局部应用降钙素基因相关肽对小鼠肩袖损伤后早期愈合的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0204

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (12): 1859-1865.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0204

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局部应用降钙素基因相关肽对小鼠肩袖损伤后早期愈合的影响

陈洋1，2，3，王占稳1，2，3，陈灿1，2，3，吕红斌1，2，3

1中南大学湘雅医院运动医学科中南大学运动医学研究中心，湖南省长沙市 410008；2器官损伤衰老与再生医学湖南省重点实验室，湖南省长沙市 410008；3中南大学湘雅医院-国际华人骨研学会运动医学联合研究中心，湖南省长沙市 410008

收稿日期:2018-03-09 出版日期:2018-04-28 发布日期:2018-04-28
通讯作者: 吕红斌，教授，主任医师，博士生及博士后导师，中南大学湘雅医院，湖南省长沙市 410008
作者简介:陈洋，男，1992年生，河南省信阳市人，汉族，中南大学湘雅医院在读硕士，主要从事骨腱界面损伤修复的研究。
基金资助:
国家自然科学基金重点项目(81730068)；国家自然科学基金面上项目(81472072)；中南大学研究生科研创新项目(2016zzts532)

Local administration of calcitonin gene-related peptide promotes early healing after rotator cuff injury in mice

Chen Yang1, 2, 3, Wang Zhan-wen1, 2, 3, Chen Can1, 2, 3, Lv Hong-bin1, 2, 3

1Department of Sports Medicine and Research Center of Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; 2Key Laboratory of Organ Injury, Aging and Regenerative Medicine of Hunan Province, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; 3Xiangya Hospital of Central South University-International Chinese Musculoskeletal Research Society Collaborating Center for Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Received:2018-03-09 Online:2018-04-28 Published:2018-04-28
Contact: Lv Hong-bin, Professor, Chief physician, Doctoral supercisor, Postdoctoral supervisor, Department of Sports Medicine and Research Center of Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; 2Key Laboratory of Organ Injury, Aging and Regenerative Medicine of Hunan Province, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; 3Xiangya Hospital of Central South University-International Chinese Musculoskeletal Research Society Collaborating Center for Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
About author:Chen Yang, Master candidate, Department of Sports Medicine and Research Center of Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; Key Laboratory of Organ Injury, Aging and Regenerative Medicine of Hunan Province, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China; Xiangya Hospital of Central South University-International Chinese Musculoskeletal Research Society Collaborating Center for Sports Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81730068 and 81472072; the Postdoctoral Innovation Research Project of Central South University, No. 2016zzts532

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
降钙素基因相关肽：一种感觉神经递质，在炎症调节、干细胞募集分化及组织损伤修复中发挥着重要作用。
小鼠肩袖：小鼠的肩袖在解剖结构及组织学上与人十分相似，由起自肩胛骨体部的冈上肌，冈下肌，肩胛下肌及小圆肌组成了一个袖套样结构包绕肱骨头，为研究肩袖损伤提供了一个有力的动物平台。

摘要
背景：骨腱界面的损伤修复一直是骨科和运动医学领域里的一大难题，新生骨的形成有利于骨腱界面的愈合。降钙素基因相关肽在维持组织稳态和组织损伤后修复过程中发挥着非常重要的作用，但是其在骨腱界面损伤中的作用至今未见报道。
目的：建立小鼠肩袖损伤模型，观察降钙素基因相关肽对损伤处成骨因子骨钙素表达的影响，评估其对小鼠肩袖损伤后早期愈合的作用。
方法：建立小鼠冈上肌止点-肱骨损伤模型，随机分成2组：实验组术后当天经盂肱关节注入5 nmol/kg降钙素基因相关肽，每周3次，共2周；对照组注入等量的生理盐水。术后4，6周安乐死动物获取肩袖损伤标本，行苏木精-伊红染色观察其组织病理变化，实时荧光定量PCR检测骨钙素 mRNA的表达，免疫组织化学、免疫印迹实验观察骨钙素的蛋白表达水平，生物力学检测两组肩袖损伤标本的拉断载荷。
结果与结论：术后4，6周实验组成骨因子骨钙素的mRNA及蛋白表达水平均高于对照组(P < 0.05)；与对照组比较，实验组术后4周有更多的纤维软骨生成，术后6周有更多的新生骨生成；实验组术后4周的力学拉断载荷比对照组轻微上升，但没有统计学差异(P > 0.05)；术后6周，实验组的力学拉断载荷比对照组高(P < 0.05)。结果证实局部注射降钙素基因相关肽能提高损伤处骨钙素的表达及新生骨的形成，有利于肩袖损伤后早期愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4226-9545(陈洋)

Abstract:

BACKGROUND: Repair of tendon interface is a difficulty in orthopedics and sports medicine, and the formation of new bone is conducive to its healing. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) plays a critical role in tissue homeostasis and repair, but its effect on the bone-tendon interface repair is unknown.
OBJECTIVE: To investigate the effect of CGRP on the expression of osteocalcin and to evaluate the effect of CGRP on the early healing of rotator cuff injury in a mouse model.
METHODS: A mouse model of supraspinatus insertion-humerus injury was created. All model mice were then randomized into two groups, and given the injection of 5 nmol/kg CGRP (experimental group) or same volume of normal saline (control group) through the glenohumeral joint immediately after operation, thrice weekly, for 2 weeks. The mice were sacrificed at postoperative 4 and 6 weeks to remove the rotator cuff samples for hematoxylin-eosin staining and biomechanical test. The mRNA and protein expression levels of osteocalcin were surveyed by qRT-PCR, immunohistochemistry, and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: At postoperative 4 and 6 weeks, the mRNA and protein expression of osteocalcin in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Compared with the control group, there were more fibrocartilages in the experimental group at 4 weeks postoperatively, and more new bone formation in the experimental group at 6 weeks postoperatively. At 4 weeks postoperatively, failure load in the experimental group increased slightly, but it was not significantly different from that in the control group (P > 0.05); at 6 weeks postoperatively, failure load in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P <0.05). To conclude, local injection of CGRP can up-regulate the expression of osteocalcin and the formation of new bone at the injury site, which can enhance early healing the injured rotator cuff.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Shoulder Joint, Models, Animal, Calcitonin Gene-Related Peptide, Osteocalcin

中图分类号:

R318

陈洋，王占稳，陈灿，吕红斌. 局部应用降钙素基因相关肽对小鼠肩袖损伤后早期愈合的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1859-1865.

Chen Yang1, 2, 3, Wang Zhan-wen1, 2, 3, Chen Can1, 2, 3, Lv Hong-bin1, 2, 3. Local administration of calcitonin gene-related peptide promotes early healing after rotator cuff injury in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1859-1865.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 56只C57BL/6小鼠无明显异常行为及突然性意外死亡，全部进入结果分析。

2.2 qRT-PCR结果与同时间节点对照组相比，术后4，6周局部注射CGRP的实验组可明显提高骨钙素 mRNA的表达水平(P < 0.05)，见图3。

2.3 免疫组织化学检测结果与同时间节点对照组相比，术后4，6周局部注射CGRP的实验组在肩袖损伤区域可明显观察到棕黄色加深，骨钙素深染(P < 0.05)，见图4A；利用软件Image-Pro Plus检测区域面积的平均光密度进行半定量分析，结果显示：与镜下观察一致，实验组在4，6周骨钙素的平均光密度值明显高于同一时间节点的对照组(P < 0.05)，见图4B。

2.4 Western blot检测结果术后4，6周，局部注射CGRP的实验组骨钙素蛋白的表达水平高于同一时间节点的对照组(P < 0.05)，见图5A；并利用软件Image J软件分析灰度值，结果显示：与镜下观察一致，实验组在4，6周的骨钙素蛋白表达水平明显高于同一时间节点的对照组(P < 0.05)，见图5B。

2.5 组织学观察结果经组织学苏木精-伊红染色后，镜下观察纤维软骨及新生骨：与同一时间节点的对照组相比，术后4周时，实验组的肩袖损伤处有更多的纤维软骨生成，组织形态较好；术后8周时，实验组的肩袖损伤处有更多的新生骨生成，组织形态更好。见图6。

2.6 生物力学测试结果经生物力学检测标体愈合界面的力学特性后发现，术后4周，与对照组相比，实验组的拉断载荷轻微上升，但差异并无显著性意义(P > 0.05)；术后6周，实验组的拉断载荷明显高于同一时间节点的对照组 (P < 0.05)，见图7。

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引言

骨腱界面(bone-tendon interface，BTI)损伤是一类发生于骨与腱连接部位的损伤，包括肩袖损伤、交叉韧带损伤、跟腱损伤等^[1-4]。以常见的肩袖损伤为例，美国平均每年有约25万例肩袖损伤修复手术^[5]。而且，肩袖损伤术后再撕裂发生率居高不下，如单纯冈上肌损伤修复术后的再撕裂率约为25%，巨大肩袖损伤修复术后的再撕裂率高达75%^[6-7]。这些充分说明肩袖损伤具有极高的发病率，损伤后修复困难，其治疗和康复给家庭和社会带来了沉重的经济负担。

肩袖的损伤修复十分困难，主要是由于其独特且复杂的梯度结构(骨、钙化的纤维软骨、未钙化的纤维软骨及肌腱，见图1)，而且该部位血供差、再生能力弱^[8-9]。课题组以前的研究发现骨腱界面新生骨的质量可以预测骨腱界面的修复质量，随着新生骨的面积、长度和骨矿含量的增加，骨腱界面愈合质量也相应提升^[10]。因此，新生骨的形成是骨腱界面损伤修复的一个关键时期，促进骨再生是加速骨腱界面损伤后快速优质愈合的关键之一。而骨钙素(osteocalcin，OC)是一种受到广泛重视的骨形成标志物，可调节成骨代谢水平和骨矿化作用，与骨再生密切相关^[11]。

神经纤维支配对组织器官的损伤修复过程中扮演重要角色^[12-13]。以往的研究认为，外周神经系统仅仅起到将组织损伤的信号传递到高级神经中枢，但是新近研究表明，外周神经及其相关神经递质积极参与组织损伤修复过程，其中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)作为一种重要的神经递质在骨和肌腱损伤修复的过程中发挥着重要的调控作用^[14-18]。有文献报道，在胶原酶诱导大鼠髌腱损伤模型中证实CGRP表达水平和肌腱愈合质量密切有关^[19]；镁合金的髓内钉可通过刺激大鼠的脊髓背根神经节释放CGRP，加速股骨骨折的快速有效愈合^[20]；CGRP可刺激骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化，促进骨形成来改善大鼠卵巢切除后的骨质疏松^[21]。肩袖作为一种连接着肌腱与肱骨的特殊异质性结构，有关CGRP对肩袖损伤修复的评估尚未见文献报道。

因此，本实验通过建立小鼠肩袖冈上肌-肱骨损伤模型，术后局部注射CGRP，并用实时荧光定量PCR、免疫组织化学、免疫印迹实验，检测不同组别间损伤处的成骨因子骨钙素表达水平，观察损伤处的组织病理形态，检测损伤处的力学拉断载荷，评估小鼠肩袖损伤后早期愈合的质量，明确CGRP局部给药对于肩袖损伤修复的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年5月至2017年6月在中南大学动物学部及中南大学湘雅医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 10周龄雄性C57BL/6小鼠由中南大学实验动物学部提供，体质量18-20 g，根据Bell等^[22]建立的小鼠肩袖损伤模型方案，建立小鼠左前肢冈上肌止点-肱骨复合体肩袖损伤模型，术后给予丁丙诺啡镇痛治疗 (0.1 mg/kg，12 h/次，连续24 h，肌肉注射)。该方案经中南大学动物实验伦理委员会批准(批准号：2016-05-04)，实验动物均在戊巴比妥钠的麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

1.3.2 实验用主要试剂 GCRP(ab47101，Abcam，美国)，Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，反转录试剂盒(PrimeScript^TM，TaKaRa，日本)，荧光定量试剂盒(Tli RNaseH Plus，TaKaRa，日本)，骨钙素一抗(ab93876，Abcam，美国)，免疫组织化学试剂盒及DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、WB相关试剂(碧云天)，苏木精-伊红染色试剂盒(南京凯基生物)，小鼠显微手术器械一套(江苏荣耀医疗器械)。

1.3.3 实验用主要仪器缝合线(天津东南恒生医用有限公司)，Leica石蜡包埋机(MX-20，美国)，Leica石蜡切片机(RM2245，德国)，Leica烤片机(H1220，德国)，Leica 展片机(HI1210，德国)，NanoDrop分光光度计(ND-1000，美国)，引物设计(上海生工生物)，实时定量PCR仪(SYBR Green，ABI Prism 7200 Sequence Detection System)，骨钙素(ab93876，Abcam，美国)，全自动荧光化学发光仪(Odyssey，美国)，Olympus光学显微镜(CX31，日本)，拉伸仪器(MTS Insight 30美特斯工业系统有限公司，美国)等。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 C57BL/6小鼠随机分为2组，每组28只。实验组：局部注入CGRP，对照组：局部注入等量的生理盐水。

1.4.2 肩袖损伤建模及CGRP局部治疗两组C57BL/6小鼠均造模，用1%戊巴比妥钠(0.03 mL/g)腹腔麻醉满意，取右侧卧位，以左肩关节为中心，常规消毒、铺单，沿肘部后侧行纵行切口至耳下。钝性分离皮下组织，根据血管走行确定三角肌的边界，从三角肌后缘用组织剪剪开三角肌，然后沿血管走行再进行分离。可在肱骨头远侧用弯钳稳定肱骨。内收、外旋肱骨以分辨喙肩弓。钝性分离肱骨头和喙肩弓，暴露肩袖。用6-0带针PDS线通过冈上肌肌腱行“8”字缝合，用显微剪离断与肱骨头结合部。用解剖刀刮净离断处肱骨端残留纤维软骨层。PDS缝线自肱骨头后方至前方横向穿过。拉紧PDS缝线打结。复位三角肌，4-0可吸收缝线连续缝合皮肤(图2)。所有的步骤都严格要求无菌操作。

术后当天实验组小鼠经盂肱关节给予5 nmol/kg GCRP注射，对照组注射等剂量的生理盐水，每周2次，连续2周。

1.4.3 取材在肩袖损伤后愈合的早期，即术后4周及6周安乐死小鼠，以左肩为中心钝性分离皮下组织，在冈上窝处暴露冈上肌，沿着冈上肌的走行进行分离，并顺势离断肩峰，暴露肱骨头，从而获取小鼠左肩肩袖损伤标本，即冈上肌-冈上肌肌腱-肱骨复合体标本。

1.5 主要观察指标

1.5.1 实时荧光定量反转录-聚合酶链(qRT-PCR)检测骨钙素 mRNA表达取两组4，6周新鲜标本各3个，在显微镜下切取冈上肌-肱骨界面的损伤处(质量80 g)，边加液氮边研磨，至组织完全碾碎，加入Trizol试剂，按操作说明提取组织内mRNA。取出2 μL经核酸测定仪测定RNA纯度和浓度。随后用反转录试剂盒反录成cDNA，并用无酶水稀释。最后按照荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq^TM的说明书在实时定量PCR仪(Applied Biosystems)上检测各组之间的基因相对表达量。其中骨钙素的前引为CTG ACC TCA CAG ATC CCA AGC；后引为TGG TCT GAT AGC TCG TCA CAA G；管家基因GADPH的前引为AAC TTT GGC AT-T GTG GAA GG；后引为ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA。

1.5.2 免疫组织化学检测骨钙素水平两组各时间节点标本(n=3)经40 g/L多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙2周、梯度乙醇脱水后，在石蜡切片机上常规制作5 μm厚石蜡切片，脱蜡、水化组织，根据所应用的骨钙素一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理，应用柠檬酸盐等抗原修复液进行抗原修复，体积分数3%的H₂O₂去离子水阻断内源性过氧化物酶，加入一抗过夜孵育，按照一抗的来源分别滴加相应的二抗检测试剂孵育，应用DAB溶液显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封固，显微镜下观察CGRP的分布情况，并用Image-Pro Plus软件(Version 7.0, Media Cybernetics, Inc., 美国)进行半定量。

1.5.3 Western blot检测骨钙素蛋白表达各时间节点每组标本取3个，研磨裂解组织后，提取总蛋白质，BCA蛋白定量试剂盒定量后，取等量蛋白，采用SDS-PAGE进行分离，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，常温5%脱脂牛奶封闭1 h后加入一抗(骨钙素，β-actin 1∶1 000)，4 ℃冰箱一抗孵育过夜，TBST缓冲液洗涤3×5 min，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)室温避光孵育2 h，TBST缓冲液洗涤 3×5 min。Odyssey (Version 3.0, Licor, Inc., 美国) 红外激光成像，Image J (Version 1.48，美国国立卫生研究院)软件分析灰度值。

1.5.4 组织学观察标本经石蜡切片后，一部分用于免疫组织化学检测，另一部分可用于组织学检测。经苏木精-伊红染色，置于光学显微镜下进行组织学观察采图。

1.5.5 生物力学测试取4，6周两组小鼠冈上肌-冈上肌肌腱-肱骨复合体标本(n=6)，将肱骨远端用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)包埋，再固定于一个特制的包括上下两个夹头的张力测定夹具上，分别夹住冈上肌远端和肱骨PMMA包埋处，先在0.05 N的预负荷下放置1 miin，然后以0.03 mm/s拉速牵拉冈上肌-冈上肌肌腱-肱骨复合体，直至拉断。在拉伸仪器上根据拉伸应变曲线记录标本的拉断载荷负荷。
1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件包进行数据统计学处理。量化描述参数计量资料以x(_)±s表示；不同组别间骨钙素的表达量及拉断载荷用以非配对的Student’s t检验，双侧P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

肩袖损伤修复一直是运动医学和骨科领域的难题，亟需构建一种动物模型进行科学研究^[23]。而小鼠的肩袖在解剖结构及组织学上与人十分相似，由起自肩胛骨体部的冈上肌，冈下肌，肩胛下肌及小圆肌组成了一个袖套样结构包绕肱骨头^[22^，^24]，为研究肩袖损伤提供了一个有力的动物平台。

肩袖是一个连接硬组织骨和软组织肌腱的复杂过渡区

域，临床上肩袖损伤后愈合缓慢且术后再发率高^[8]，这主要是由于过渡区是一个复杂的梯度结构且缺乏血管提供营养物质和再生相关细胞。而紧邻着过渡区的软骨下骨区内富含血管、细胞及相关因子，在肩袖的损伤修复进程及营养代谢方面发挥着十分重要的作用^[9^，^25-27]。作者以前的研究也表明过渡区的愈合质量与损伤处新生软骨下骨的面积、长度和骨矿含量密切相关^[10]。而骨钙素是广泛应用的成骨因子，与骨的形成及骨量的维持密切相关，能促进钙盐沉积，有利于骨内矿物质的钙化积淀，与骨质量成正相关，促进骨的形成及骨重建^[28-29]。

对于组织损伤修复这样一个复杂的过程，神经系统及其相关神经递质在这一过程中发挥着十分重要的作用，并且受到了越来越多的研究者重视。在肌骨系统中，骨骼作为人体重要的负重器官，其内部有丰富的神经纤维分布，完整的神经支配对骨发育和代谢起着重要的调控作用，去神经支配后愈合明显延迟，甚至无法愈合。近年来研究表明，机体内存在着3条神经信号通路，其中感觉神经信号通路的代表性神经递质是CGRP，在骨和肌腱损伤修复的过程中发挥着重要的调控作用，并与免疫炎症应答有着十分密切的联系^[14-15^，¹⁹^，^30]。Zhang等^[20]学者研究表明镁合金的髓内钉在降解过程中，能刺激脊髓背根神经节释放感觉神经递质CGRP，通过CGRP受体编码基因Calcrl或Ramp1，调控膜周干细胞向成骨方向分化，有利于新生骨的形成，从而促进大鼠股骨骨折的愈合。Hong等^[31]研究表明，在小鼠眼球碱烧伤动物模型中，感觉神经递质能够动员并激活全身CD29+基质细胞，并有效促进基质细胞增殖、分化，有效促进伤口的愈合；也能激活骨髓间充质干细胞周围的蛋白激酶Erk1/2及核内基因β-catenin的表达，促进其增殖。CGRP作为代表性的感觉神经递质，具有多种功能及生物活性，广泛分布于中枢和周围神经，参与组织的损伤修复^[32-34]。因此当前实验利用外源性CGRP局部给药，检测损伤处成骨因子骨钙素的mRNA及蛋白表达情况，明确外源性给予CGRP能否增加损伤处骨钙素的表达水平，进而调节骨形成和骨吸收的平衡，更好地促进小鼠肩袖损伤后的早期愈合。

骨腱界面损伤后修复经历着与骨折愈合和肌腱损伤修复相似的4个典型过程，包括起始的炎症反应期，新生骨形成与纤维软骨样结构的再生期，编织骨重塑与再生纤维软骨层成熟期和最终的重塑期^[35]。在骨腱界面损伤修复早期，局部的炎症反应占据着重要的地位，影响着损伤修复的进程，而CGRP能够抑制炎症反应，在调节免疫微环境中发挥着重要作用^[33-34]。因此，本次实验选择在术后炎症反应期，每周3次，连续2周局部注射CGRP因子，以组织学、分子生物学及生物力学为评估指标，探讨CGRP对肩袖损伤愈合的影响，从而明确外源性注入CGRP对肩袖损伤的作用。

本次实验采用的是经盂肱关节注入5 nmol/kg CGRP，每周3次，连续2周，结果显示能促进损伤处成骨因子骨钙素的表达，提高损伤处的生物力学，有利于肩袖损伤后的早期愈合。最近Kashem等^[36]研究发现白色念珠菌感染入侵皮肤过程中，能刺激TRPV1+的感觉神经末梢释放CGRP，促进CD301b ⁺免疫细胞(树突状细胞)产生IL-23，进而γδ+ T细胞产生IL-17A，增强小鼠的免疫力，抵抗皮肤念珠菌病。学者Tang等^[18]研究表明，在大鼠骨折的过程中，在大鼠腹腔内注射CGRP抑制剂后，通过下调磷酸化的ERK，抑制CGRP+F4/80+巨噬细胞的聚集，不利于骨折的愈合。所以在小鼠肩袖损伤愈合过程中，外源性给予CGRP对小鼠免疫微环境及巨噬细胞聚集/极化的影响，以及具体的信号途径，有待进一步探讨和研究。对于不同的给药方式、不同剂量的GGRP，不同的给药起止时间，仍需要我们进一步去研究探讨，确定最佳的CGRP干预方式。另外作者意识到本研究只是在损伤模型动物上进行检测，未检测正常对照组的骨钙素mRNA、蛋白表达、局部光密度改变等客观指标，没有正常的对照组数据，下一步需要继续探讨相关指标在正常结构下与病理修复之间的关系与改变。

综上所述，本实验发现局部给予GGRP治疗能促进与成骨作用密切相关的因子骨钙素的表达，从而更好地调节损伤处的骨形成与骨吸收，提升新生骨的质量，有利于肩袖损伤的早期愈合。因此，本实验具有广阔的应用前景和学术研究价值，能够为促进骨腱界面损伤后修复的生物学治疗提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

局部应用降钙素基因相关肽对小鼠肩袖损伤后早期愈合的影响

Local administration of calcitonin gene-related peptide promotes early healing after rotator cuff injury in mice

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