肩袖损伤后脂肪浸润基因表达谱及关键通路的生物信息学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3083

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (11): 1773-1778.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3083

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肩袖损伤后脂肪浸润基因表达谱及关键通路的生物信息学分析

刘沛东1，2，冯江峰1，2，徐文杰1，许晓栋1，杨自权1，2

山西医科大学第二医院，1运动医学科，2骨与软组织损伤修复省重点实验室，山西省太原市 030000

收稿日期:2020-04-11 修回日期:2020-04-20 接受日期:2020-05-19 出版日期:2021-04-18 发布日期:2020-12-22
通讯作者: 杨自权，博士，研究生导师，主任医师，山西医科大学第二医院，运动医学科，骨与软组织损伤修复省重点实验室，山西省太原市 030000
作者简介:刘沛东，1996年生，山西省运城市人，山西医科大学在读硕士，医师，主要从事骨关节与运动医学研究。

Bioinformatics analysis of gene expression profile and key pathways related to fatty infiltration after rotator cuff injury

Liu Peidong1, 2, Feng Jiangfeng1, 2, Xu Wenjie1, Xu Xiaodong1, Yang Ziquan1, 2

1Department of Sports Medicine, 2Shanxi Provincial Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Damage Repair, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

Received:2020-04-11 Revised:2020-04-20 Accepted:2020-05-19 Online:2021-04-18 Published:2020-12-22
Contact: Yang Ziquan, MD, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Sports Medicine, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; Shanxi Provincial Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Damage Repair, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
About author:Liu Peidong, Master candidate, Physician, Department of Sports Medicine, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; Shanxi Provincial Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Damage Repair, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肩袖损伤后脂肪浸润：是肩袖修补术后失败的关键因素之一，其与再撕裂率和功能预后密切相关。脂肪浸润多发生在肩袖撕裂后1年内，萎缩的肌肉组织被脂肪组织替代，并向邻近组织侵袭，影响肌肉及肌腱的质量及力学特性。
基因本体分析(Gene ontology，GO)：是通过对生物学的3个方面——细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)，将差异基因从功能、参与的生物途径及细胞中的定位进行了标准化描述，即对基因产物进行了简单注释。

背景：脂肪浸润是肩袖修补术后失败的关键因素，然而肩袖损伤后脂肪浸润的病理变化机制尚不清楚。
目的：旨在探索肩袖损伤后关键基因的表达差异，确定其功能和机制通路，为肩袖损伤脂肪浸润的病理变化机制提供理论依据。
方法：通过GEO数据库获取GSE93661芯片筛选差异表达基因，采用GO、KEGG分析脂肪浸润的潜在机制。通过构建PPI网络获取枢纽基因，分析潜在致病靶点。
结果与结论：共鉴定差异表达基因471个。GO和KEGG分析表明神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子通路是肩袖损伤脂肪浸润的潜在机制。白三烯B4受体(LTB4R)作为PPI网络中的枢纽基因，可能是肩袖损伤脂肪浸润的关键靶标。提示：文章发现了肩袖损伤后脂肪浸润病理发展中潜在的关键基因和通路，为今后的治疗提供了参考方向。
https://orcid.org/0000-0003-1261-6120(刘沛东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肩袖损伤, 脂肪浸润, 差异基因, 生信信息学, GEO数据库

Abstract: BACKGROUND: Fat infiltration is a key factor in the failure of rotator cuff repair. However, the pathological mechanism of fatty infiltration after rotator cuff injury is unclear.
OBJECTIVE: To explore the differences in the expression of key genes after rotator cuff injury, to determine their functions and mechanism pathways, and to provide a theoretical basis for the pathological mechanism of fatty infiltration after rotator cuff injury.
METHODS: GSE93661 was obtained through GEO database to screen differentially expressed genes. Gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis were used to analyze the underlying mechanism of fatty infiltration. The protein-protein interaction network was constructed to obtain the pivot genes and analyze the potential pathogenic targets.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 471 differentially expressed genes were identified. GO and KEGG analysis showed that neuroactive ligand-receptor interactions and cell adhesion molecular pathways were potential mechanisms of fat infiltration in rotator cuff tears. Leukotriene B4 receptor, as a pivot gene in the protein-protein interaction network, may be a key target for fat infiltration in rotator cuff tears. We have discovered potential key genes and pathways in the pathological development of fatty infiltration, providing a reference direction for future treatment.

Key words: rotator cuff tear">, fatty infiltration">, differential genes">, bioinformatics">, GEO database

中图分类号:

刘沛东, 冯江峰, 徐文杰, 许晓栋, 杨自权. 肩袖损伤后脂肪浸润基因表达谱及关键通路的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1773-1778.

Liu Peidong, Feng Jiangfeng, Xu Wenjie, Xu Xiaodong, Yang Ziquan . Bioinformatics analysis of gene expression profile and key pathways related to fatty infiltration after rotator cuff injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(11): 1773-1778.

图/表（结果） 8

2.1 差异表达基因的筛选以P < 0.05，|log2FC|>2为筛选条件对差异基因进行筛选。与肩袖完整组相比，肩袖损伤组共筛选出差异基因471个，其中上调基因189个，下调基因282个。差异结果采用热图及火山图进行可视化表达(见图1)。表1列举了差异表达的前10位上下调基因。

2.2 差异基因功能分析 GO分析是通过对生物学的3个方面——细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)，将差异基因从功能、参与的生物途径及细胞中的定位进行了标准化描述，即对基因产物进行了简单注释。根据GO分析提示(图2)，在细胞组分中：细胞过程(cellular process)、单一生物过程(single-organism process)、代谢过程(metabolic process)以及对刺激的反应(response to stimulus)等方面显著富集；在分子功能中：黏附结合(binding)、催化活性(catalytic activity)、信号传导活动(signal transducer activity)、转运蛋白活动(transporter activity)显著富集；在生物过程中，细胞成分(cell part)、细胞器(organelle)、细胞膜富集。

京都基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库[19]，专门存储不同物种中基因通路的信息，通过比对目的基因可快速定位有显著改变的信号通路。通过KEGG分析发现(图3)，差异基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子(CAMs)、IgA肠道免疫网络、氮代谢、Th1和Th2细胞分化等通路上。详情可参见表2。

2.3 PPI网络构建及hub-gene获取基于STRING数据库中的信息，将差异基因进行PPI网络映射，并将节点信息导入至cytoscape软件进行hub-gene的获取及网络可视化(图4)。根据MCODE插件筛选出3个枢纽模块(MCODE得分≥5分)；其中GHSR、LTB4R、FFAR4、PMCH、EDNRB、CYSLTR1是MCODE评分最高的枢纽基因。
2.4 基于GTEx和TCGA数据集筛选各组织中LTB4R基因含量白三烯B4受体(leukotriene B4 receptor，LTB4R)作为一种与炎症反应有关的白三烯类受体，可介导毛细血管壁水肿、渗出和趋化反应等病理反应。近来有研究显示，LTB4R参与了脂肪细胞的成熟分化过程，LTB4-BLT信号通路可能正调控脂肪细胞的分化，并成为控制脂肪细胞分化的限速环节。这一现象暗示了LTB4R可能是肩袖损伤后脂肪浸润的关键靶标。

因此本文通过TCGAportal(http://tumorsurvival.org/)、GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)在线工具分析枢纽基因LTB4R在人体各组织中的含量，并制作箱图及人体分布图[20]。分析结果提示：在TCGA数据库中，LTB4R基因在急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)及胸腺癌(thymoma，THYM)中高表达，而其在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UVM)、高危肾母细胞瘤(high-risk wilms tumor，WT)、肾嫌色细胞癌(kidney chromophobe，KICH)含量处于偏低水平；在GTEx正常组织样本库中，结果表明血液、食管、皮肤中LTB4R含量较高(详见图5)。

2.5 外部数据集交叉验证差异基因表达以相同的筛选标准(P < 0.05，|log2FC|>2)对差异基因进行筛选。GSE103266共筛选差异基因472个，GSE130447中差异基因509个。其中发现共同差异基因LTB4R、MMP9、BMP5等，这与上述结果基本一致。见图6。

参考文献

引言

肩袖损伤是临床中常见的肩部损伤之一，是以肩关节疼痛和功能障碍为主要特征的疾病，严重时可伴有肌肉萎缩症状[1]。肩袖损伤发病率为22.1%-47.3%，在一般人群中随着年龄的增长患病率显著增加[2]。然而对于肩袖损伤，特别是巨大肩袖损伤，其临床预后往往较差。据报道，关节镜下修复巨大肩袖损伤的失败率达23%-77%[3]，特别是撕裂大小超过5 cm或损伤涉及2个及2个以上的肩袖组织[4-5]。裂口大小、肌腱质量、肌肉萎缩和脂肪浸润被认为是失败的因素，可导致较高的不愈合率及再撕裂率[6]。其中，脂肪浸润是肩袖修补术后失败的关键因素之一[7]，其与再撕裂率和功能预后密切相关。脂肪浸润多发生在肩袖撕裂后1年内，萎缩的肌肉组织被脂肪组织替代，并向邻近组织侵袭，影响肌肉及肌腱的质量及力学特性。有研究报道，脂肪浸润是唯一且独立的影响因素[8]。当冈下肌脂肪浸润达Goutallier评分 2 级或以上时，肩袖修复术后再撕裂率可达70%以上，并且脂肪浸润在肩袖修复术后有显著进展，再撕裂者比愈合者进展更加明显[9]。
尽管，在促进肩袖愈合的临床领域已开展了大量的研究和报道，各种手术技术及器械的改进已取得巨大进步[5，10-11]，但是肩袖损伤，特别是巨大肩袖撕裂绝不可“一缝了之”，还应关注肩袖损伤后的病理变化及生物学环境的改变[12-13]。然而到目前为止，肩袖损伤后的病理变化机制尚未明晰，参与脂肪浸润的关键基因和途径尚不清楚。此次研究旨在探索肩袖损伤后关键基因的表达差异，确定其功能和机制通路，为肩袖损伤脂肪浸润的变化机制提供理论依据及基础指导。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计基因学实验。
1.2 时间及地点于2019年12月至2020年2月在山西医科大学第二医院运动医学科、山西医科大学第二医院骨与软组织损伤修复重点实验室完成。
1.3 资料来源从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中搜索所有肩袖损伤相关的基因芯片数据，下载符合实验要求的数据集GSE93661。数据集包含4个样本，包括2个全层撕裂患者的冈上肌样本和2个完整的肩胛下肌样本。
1.4 差异基因表达分析使用limma包对GSE93661芯片中样本数据进行差异比较，筛选条件为P < 0.05，|log2FC|>2。差异结果用热图及火山图进行可视化呈现。
1.5 差异基因功能分析 clusterProfiler包对差异基因进行ID转换[14]，由omicshare网站(https://www.omicshare.com)对差异基因进行基因本体分析(Gene ontology，GO)及KEGG分析[15]。采用clusterProfiler包对差异基因进行GSEA分析。
1.6 PPI网络构建及hub-gene获取将差异基因输入到STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)数据库以进行蛋白质相互作用分析(Pro-tein-Protein Interaction，PPI)，并采用Cytoscape 软件绘制PPI网络图[16]。通过MCODE对已获得的PPI网络筛选枢纽基因(hub-gene，HG)进行深入分析。
1.7 基于GTEx和TCGA数据集筛选各组织中hub-gene基因含量美国癌症基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas Program，TCGA)数据库收录了20 000例患者，33个癌症的数据[17]。基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression，GTEx)数据库，研究从来自449名生前健康的人类捐赠者的7 000多份尸检样本，涵盖44个组织(42个不同的组织类型)和细胞系[18]，利用该数据库可快速定位研究基因在不同组织和个体中有何差异表达。从多组织、多维度为疾病研究提供病因分析，并且可以作为相关研究起始时的良好补充参考。
1.8 外部数据集交叉验证差异基因表达从GEO数据库中下载肩袖损伤相关芯片GSE103266和GSE130447。GSE103266检测了冈上肌全层切断后4周的大鼠与未做切除的对照组大鼠肩袖组织的基因表达。GSE130447为大鼠冈上肌全层切断后0，10，30及60 d后的基因表达。通过韦恩图取交集，交叉验证肩袖损伤后脂肪浸润的共同基因。

讨论

肩袖损伤不是一种单纯的机械外力现象，它还涉及潜在的生化和生物分子变化，是关节退化的一种驱动表现[21-22]。越来越多的证据表明，细胞外基质(ECM)、血管和细胞内信号相关的基因通路和生物标志物的表达在肩袖撕裂和与肩袖肌腱组成相关的肌腱疾病中发挥着重要的作用[23-25]。在肩袖愈合的关键阶段：炎症期、成纤维期及重塑期亦有多种生物因素参与其中[26-27]。
通过对比分析完整肩袖组织与撕裂肩袖组织的基因表达，共鉴定出471个差异基因，其中上调基因189个，下调基因282个，这些基因可能是脂肪浸润病理生理过程中的潜在靶点。通过GO、KEGG富集分析对脂肪浸润的潜在生物学功能及通路进行注释，结果发现神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子是肩袖损伤后脂肪浸润可能的机制通路。PPI网络显示，LTB4R是蛋白互作网络中的枢纽基因。
细胞黏附分子是在细胞表面表达的糖蛋白。有研究显示，细胞黏附分子通路在动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症等疾病中发挥着重要的作用[28]。通过GTEx数据库检索发现，LTB4R在血液中高表达。作者猜想，LTB4R可能会响应炎症刺激，可能通过细胞黏附通路促进炎性细胞向损伤部位迁移，激发炎症级联反应[29]。在响应炎症刺激的过程中，有研究表明高表达LTB4R会促使脂肪细胞的成熟分化，具有正向调控作用。特定的LTB4R拮抗剂抑制小鼠3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化，并成为控制脂肪细胞分化的限速环节[30-31]。基质金属蛋白酶(MMP)家族被认为是肩袖撕裂的主要参与者，基质金属蛋白酶13在脂肪浸润中起着重要作用。LTB4R不仅本身可以脂肪细胞的分化，还可正向作用于基质金属蛋白酶13，通过MMP家族放大脂肪浸润的程度，从而进一步促进脂肪浸润级联程度。
肩袖损伤患者以夜间疼痛为特殊临床表现[32]，通过多普勒超声检查发现，肩袖损伤患者的旋肱前动脉血流量夜间较白昼明显增多[33]。在一项通过转录组测序鉴定与山羊和绵羊疼痛反应有关的关键基因和途径显示，神经活性配体-受体相互作用的通路在疼痛反应中处于激活状态[34]，其中LTB4R是显著表达的。通过5-LO抑制剂抑制LTB4R的合成后发现痛觉过敏可改善，这意味着由LTB4R介导的白三烯、5-LO通路是疼痛的重要介质[35]。COX-2抑制剂塞来昔布具有镇痛、抗炎作用的同时，具有良好的胃肠道安全性，已广泛应用于临床骨关节炎和类风湿关节炎的镇痛治疗中。然而，在动脉粥样硬化模型小鼠的研究中，塞来昔布灌胃处理后的小鼠模型动脉粥样病变加重，血管内脂肪斑块显著增多，其机制与血脂无关，而可能与LTB4R上调有关[36]。这也为日后肩袖损伤患者的止痛药物选择引入新的思考。
此次研究纳入样本数量较小，可能会存在一定的偏差；肩袖撕裂样本中脂肪浸润的阶段尚不清楚；在今后的研究中需进一步的实验验证。
结论：利用生物信息学分析肩袖损伤芯片GSE93661，共鉴定差异表达基因471个。GO和KEGG分析表明，神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子通路是肩袖损伤脂肪浸润的潜在机制。LTB4R作为PPI网络中的枢纽基因，可能是肩袖损伤脂肪浸润的关键靶标。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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