激素性股骨头缺血性坏死动物模型的建立及综合评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0399

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
激素性股骨头缺血性坏死：股骨头坏死又称股骨头无菌性坏死，或股骨头缺血性坏死，是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变，激素性股骨头坏死就是因为长时间使用激素而引起的一种股骨头坏死。
血液流变学：是一门新兴的生物力学及生物流变学分支，是研究血液宏观流动性质、人和动物体内血液流动和细胞变形以及血液与血管、心脏之间相互作用，血细胞流动性质及生物化学成分的一门科学，近20年来才发展成为一门独立的新兴边缘学科。

摘要
背景：建立简便可行、失败率低的激素性股骨头缺血性坏死动物模型，是研究激素性股骨头缺血性坏死的主要途径。
目的：建立激素性股骨头缺血性坏死动物模型，并进行病理学、影像学、骨/血清生化、血流变学评价。
方法：将20只大耳白兔随机分2组，实验组经耳缘静脉注射马血清10 mL/kg，14 d后再注射1次，再次注射14 d后，臀肌注射醋酸泼尼松龙8 mg/kg，1次/d，连续注射6 d，建立激素性股骨头缺血性坏死模型；对照组注射等量生理盐水。造模后8周，进行股骨头X射线、MRI检查；造模后10周，进行骨生化、血清生化、血液流变学及股骨头组织学观察。
结果与结论：①X射线：对照组骨皮质较厚，骨小梁清晰；实验组关节间隙变窄，骨皮质显著变薄，骨密度明显降低，骨小梁重度紊乱；②MRI检测：对照组未见股骨头坏死现象，实验组表现典型的双线征；③骨生化：实验组氨基己糖、钙/羟脯胺酸、氨基己糖/羟脯胺酸、钙含量低于对照组(P < 0.05)；④血清生化：实验组钙磷乘积、胆固醇、钙水平低于对照组(P < 0.05)，三酰甘油水平高于对照组(P < 0.05)；⑤血液流变学：实验组全血高切黏度及低切黏度、血浆黏度比及红细胞压积高于对照组(P < 0.05)；⑥组织学观察：实验组骨小梁中大部分骨细胞坏死，未坏死的骨细胞肿胀，细胞核严重变形、边聚，还有细胞核碎化、溶解、空鼓等现象，多核破骨细胞明显增多，造血干细胞明显减少；对照组未见上述现象；⑦结果表明，采用马血清联合大剂量和醋酸泼尼松龙可得到较理想的激素性兔股骨头缺血性坏死动物模型，X射线、MRI检查及骨/血清生化、血流变学评价可作为激素性股骨头缺血性坏死辅助诊断手段。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2134-7663(佟鹏)

关键词: 股骨头缺血性坏死, 血液流变学, MRI, 苏木精-伊红染色, 醋酸泼尼松龙, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Establishing a simple, feasible and high-efficient animal model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (SANFH) is the main method to study SANFH.
OBJECTIVE: To establish the animal models of SANFH, and to investigate the pathology, imaging, bone/serum biochemistry and hemorheology.
METHODS: Twenty rabbits were randomly divided into two groups. The rabbits were subjected to injection of 10 mL/kg horse serum via the ear vein twice, with 14 days in between; at 14 days after the final venous injection, the gluteal muscle was injected with 8 mg/kg prednisolone acetate, once daily for 6 consecutive days, so as to establish the model of SANFH (experimental group). The remaining rabbits were injected with the same volume of normal saline (control group). At 8 weeks after modeling, X-ray and MRI examinations of the femoral head were performed. At 10 weeks after modeling, the bone/serum biochemistry, hemorheology, and histological observation of the femoral head were conducted.
RESULTS AND CONCLUSION: X-ray: in the control group, the cortical bone was thick and the trabecular bone was clear. In the experimental group, the joint space became narrow, the cortical bone became thinner, the bone density decreased significantly, and the trabecular bone was severely in disorder. MRI examination showed that there was no necrotic femoral head in the control group, and the typical bilinear sign was observed in the experimental group. Bone biochemistry: the contents of hexosamine, calcium/hydroxyproline, hexose/hydroxyproline, and calcium in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). Serum biochemistry: the calcium-phosphorus product, cholesterol, and calcium levels in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05), and the triacylglycerol level was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Hemorheology: the whole blood hyperviscosity, low shear viscosity, plasma viscosity and hematocrit in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Histological observation: in the experimental group, there were numerous necrotic osteocytes in the trabecular bone, and the non-necrotic bone cells were swollen; the nucleus was severely deformed and edge-polymerized due to the compression, and the phenomenon of nuclear fragmentation, dissolution, and emptying were observed. The number of multinucleated osteoclasts was significantly increased, and hematopoietic stem cells were significantly reduced. While, the control group exhibited no such phenomena. These results indicate that an ideal animal model of SANFH can be established successfully by the combination of horse serum and high doses of prednisolone acetate, and X-ray examination, MRI qualitative analysis, bone/serum biochemistry as well as hemorheology are ancillary diagnostic tools for SANFH.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Femur Head Necrosis, Glucocorticoids, Hemorheology, Magnetic Resonance Imaging, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

佟鹏，王洋，梁瀛 . 激素性股骨头缺血性坏死动物模型的建立及综合评估[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(32): 5169-5174.

Tong Peng1, Wang Yang2, Liang Ying3. Establishment and comprehensive evaluation of animal models of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(32): 5169-5174.

图/表（结果） 1

2.1 造模情况实验组10只兔中8只造模成功，造模成功率为80%；实验采用的10 mL/kg马血清和8 mg/kg醋酸泼尼松龙建模成功率高达80%，说明该方法可有效建立激素性股骨头缺血性坏死动物模型。

2.2 组织病理学观察结果两组股骨头外观形态上并无明显差别，但与对照组相比，实验组股骨头仍保持圆形，但色灰暗，坏死明显，骨质松脆，易于凿开，软骨塌陷严重。

病理学光镜发现，对照组股骨头软骨层较厚、成骨活跃，骨小梁间充满骨髓造血组织和散在的脂肪细胞，骨小梁排列规则整齐，致密饱满，骨细胞核大居中，呈椭圆形，清晰可见，且分布均匀于骨陷窝内，部分骨陷窝呈空虚状态，髓腔内增生的骨髓组织呈活跃状态，造血细胞数量多，骨小梁边缘成骨细胞多见，软骨下血管丰富(图1A)；实验组骨坏死主要集中在股骨头靠近股骨颈的松质骨和软骨下区，表现为软骨层变薄、软骨下骨小梁结构紊乱、变细，排列稀疏松散，出现骨小梁断裂碎片，骨小梁中大部分骨细胞坏死，而未坏死的骨细胞肿大，细胞核发生变形、边聚，甚至固缩、溶解、碎裂，空缺骨陷窝计数高达30.7%，多核破骨细胞明显增多，造血干细胞明显减少，坏死骨小梁间隙纤维组织增生，包绕骨小梁，软骨下小血管明显减少(图1B)。

两组股骨头空骨陷窝率、骨小梁面积百分比差异有显著性意义(P=0.011，P=0.023)，见表1。

2.3 影像学观察结果

2.3.1 X射线扫描结果对照组骨皮质较厚，骨小梁清晰；实验组关节间隙变窄，骨皮质显著变薄，骨密度明显降低，骨小梁重度稀疏、紊乱，透亮区周围硬化带形成，见图2。

2.3.2 MRI结果对照组股骨头未发生坏死现象，股骨头在T1WI上为高信号，T2WI上表现为高偏等信号，呈正常均匀信号(图3A)；实验组双侧股骨头T1WI和T2WI表现为点状、细线状、片状中等信号强度和中等高信号强度，周围不均匀稍低信号环绕，呈典型的双线征，股骨颈可见斑点状的低信号病变，大部分出现关节腔积液(图3B)。

2.4 骨生化检测结果实验组氨基己糖较对照组显著降低，达36.84%，差异有显著性意义(P=0.026)；实验组羟脯胺酸较对照组稍有下降，但差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组骨Ca盐比对照组显著降低，达47.25%，差异有显著性意义(P=0.009)；实验组Ca/羟脯胺酸比值较对照组显著下降，达40.32%，差异有显著性意义(P=0.033)；实验组氨基己糖/羟脯胺酸比值较对照组显著下降，达31.58%，差异有显著性意义(P=0.014)，见表2。

2.5 血液生化检测结果

2.5.1 血清钙磷含量检测结果实验组血清钙水平、钙磷乘积显著低于对照组(P=0.039，P=0.018)，两组间血清磷水平相差不大，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

2.5.2 血清血脂检测结果两组胆固醇浓度及三酰甘油水平相差较大，差异有显著性意义(P=0.040，P=0.007)，见表4。

2.6 血液流变学检测结果实验组血样中全血高切黏度、全血低切黏度、血浆黏度比显著高于对照组(P=0.021，P=0.007，P=0.018)，见表5，说明采用激素建模后可以引起血液高黏滞状态。

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引言

骨坏死或缺血性坏死是骨科多发病，可发生于股骨头、腕舟骨、肱骨头、距骨、跖骨、胫骨、股骨髁等部位^[1]，其中以股骨头缺血性坏死最为常见，据统计在中国骨坏死或缺血性坏死的新发病患者15万-20万人，其中31-60周岁为好发群体，而因患者未经系统治疗或者治疗方法不当使病情恶化至股骨头塌陷或引发骨关节炎^[2]。酗酒、创伤、长期或短期大量使用激素是股骨头缺血性坏死的3大主要诱因。近年来因糖皮质激素的广泛应用，激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH)患病率不断上升，占非创伤性股骨头的51%，并呈现出患病人员年轻化的势头^[3-4]。大量研究表明激素性股骨头缺血性坏死与很多因素有关，但目前还并未明确其发病机制，也无一种能完全逆转病变进展的治疗手段^[5]。

人和动物对皮质激素的反应是一致的，建立一种简便可行、失败率低的激素性股骨头缺血性坏死动物模型，现已是研究激素性股骨头缺血性坏死的主要途径。现如今研究构建股骨头缺血性坏死动物模型的方法途径有很多，医学界惯用的方法如：单纯激素诱导、内毒素加激素诱导、同种异体血清加激素诱导等^[6]。马血清可致动物出现Ⅲ型变态反应，抗原抗体复合物沉积在血管壁上引起超敏性血管炎，此后应用糖皮质激素可抑制胶原和弹性纤维的合成，进而导致小动脉断裂或栓塞，骨髓腔内出血，最终致骨坏死。据组织病理学调查显示，在应用大剂量激素前使用马血清会造成70%的兔股骨干骺端呈现坏死症状，而在单独用马血清或激素的组中没有发现骨坏死^[7]。

组织病理学是诊断股骨头缺血性坏死最可靠方法^[8]，股骨头缺血性坏死的主要影像学检查手段为X射线片，此外MRI对早期股骨头缺血性坏死具有很强的敏感性，还能精准地呈现病变部位及大体状态。越来越多的研究表明，骨/血清生化、血流变学评价也逐渐成为早期诊断股骨头缺血性坏死的重要手段^[9]。实验诱导兔激素性股骨头缺血性坏死模型的方法是，采用马血清和醋酸泼尼松龙联合应用的技术手段，而后通过实验数据综合评价出股骨头受激素的毒性作用和病情变化，为早期股骨头缺血性坏死的治疗提供坚实的理论依据。

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材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年12月至2017年7月在锦州医科大学附属第一医院中心实验室及动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：清洁级24周龄新西兰大耳白兔20只，雌雄各半，体质量2.5-3.0 kg，由锦州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2003-0007，术前12 h禁食，自由饮水。

实验主要试剂：马血清(Hyclone公司)；醋酸泼尼松龙 (25 g/L，美国辉瑞公司)；青霉素钠0.48 g(80×10⁴ U，石药集团中诺药业有限公司)；乌拉坦(Gibco公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(Sigma公司)；兔饲料（北京科澳协力饲料有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 建立激素性股骨头缺血性坏死模型将20只大耳白兔分笼喂养，放置在实验室中7 d适应性喂养，7 d后用抽签法将实验白兔随机分为实验组与对照组，每组10只。在每次实验前会将实验兔体质量进行精确测量。实验组经耳缘静脉注射马血清10 mL/kg，14 d后再注射1次，第2次注射14 d后，臀肌注射醋酸泼尼松龙8 mg/kg，1次/d，连续注射6 d，建立激素性股骨头缺血性坏死模型；对照组注射等剂量的生理盐水。喂养10周后处死取材。为预防感染，所有动物双侧臀肌交替注射青霉素钠，在建模期间对两组兔进行普通饲养，饮水方法采用悬吊法，此种方法可使实验白兔下肢直立进行饮水^[10]。

1.4.2 激素性股骨头缺血性坏死动物模型评价

影像学评价：①X射线检查：造模8周后，利用岛津SMX-1000型X-ray透视仪平扫两组兔，摄片条件为40 kV、200 mA，多角度、全方位观察股骨头内部及整体情况，由2位有经验的放射科医师独立阅片，达成一致意见后记录其影像学表现；②MRI检查：造模8周后，以5-7 mL/kg无菌注射8%水合氯醛进行静脉麻醉，麻醉深度至少不能进行角膜反射，以保证白兔能保持蛙位行MRI扫描，分别对两组兔进行MRI检查。MRI使用Marconi Eclipse核磁成像仪，头部正交线圈，常规冠状面T1WI(TR 500 ms，TE14 ms)采用SE序列，层厚3 mm，间距1 mm；横断面T2WI(TR 2 700 ms，TE 125 ms)采用FSE及PWDI序列；层厚3 mm，无间隔。扫描电流150 A、电压700 V、场强3.0 T。

骨生化检测：造模10周后，从两组兔心脏中分别取静脉血(EDTA抗凝)，采用改良Blumenkrantz法测定氨基己糖水平，采用改良Neuman-Lorgan法测定羟脯氨酸水平，采用Connecty法测定钙的含量。

血样血液流变学及血清生化检测：造模10周后，从两组兔心脏中抽出静脉血(EDTA抗凝)，采用普利生LBY-N6Compact全自动血液流变仪测定全血黏度(黏度为高切150 s^-1、低切10 s^-1)、血浆黏度比和红细胞压积，采用DimensionRL全自动生化仪测定血清总胆固醇、三酰甘油和血清钙、磷(空腹血)的水平。

组织病理学观察：使用20%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉处死两组兔，取双侧股骨头，剔除周围肌肉和软组织后，便可从感官上看出股骨头外形有着细微改变和关节软骨面变化，而后用刀将股骨头从冠状面劈开两半，放到体积分数10%中性甲醛中7 d，7 d后在5%硝酸溶液中浸泡3 d进行脱钙。使用针灸的针扎入股骨头中，可完全扎入视为脱钙完全。然后在用梯度乙醇脱水。经乙醇常规梯度脱水和常规石蜡包埋，把股骨头放到切片机上切出4 μm的连续切片，然后将切片后脱蜡，用苏木精-伊红进行常规染色，将切片用OLYMPUSBX61正置显微镜分析切片结构。利用高倍镜镜片分析每一切片，选择5个观察点统计出数量为50个骨细胞的空骨陷窝阳性数，进行空骨陷窝率计算。病理学把衡量激素性股骨头缺血性坏死的确诊技术参数标准是：在骨小梁中存在大量空骨陷窝的形成或者核固缩现象，存在着伴有周围骨髓细胞坏死的现象，而实验中具有这种表现至少1处坏死病症的实验动物可确诊为股骨头坏死。

1.5 主要观察指标两组股骨头X射线、MRI检查，以及骨生化、血清生化、血液流变学及股骨头组织学观察结果。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0对实验所得数据进行统计学分析，实验数据利用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

有关激素性股骨头缺血性坏死的学说很多，如脂肪栓塞学说、骨细胞脂肪变性学说等10多种学说，激素性股骨头坏死疾病的发病机制还在探索中，创建理想的动物模型是了解并治愈激素性股骨头坏死的重要途径之一^[11]。常见的动物模型有：鸡、犬、鸸鹋、兔、大鼠、羊等。曹良权等^[10]和沈龙祥等^[12]对健康成年新西兰兔腹腔注射甲基强的松龙，较成功地反映出股骨头坏死早期病理变化；还有研究对SD大鼠利用0.5%羧甲基纤维素钠将醋酸泼尼松配成2 g/L质量浓度灌胃，或是肌注醋酸强的松龙，对空骨陷窝率、钙盐沉积光密度、完整骨小梁相对值和骨小梁总面积进行了统计学处理；Xiao等^[13]、肖春生等^[14]对成年鸡肌注甲基氢化泼尼松、醋酸氢化泼尼松进行激素性股骨头缺血性坏死造模后，出现骨小梁变细明显，骨细胞数减少，核固缩集边逐渐严重，空缺骨陷窝不断增多，脂肪细胞增殖和新骨生成等典型骨坏死表现。

至今为止，尚未发现一种较为可用的激素性缺血性股骨头坏死动物类模型，动物中鸸鹋作为实验动物而言并不标准又来源有限，与人类基因相比差距太大，并不适合广泛应用。大鼠股骨头直径小，无法完全模拟出类似人类的股骨头坏死塌陷。兔比较经济、易于饲养，是最常用的激素性股骨头坏死模型^[15]。实验参考上述造模方法，采用马血清和醋酸泼尼松龙联合应用的技术手段诱导兔激素性股骨头缺血性坏死，剂量参考目前文献中最佳造模剂量。通过技术手段强迫实验白兔不间断立位，解决了兔在笼子中运动量少的难题，使兔股骨头的机械性运动量加大，使兔的股骨头应力和人类更为相像，此方法简便，成功率及存活率较高，病理学改变较明显，与其影像学表现关系紧密，为今后研究其发病机制提供了坚实的理论依据和可供广大学者参考的动物模型。尽管激素作为非创伤性骨坏死的一个明确危险因素已为众多学者所接受，但激素应用剂量、时间与激素性缺血性股骨头坏死产生的关系仍不确切，需要在激素应用剂量次数、应用方式、冲击或持续应用时间及动物个体对激素的耐受性上进一步探讨。

此次实验用新西兰大耳白兔制造激素性股骨头缺血性坏死动物模型，处死动物脱钙后进行苏木精-伊红染色，发现股骨头内病理学改变存在较为明显的特点，说明股骨头坏死的本质特征就是出现不同程度的骨小梁及骨髓组织坏死，股骨头坏死实际上是指股骨头内细胞的死亡。

分析骨坏死模型建立的成功与否，股骨头病理变化是重要依据，但除此之外，股骨头的生化检验及血液、血脂流变学等检验和分析也是其重要的辅助判断指标^[16]。此次实验造模后Ca、氨基己糖、Ca/羟脯胺酸、氨基己糖/羟脯胺酸等的水平及钙磷乘积均表现出下降明显，也反映出激素的使用会大量减少股骨头的钙、磷水平，骨质下降严重，骨的生成减少而骨吸收却明显增加，故会出现骨质疏松现象。专家指出激素性股骨头缺血性坏死的重要因素是股骨头内的骨细胞脂肪化，因此控制血脂增高可预防激素性股骨头缺血性坏死，而患者的血液较为黏，高脂血症患者和血液高黏滞性高的人群是股骨头内微循环障碍、缺氧而坏死的高发人群^[17]。实验中，实验组和对照组胆固醇和三酰甘油水平之间具有较大差异，验证了激素冲击会导致机体免疫功能紊乱、脂质代谢紊乱、血液高凝，导致高脂血症、血栓、脂肪栓塞等，与病理学光镜下观察的骨髓腔内的脂肪颗粒变化早于其他改变相符，可推测股骨头坏死的早期必先发生脂质代谢变化；激素可显著降低网状内皮细胞的纤维蛋白溶解活性，使血浆处于低纤溶状态及高凝血^[18]，研究中实验组全血黏度值、血浆黏度比值及红细胞压积都比对照组高出很多，血液高黏滞状态明显，这也与以往研究证实的大剂量使用激素能导致血液明显异常，如全血黏度增高、血浆黏度值迅速增加的报道吻合。

骨坏死的影像学表现与其病理改变和病程密切相关。病变早期，骨髓中脂肪细胞死亡后需相当长的时间才能崩解，X射线仅能显示髋关节骨性改变和髋关节腔增宽，无法直接对关节软骨和关节腔积液作出评价，且早期股骨头坏死特点因为信息重叠严重，所以展现的并不完全，X射线平片只能展现修复期肉芽组织包绕进入骨坏死区，吸收清除坏死组织，坏死灶周围的组织出现充血水肿，新生骨形成，出现骨质疏松、夹杂硬化带的现象^[19]，这也与此次实验结果相吻合。早期股骨头坏死的特点可由X射线相互重叠观察出来，而中晚期的表现状态是平片上出现缺血坏死形态；MRI具有较高的软组织辨别力及全方位多参数等优点，除可展现出解剖形态改变外，还可观察髋关节细微结构和显示水肿，反映骨髓细胞的变化^[20]，并且MRI在出现骨髓水肿(0期)时即可发现病变。此次实验造模后观察T1WI和T2WI，分别表现为点状、细线状、片状中等信号强度和中等高信号强度，周围不均匀稍低信号环绕，呈典型的双线征，股骨颈可见斑点状的低信号病变范围大，部分出现关节腔积液，证明MRI检查是可当做鉴定早期激素性股骨头缺血性坏死动物模型的优选技术手段之一。

综上，使用激素超过一定的量会有较大可能性引发血液高黏滞症状，使身体中静脉中的血液瘀滞，骨内压升高，导致股骨头微循环呈病态，还会引发脂肪代谢功能严重紊乱，骨细胞中的脂肪病变甚至坏死，也是引发高血脂症重要原因之一；对骨组织代谢会产生严重影响，使骨吸收加快，生成却严重下降，致使患者引发骨质疏松，以上所阐述的几种症状相互影响，使引发股骨头发生缺血性坏死主要原因，作者通过此次模型构建为今后能够治愈早期股骨头缺血性坏死提供了可靠实验平台。

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