，5，7天4个时间点均低于0 mg/L脂多糖组(P < 0.01)，迁移能力均高于0 mg/L脂多糖组；②牙髓干细胞矿化诱导 21 d后，1 mg/L脂多糖刺激组所形成的矿化结节数量和面积明显小于0 mg/L脂多糖组(P < 0.01)，成牙本质相关基因OCN、BSP、ALP表达量显著低于0 mg/L脂多糖组(P < 0.01)；③结果表明，脂多糖刺激牙髓干细胞后其增殖能力和成牙本质向分化能力降低，迁移能力明显增强。

ORCID: 0000-0001-7073-1966(刘影)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 牙髓干细胞, 脂多糖, 细胞增殖, 细胞迁移, 成牙本质向分化

Abstract:

BACKGROUND: During the decay process, the bacteria and toxins invade dental pulp tissue along the dentin tubule. Dental pulp stem cells proliferate and migrate to the damaged point, forming reparative dentin to avoid stimulations from bacteria outside. Lipopolysaccharide is the main component of gram-negative bacteria. Whether lipopolysaccharide affects the proliferation, migration, and odontoblastic ability of dental pulp stem cells remains to be studied.

OBJECTIVE: To investigate the proliferation, migration and odontoblastic abilities in dental pulp stem cells induced by lipopolysaccharide.

METHODS: Primary cultured dental pulp stem cells were stimulated by 0, 0.1,1 and 10 mg/L lipopolysaccharide. The proliferation of dental pulp stem cells was detected by MTT assay. Scratch test and Transwell assay were performed to test the migration of dental pulp stem cells. Dental pulp stem cells were cultured in mineralized solution and 1 mg/L lipopolysaccharide for 21 days. The mineralized nodule formation was detected by alizarin red staining. RT-PCR was performed to detect the expression of dentin related genes.

RESULTS AND CONCLUSION: The absorbance value in the 0.1, 1 and 10 mg/L lipopolysaccharide groups at 1, 3, 5 and 7 days was significant lower than that in the 0 mg/L lipopolysaccharide group (P < 0.01), and the migration ability was higher than that in the 0 mg/L lipopolysaccharide group. After 12 days of mineralized induction, the number and area of mineralized nodule formation in the 1 mg/L lipopolysaccharide group were significantly lower than those in the 0 mg/L lipopolysaccharide group (P < 0.01). The mRNA expression levels of osteocalcin, bone sialoprotein, and alkaline phosphatase in the 1 mg/L lipopolysaccharide group were significantly lower than those in the 0 mg/L lipopolysaccharide group (P < 0.01). These results indicate that lipopolysaccharide treatment inhibits the proliferation and odontoblastic ability of dental pulp stem cells but promotes the cell migration ability.

Key words: dental pulp stem cells, lipopolysaccharides, cell proliferation, cell migration, odontoblastic differentiation

中图分类号:

刘影, 高杰, 吴补领. 脂多糖改变牙髓干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(13): 2028-2033.

Liu Ying, Gao Jie, Wu Buling. Biological characteristics of dental pulp stem cells induced by lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(13): 2028-2033.

图/表（结果） 4

2.1 牙髓干细胞增殖能力 MTT法检测脂多糖对牙髓干细胞增殖能力的影响。结果显示，空白对照组从3 d开始高速增长呈对数生长曲线，5 d生长放缓呈平缓曲线，整个生长曲线呈“S”型。各质量浓度脂多糖刺激组细胞的吸光度值在第1，3，5，7天4个时间点均低于空白对照组(P < 0.01)，差异有显著性意义，见图1。

2.2 牙髓干细胞的迁移能力

2.2.1 划痕实验各质量浓度脂多糖培养牙髓干细胞 24 h后，各组细胞均向划痕中央迁移，但各脂多糖刺激组细胞的迁移速度都高于空白对照组；培养48 h后，迁移速度的差异进一步增大，高质量浓度脂多糖组的划痕可以被牙髓干细胞覆盖，而空白对照组划痕依然清晰。细胞的迁移速度与脂多糖质量浓度呈正相关，见图2。

2.2.2 Transwell实验结果各质量浓度脂多糖刺激牙髓干细胞24 h，细胞迁移的数量均高于空白对照组，并且随脂多糖质量浓度增高，迁移细胞数量增多，见图3。

2.3 牙髓干细胞的成牙本质向分化能力

2.3.1 茜素红染色结果牙髓干细胞矿化诱导21 d后，茜素红染色检测其矿化结节形成能力。空白对照组及脂多糖刺激组均可形成红褐色不规则矿化结节，但空白对照组所形成的矿化结节数量和面积明显大于脂多糖刺激组，见图4A，B。

2.3.2 RT-PCR检测成牙本质相关基因的表达变化牙髓干细胞矿化诱导21 d后，RT-PCR技术检测细胞成牙本质向分化相关基因的表达。与空白对照组比较，脂多糖组细胞OCN、BSP、ALP表达量显著下调，提示脂多糖刺激牙髓干细胞后成牙本质向分化能力受到抑制，见图4C。

参考文献

[1] MA D, GAO J, YUE J, et al. Changes in proliferation and osteogenic differentiation of stem cells from deep caries in vitro. J Endod. 2012;38(6):796-802.
[2] YANG G, JU Y, LIU S, et al. Lipopolysaccharide upregulates the proliferation, migration, and odontoblastic differentiation of NG2+ cells from human dental pulp in vitro. Cell Biol Int. 2019 Mar 7. doi: 10.1002/cbin.11127. [Epub ahead of print]
[3] HORST OV, TOMPKINS KA, COATS SR, et al. TGF-beta1 Inhibits TLR-mediated odontoblast responses to oral bacteria. J Dent Res. 2009;88(4):333-338.
[4] LIU Y, GAO Y, ZHAN X, et al. TLR4 activation by lipopolysaccharide and Streptococcus mutans induces differential regulation of proliferation and migration in human dental pulp stem cells. J Endod. 2014;40(9):1375-1381.
[5] 刘影,高杰,吴补领.改良组织块酶消化法原代培养人牙髓干细胞的研究[J].口腔疾病防治,2018,26(3):166-170.  
[6] GRONTHOS S, MANKANI M, BRAHIM J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(25):13625-13630.
[7] ARTHUR A, RYCHKOV G, SHI S, et al. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 2008;26(7):1787-1795.
[8] KIM JK, BAKER J, NOR JE, et al. mTor plays an important role in odontoblast differentiation. J Endod. 2011;37(8): 1081-1085.
[9] SUH JS, KIM KS, LEE JY, et al. A cell-permeable fusion protein for the mineralization of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2012;91(1):90-96.
[10] NAM S, WON JE, KIM CH, et al. Odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells stimulated by the calcium phosphate porous granules. J Tissue Eng. 2011;2011:812547.
[11] GRONTHOS S, BRAHIM J, LI W, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002;81(8):531-535.
[12] WANG CY, TANI-ISHII N, STASHENKO P. Bone-resorptive cytokine gene expression in periapical lesions in the rat. Oral Microbiol Immunol. 1997;12(2):65-71.
[13] ZHANG X, NING T, WANG H, et al. Stathmin regulates the proliferation and odontoblastic/osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells through Wnt/β-catenin signaling pathway. J Proteomics. 2019;202:103364.
[14] CHEN Y, GAO Y, TAO Y, et al. Identification of a Calcium-sensing Receptor in Human Dental Pulp Cells That Regulates Mineral Trioxide Aggregate-induced Mineralization. J Endod.2019;45(7):907-916.
[15] JIANG HW, ZHANG W, REN BP, et al. Expression of toll like receptor 4 in normal human odontoblasts and dental pulp tissue. J Endod. 2006;32(8):747-751.
[16] MUTOH N, TANI-ISHII N, TSUKINOKI K, et al. Expression of toll-like receptor 2 and 4 in dental pulp. J Endod. 2007;33(10): 1183-1186.
[17] ZHANG J, WU L, QU JM. Inhibited proliferation of human lung fibroblasts by LPS is through IL-6 and IL-8 release. Cytokine. 2011;54(3):289-295.
[18] SARRAZY V, VEDRENNE N, BILLET F, et al. TLR4 signal transduction pathways neutralize the effect of Fas signals on glioblastoma cell proliferation and migration. Cancer Lett. 2011;311(2):195-202.
[19] WANG YY, SUN SP, ZHU HS, et al. GABA regulates the proliferation and apoptosis of MAC-T cells through the LPS-induced TLR4 signaling pathway. Res Vet Sci. 2018; 118:395-402.
[20] YU L, ZHAO Y, GU X, et al. Dual effect of LPS on murine myeloid leukemia cells: Pro-proliferation and anti-proliferation. Exp Cell Res. 2016;344(2):210-218.
[21] PARK YD, KIM YS, JUNG YM, et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide regulates interleukin (IL)-17 and IL-23 expression via SIRT1 modulation in human periodontal ligament cells. Cytokine. 2012;60(1):284-293.
[22] LI K, LV G, PAN L. Sirt1 alleviates LPS induced inflammation of periodontal ligament fibroblasts via downregulation of TLR4. Int J Biol Macromol. 2018;119:249-254.
[23] BOTERO TM, SHELBURNE CE, HOLLAND GR, et al. TLR4 mediates LPS-induced VEGF expression in odontoblasts. J Endod. 2006;32(10):951-955.
[24] NAKAO J, FUJII Y, KUSUYAMA J, et al. Low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) inhibits LPS-induced inflammatory responses of osteoblasts through TLR4-MyD88 dissociation. Bone. 2014;58:17-25.
[25] 刘影,高杰,吴补领.脂多糖与变形链球菌刺激DPSCs中Toll样受体4的表达[J].中国组织工程研究,2018,22(33):5333-5337.
[26] COIL J, TAM E, WATERFIELD JD. Proinflammatory cytokine profiles in pulp fibroblasts stimulated with lipopolysaccharide and methyl mercaptan. J Endod. 2004;30(2):88-91.  
[27] NAGAOKA S, TOKUDA M, SAKUTA T, et al. Interleukin-8 gene expression by human dental pulp fibroblast in cultures stimulated with Prevotella intermedia lipopolysaccharide. J Endod.1996;22(1):9-12.
[28] TOKUDA M, SAKUTA T, FUSHUKU A, et al. Regulation of interleukin-6 expression in human dental pulp cell cultures stimulated with Prevotella intermedia lipopolysaccharide. J Endod. 2001;27(4):273-277.
[29] ADACHI T, NAKANISHI T, YUMOTO H, et al. Caries-related bacteria and cytokines induce CXCL10 in dental pulp. J Dent Res. 2007;86(12):1217-1222.
[30] PARK SH, HSIAO GY, HUANG GT. Role of substance P and calcitonin gene-related peptide in the regulation of interleukin-8 and monocyte chemotactic protein-1 expression in human dental pulp. Int Endod J. 2004;37(3):185-192.
[31] SILVA AC, FARIA MR, FONTES A, et al. Interleukin-1 beta and interleukin-8 in healthy and inflamed dental pulps. J Appl Oral Sci. 2009;17(5):527-532.
[32] LIU J, XU D, WANG Q, et al. LPS induced miR-181a promotes pancreatic cancer cell migration via targeting PTEN and MAP2K4. Dig Dis Sci. 2014;59(7):1452-1460.
[33] CHEN HJ, LIANG TM, LEE IJ, et al. Scutellariae radix suppresses LPS-induced liver endothelial cell activation and inhibits hepatic stellate cell migration. J Ethnopharmacol. 2013;150(3):835-842.
[34] HORTELANO S, LÓPEZ-FONTAL R, TRAVÉS PG, et al. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 2010;86(2):283-292.
[35] LIU J, XU D, WANG Q, et al. LPS induced miR-181a promotes pancreatic cancer cell migration via targeting PTEN and MAP2K4. Dig Dis Sci. 2014;59(7):1452-1460.
[36] PETYAEV IM, ZIGANGIROVA NA, KOBETS NV, et al. Roquefort cheese proteins inhibit Chlamydia pneumoniae propagation and LPS-induced leukocyte migration. Scientific World Journal. 2013;2013:140591.
[37] WANG N, MENG X, LIU Y, et al. LPS promote Osteosarcoma invasion and migration through TLR4/HOTAIR.Gene. 2019; 680:1-8.
[38] LI D, FU L, ZHANG Y, et al. The effects of LPS on adhesion and migration of human dental pulp stem cells in vitro. J Dent. 2014;42(10):1327-1334.
[39] PARK JH, KWON SM, YOON HE, et al. Lipopolysaccharide promotes adhesion and migration of murine dental papilla-derived MDPC-23 cells via TLR4. Int J Mol Med. 2011; 27(2):277-281.
[40] 刘影,高杰,吴补领. TLR4 在人健康和深龋牙髓组织中的定位表达研究[J].口腔疾病防治,2017,25(3):153-158.
[41] MORSCZECK CO, DREES J, GOSAU M. Lipopolysaccharide from Escherichia coli but not from Porphyromonas gingivalis induce pro-inflammatory cytokines and alkaline phosphatase in dental follicle cells. Arch Oral Biol. 2012;57(12):1595-1601.
[42] GUO C, YUAN L, WANG JG, et al. Lipopolysaccharide (LPS) induces the apoptosis and inhibits osteoblast differentiation through JNK pathway in MC3T3-E1 cells. Inflammation. 2014; 37(2):621-631.
[43] PEI J, FAN L, NAN K, et al. Excessive Activation of TLR4/NF-κB Interactively Suppresses the Canonical Wnt/β-catenin Pathway and Induces SANFH in SD Rats. Sci Rep. 2017;7(1):11928.
[44] YU H, ZHANG X, SONG W, et al. Effects of 3-dimensional Bioprinting Alginate/Gelatin Hydrogel Scaffold Extract on Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J Endod. 2019;45(6):706-715.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2013年9月至2015年9月在南方医科大学南方医院临床医学实验研究中心完成。

1.3 材料脂多糖粉、 MTT粉剂、二甲基亚砜(Sigma)；DMEM、0.25%胰酶、胎牛血清、青链霉素(Gibco)；Transwell(Corning)；RT-PCR试剂盒(Takara)；SYBR Green PCR试剂盒(Takara)；生物安全柜(Biobase)；倒置相差显微镜(Olympus)；离心机(Heraus)；分光光度计(NanoDrop)；CO₂细胞培养箱(Shellab)；超低温冰箱(Forma Scientific)；微量可调加样器(Gilson)。

1.4 实验方法

1.4.1 牙髓干细胞的原代培养及鉴定标本取自健康成年人(16-28岁)由于阻生齿或正畸需要而拔除的牙齿，要求无龋坏，牙体完整，无牙周病(30颗)，由南方医科大学南方医院口腔颌面外科提供 (经患者本人及家属知情同意)。拔除前用碘伏消毒，拔除后于牙颈部釉牙骨质界处磨除 2 mm的牙体组织，呈环状凹槽状，立即放入含有1%双抗的预冷DMEM中储存，于1 h内进行原代培养。消毒后，在超净台内将牙齿从PBS中取出，依照文献所报道的方法^[5-6]，采用组织块酶消化法对牙髓干细胞进行培养及鉴定。待细胞游出后，细胞增殖至70%-80%汇合时，加入0.25%胰酶对原代细胞进行消化，按1∶2比例进行传代培养。第3-5代细胞进行后续实验。

1.4.2 牙髓干细胞增殖能力检测第3-5代牙髓干细胞接种于96孔板中(3×10³/孔)，每组重复6孔，经过12 h培养后细胞完全贴壁，培养液更换为含有0.1，1，10 mg/L脂多糖的DMEM完全培养基，空白对照组用普通DMEM完全培养基培养。脂多糖刺激1，3，5，7 d时，更换为含1%双抗及体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，200 μL/孔，加入MTT液20 μL/孔，CO₂培养箱内继续孵育4 h后弃培养液，加入二甲基亚砜150 μL/孔，振荡10 min，充分溶解结晶物。酶联免疫检测仪(NanoDrop)测定各孔光吸收值(490 nm波长)，完成3次独立重复实验。

1.4.3 牙髓干细胞迁移能力检测

(1)划痕实验：第3-5代牙髓干细胞接种于6孔板中，密度调整为1×10⁵/孔，每组重复3孔，培养48 h后细胞完全贴壁并且达90%汇合，在6孔板底划1 mm宽的划痕，标记观测点，确保各观测点划痕宽度一致。用含有0.1，1，10 mg/L脂多糖的无血清DMEM培养基2 mL替换原完全培养基，空白对照组用2 mL无血清DMEM培养基培养。脂多糖刺激0，24，48 h时，倒置显微镜下测量划痕宽度观察细胞迁移情况。

(2)Transwell实验：第3-5代牙髓干细胞接种于transwell(8 μm)小室，密度调整为2×10⁴/孔，上室加入无血清DMEM培养液200 μL；下室内分别加入含有0.1，1，10 mg/L脂多糖的DMEM完全培养液500 μL，空白对照组下室加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养液500 μL；CO₂培养箱内继续培养24 h后弃上、下室培养液，PBS清洗后甲醇固定、1%结晶紫染色、擦去上室内侧未迁移的细胞。用倒置显微镜观察transwell小室下壁，200倍视野下随机选取5个视野，拍照并读取细胞数。完成3次独立重复实验。

1.4.4 牙髓干细胞成牙本质向分化能力检测第3-5代牙髓干细胞接种于6孔板中，调整细胞密度为2×10⁵/孔，经过12 h培养后细胞完全贴壁，培养液更换为含有1 mg/L脂多糖的矿化诱导培养液(含50 g/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.01 mmol/L地塞米松、体积分数为10%胎牛血清的DMEM)，空白对照组用不含脂多糖的矿化诱导液培养细胞。

(1)茜素红染色：牙髓干细胞成牙本质向诱导21 d后，移除培养液，PBS清洗，40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，PBS清洗后加入1%茜素红染色剂染色20 min，去离子水冲洗3遍，将6孔板置于倒置显微镜下观察矿化结节的形成情况。完成3次独立重复实验。

(2)RT-PCR检测成牙本质相关基因的表达变化：牙髓干细胞成牙本质向诱导21 d后，移除培养液，收集细胞，Trizol抽提牙髓干细胞的总RNA，分光光度计检测RNA浓度，PrimeScriptR试剂盒将RNA反转录成cDNA，采用SYBR法进行PCR扩增，所有基因通过7500 RT-PCR仪进行检测，用相对定量法计算2^-^ΔΔCT值代表基因的相对表达强度。引物序列如下：β-actin上游： 5'-GCG CGG CTA CAG CTT CA-3'，下游：5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3'；ALP上游：5'-GGC TCA ATG GTT CAC CAC CTC-3'，下游：5'-CCA AGG ATT TCA ACA GTG GAT ACA A-3'；BSP上游：5'-CTG GCA CAG GGT ATA CAG GGT TAG -3'，下游：5'-GCC TCT GTG CTG TTG GTA CTG GT-3'；OCN上游：5'-GGC AGC GAG GTA GTG AAG A-3'，下游：5'-CCT GAA AGC CGA TGT GGT-3'。每组3个副孔，3次独立重复实验。

1.5 主要观察指标 ①脂多糖刺激后MTT检测牙髓干细胞增殖能力；②划痕实验及Transwell检测牙髓干细胞迁移能力；③茜素红染色及PCR检测牙髓干细胞成牙本质向分化能力。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0进行统计学分析，数据以x(_)±s表示。MTT实验采用析因设计的方差分析，Transwell和RT-PCR实验采用单因素方差分析，检验水准α=0.05， P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

2000年GRONTHOS等^[6]第一次发现了牙髓干细胞，它是存在于人牙髓组织的一种未分化间充质干细胞，具有高度的自我更新能力和多向分化能力。牙髓干细胞可以向神经元方向、骨及软骨方向、脂肪方向分化，已经得到广泛的共识^[7-13]。当牙齿发生深龋，牙髓不断遭受细菌的刺激，牙髓干细胞作为种子细胞迁移至受损伤的部位分化为成牙本质细胞，形成修复性牙本质以保护牙髓避免外界损伤^[14]。在龋病发展的早期，革兰阳性菌首先感染牙本质，随着龋病的进一步发展，当细菌感染到达牙髓牙本质交界处时，革兰阳性菌的数量逐渐减少，感染主要以革兰阴性菌为主^[3]。因此，在龋坏组织的深层，靠近髓腔的牙体组织中，革兰阴性菌是刺激牙髓组织的主要成分。脂多糖是革兰阴性菌细菌胞壁的重要组分，是细菌的主要毒力因子亦是牙髓炎症的重要刺激因素。有文献证实，脂多糖存在于深龋的牙髓组织中^[15-16]；然而，深龋状态下的细胞在细菌毒素的刺激下，是否会改变本身的生物学特性从而影响其在修复组织损伤中所发挥的作用还不明确。该实验用脂多糖刺激牙髓干细胞，以模拟龋坏状态下人牙髓干细胞的微环境，观察牙髓干细胞增殖、迁移、成牙本质向分化等生物学特性的变化。

强大的自我更新能力是干细胞的特性之一，通过绘制牙髓干细胞生长曲线的方式对细胞的增殖能力进行检测。作者发现，脂多糖刺激牙髓干细胞1 d后，空白对照组的吸光度值高于脂多糖组，通过7 d的连续培养，各质量浓度的脂多糖均可降低牙髓干细胞的增殖能力。在其他研究中也有相似结果，例如脂多糖可以抑制肺的纤维细胞和肿瘤细胞的增长^[17-18]，可以促进乳腺上皮细胞的凋亡从而减少其细胞增殖^[19]；甚至可以抑制白血病骨髓肿瘤细胞的增殖^[20]。最近的研究发现，脂多糖可以导致牙周膜细胞的增殖能力减低^[21]。脂多糖是Toll样受体4最主要的激动剂，可以激活体内无处不在的Toll样受体4^[22-24]。Toll样受体4是人体最主要的免疫受体，可以识别外界细菌的攻击，启动免疫反应保护机体。课题组的前期研究结果表明脂多糖可以有效激活牙髓干细胞中的Toll样受体4^[4^，^25]。脂多糖激活Toll样受体4介导的机体炎症反应体系，可以促进白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α和白细胞介素8等一系列细胞炎症因子的释放^[26-30]，这些细胞因子可以负向调节细胞的增殖能力。目前已经发现，白细胞介素6和白细胞介素8可以抑制肺纤维细胞的增殖^[17]，牙髓成纤维细胞增殖能力可以被白细胞介素1β抑制^[31]，而白细胞介素12和基质金属蛋白酶2可以加速肿瘤细胞的凋亡^[20]。脂多糖可以通过AKT/PI3K/MAPK/NF-κB通路介导牙周膜细胞释放白细胞介素17、白细胞介素23^[21]。这些报道均提示脂多糖抑制牙髓干细胞的增殖能力可能与Toll样受体4介导的炎症反应有关，具体的调控机制还需要进一步研究。

龋坏状态下牙体硬组织受损，细菌通过牙本质小管损伤牙髓组织，牙髓干细胞作为种子细胞迁移至受损处分化为所需细胞进行组织修复。划痕实验和Transwell实验研究结果均提示各质量浓度脂多糖可以促进牙髓干细胞的迁移。有文献报道，肿瘤细胞、肝细胞、胰腺细胞以及白细胞在受到脂多糖刺激后其迁移速度也有所提高，与该实验的结果一致^[32-36]。骨肉瘤细胞在脂多糖的刺激下其迁移和侵袭能力也显著提高^[37]。最近的实验研究显示，脂多糖通过NF-κB/MAPK信号通路促进细胞的黏附和迁移^[38]。有学者报道，脂多糖可以促进鼠成牙本质细胞迁移，但如果使用Toll样受体4抗体阻断Toll样受体4受体后，脂多糖促进细胞迁移的现象被逆转^[39]。

牙髓干细胞成牙本质向分化为成牙本质样细胞，分泌形成修复性牙本质是牙髓组织防御外来刺激的重要手段之一^[40]。实验结果显示，脂多糖与矿化诱导液联合培养牙髓干细胞21 d后，细胞所形成的矿化结节数量及相关基因的表达与空白对照组相比均降低，说明脂多糖可以导致牙髓干细胞成牙本质向分化能力降低。有文献报道，脂多糖可以抑制牙乳头干细胞成骨能力^[41]，并伴随Toll样受体4的激活及细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6和白细胞介素8大量释放。脂多糖亦可以抑制其他类型细胞的成骨能力，相似的结果在成骨细胞实验中也得到了证实^[42]。PEI等^[43]研究显示，成骨过程中加入脂多糖刺激后，细胞ALP/SP7/Runx2表达降低，而NF-κB通路相关蛋白表达显著增高；加入Toll样受体4中和抗体和NF-κB通路阻断剂后能够较大程度逆转成骨能力。这些报道均支持了该实验结果，脂多糖对多种细胞的骨向分化能力具有抑制作用。

牙髓干细胞作为牙髓组织的种子细胞^[44]，其增殖、迁移和成牙本质向分化能力的改变对牙髓组织的保护和修复再生至关重要。脂多糖可以抑制牙髓干细胞的增殖和成牙本质向分化能力，而对其迁移能力具有显著的促进作用。然而，脂多糖对牙髓干细胞生物学特性改变的调控机制特别是与Toll样受体4的关系还需要进一步研究，这对牙髓疾病的防治具有重要意义。

脂多糖改变牙髓干细胞的生物学特性

Biological characteristics of dental pulp stem cells induced by lipopolysaccharide

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[2]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[3]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[4]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[5]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[6]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[7]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[8]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[9]	李鑫平, 崔秋菊, 曾曙光, 冉高英, 张兆强, 刘显文, 方炜, 徐帅妹. β-磷酸三钙/壳聚糖水凝胶改性对牙髓干细胞生长与矿化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3493-3499.
[10]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[11]	戴雅玲, 陈乐文, 何肖君, 林华伟, 贾微微, 陈立典, 陶静, 柳维林. miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3024-3030.
[12]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.
[13]	王任先, 曹晶晶, 王宏刚, 万奔, 刘巍峰. 几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2500-2505.
[14]	袁宝红, 赵维山, 王若天, 管傲然, 王珏, 李汝红. 猪骨髓间充质干细胞抑制脂多糖诱导炎症反应改善猪胰岛细胞功能损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1969-1975.
[15]	姜涛, 吴硕, 李志强, 寿玺, 马依热·努尔买卖提, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1976-1981.