2.1  差异基因分析结果  数据预处理后，总共有2 513个基因被确定为差异表达基因。这些差异基因为多分组间差异基因，结果显示在聚类图上，见图1。

根据d Score降序排序，挑选出差异最显著的前10个基因是：Wnt16、Obfc1、Ufd1l、LOC100361067、Hhatl、Fxyd1、Psmc4、Tasp1、Mettl21c、Ufd1l，见表1。

2.2  GO分析结果  通过综合分析列出前10位的生物学过程，包括：biological_process，G蛋白偶联受体信号通路(G-protein coupled receptor signaling pathway)，对药物的反应(response to drug)，DNA依赖性转录(transcription DNA-dependent)，DNA依赖性转录的正调节(positive regulation of transcription DNA-dependent)，氧化还原过程(oxidation-reduction process)，泛素依赖性蛋白分解代谢过程(ubiquitin-dependent protein catabolic process)，凋亡过程(apoptotic process)，RNA聚合酶转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymeras)，脂肪酸β-氧化(fatty acid beta-oxidation)。见表2。

2.3  通路分析结果  作者分析出85条差异调控的通路。其中，差异最显著的10个通路分别是MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、细胞凋亡(Apoptosis)、柠檬酸循环(Citrate cycle)、癌症通路(Pathways in cancer)、细胞周期(Cell cycle)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、泛素介导的蛋白水解(Ubiquitin mediated proteolysis)。见表3。

随着社会的发展、基础设施和交通系统的发展导致脊髓损伤的发病率增加。脊髓损伤患者常导致感觉和运动功能障碍。在现代社会中，脊髓损伤患者存活的时间延长，这给家庭和社会带来了沉重的经济负担。脊髓损伤会导致继发性的肌肉萎缩，脊髓损伤后肌肉质量的减少已得到充分的证实，脊髓的完全损伤会导致20%-55%的肌肉萎缩，脊髓的不完全损伤会在伤后6个月至1年内导致20%-30%的肌肉萎缩^[1]。肌肉萎缩不仅会影响脊髓损伤患者的护理和生活方式，还会导致一些严重的并发症，例如骨质疏松、糖尿病、心血管疾病等^[2]。肌肉质量的维持对于脊髓损伤患者至关重要，并且对于通过康复锻炼获得最大化的肌肉功能也是必要的^[3]。

肌肉萎缩取决于蛋白质分解、蛋白质合成速率和细胞凋亡三者之间的平衡。动物模型的研究表明，蛋白质泛素化和能量产生相关途径的改变是萎缩过程的共同特征。生长因子如胰岛素样生长因子(IGFs)，肌源性调节因子(MRFs)，转化生长因子(TGFs)和骨形成蛋白(BMPs)的激活在肌肉萎缩和肥大中起重要作用^[4]。失神经骨骼肌萎缩过程中凋亡是一个重要参与者^[5]。有研究表明线粒体凋亡信号调节途径在失神经骨骼肌萎缩中发挥了重要作用。在失神经实验动物和罹患神经肌肉功能障碍疾病患者的骨骼肌样本中，均发现线粒体凋亡信号增强^[6]。线粒体内含有许多促凋亡蛋白，如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)、核酸内切酶G(EndoG)、Smac/DIABIO蛋白和Omi/HtrA2蛋白，这些物质释放进入细胞质后会造成细胞凋亡。骨骼肌线粒体密度和电子传递链活动对脊髓损伤后肌肉萎缩、肌纤维类型从氧化到快速糖酵解的转化，以及肌内脂肪组织的渗透起重要作用。此外，死亡受体凋亡信号调节途径、内质网凋亡信号调节途径、caspase家族蛋白均对骨骼肌萎缩起到重要的作用^[7-8]。然而，脊髓损伤后肌肉萎缩的具体分子生物学机制及相关的关键基因和通路不十分清楚。

在此次研究中，作者下载了GSE45550的基因谱数据，然后通过对数据行多分组间的生物信息学分析得出相关的基因和通路，这些基因和通路可能在脊髓损伤后肌肉萎缩的发生中起重要作用。 

1.1  设计  基因学实验。

1.2  时间及地点  于2018年1月至2019年1月在海南省人民医院中心实验室完成。

1.3  材料  在美国国立生物信息中心NCBI数据库GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索关键词“脊髓损伤and肌肉萎缩”得到基因表达谱数据GSE45550。该数据包括对照组(脊髓损伤前)、实验组1(脊髓损伤后3 d)、实验组2(脊髓损伤后8 d)、实验组3(脊髓损伤后14 d)，每组6例，样本组织为SD大鼠的比目鱼肌组织。平台类型为GPL1355[Rat230_2] Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array。每只大鼠16周龄，研究开始时体质量260-280 g，在温度(22±1) ℃和湿度(50±10)%环境中饲养，每天12 h的光照和12 h的黑暗，给予充足的转基因面团饮食(Bio-Serv，NJ，产品号S3472)和水，均来自Charles River Laboratories。每组分别在脊髓损伤前、脊髓损伤后3，8，14 d处死动物。脊髓损伤造模为大鼠被麻醉后，在T₇-T₉水平行背侧椎板切除术后用10 g的圆柱体从25 mm的高度落下撞击T₈脊髓造成损伤。所有程序均按照美国政府脊椎动物利用和护理原则进行，并获佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准。基因表达谱数据GSE45550由美国华盛顿儿童研究所遗传医学研究部Baligand C，Chen YW，Ye F，Pandey SN等人的课题组上传，该课题组研究内容为脊髓损伤后骨骼肌的分子反应和运动训练对其的影响。

1.4  方法

1.4.1  基因谱数据的质量控制  采用每张芯片的NUSE(Normalized Unscaled Standard Errors)值的中位数与RLE(Relative Log Expression)值的中位数作为一次实验分析方案设计可行性与结果可靠性的评判标准。通过控制NUSE与RLE能够较为合理地保证实验方案中分析结果的准确度。采用的单个样本(芯片)的统一判断标准为：(1-0.2)< median{NUSE}<(1+0.2)且(-0.25)<median{RLE}<(0.25)，不满足此标准的芯片将被剔除。为了得到芯片合理准确的质量评估，Affymetrix推荐每种类型的样本不少于3次重复。而且为了保证芯片在探针集水平的评估结果，Affymetrix推荐每次实验的总样本数不少于5。

1.4.2  差异基因分析  是先计算每一个基因的组间差异，然后按其统计量的绝对值大小排序。将GSE45550的4组样本组织数据输入到Qlucore Omics Explorer(QOE) (http://www.Qlucore.com)中，取Q值< 0.01、P值< 0.01，筛选得到合适的差异基因数目。基于差异分析的SAM法，计算每个基因的统计量值(d Score)，d Score越大表示综合多组间该基因差异表达越显著。

1.4.3  GO分析  将上述得到的差异基因上传到DAVID (http://www.pantherdb.org/)在线软件进行GO分析。GO分析基于基因本体论(Gene Ontology，GO)数据库进行基因功能注释，得到基因参与的所有功能(生物学过程)，而后利用 Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平(P-value)和误判率(FDR)。从而筛选出差异基因所体现的显著性功能，显著性筛选的标准：P value < 0.05，FDR < 0.05。

1.4.4  通路(pathway)分析  将上述得到的差异基因上传到DAVID(http://www.pantherdb.org/)在线软件进行通路分析。通路分析基于KEGG数据库(http://www.genome.jp/ kegg/)，对差异基因利用 Fisher精确检验和卡方检验，把目标基因参与的通路进行显著性分析，按照P < 0.05进行筛选，得到显著性的信号通路。然后对显著性信号通路的P值进行升序排列。

脊髓损伤后通常会导致肌肉萎缩。目前，关于脊髓损伤后肌肉萎缩的分类没有明确的共识，某些报道认为脊髓损伤后肌肉萎缩属于失用性肌肉萎缩和去神经性肌肉萎 缩^[9-13]。然而，脊髓损伤后肌肉萎缩与上述类型的萎缩不同。失用性肌肉萎缩基于不同程度的肌肉不活动，包括踝关节固定和下肢的不活动，当中枢神经系统完好无损时，就会发生失用性肌肉萎缩^[14]。另一种情况是去神经性萎缩，这通常由外周轴索切开术模型诱发，在这种类型的肌肉萎缩中，中枢神经系统没有受损，因为损伤仅限于背根神经节的轴突^[15]。脊髓损伤后肌肉萎缩与上述类型的肌肉萎缩之间的差异在于脊髓损伤中下运动神经元是完整的，但上运动神经元不能将信息传递给下运动神经元。由于中枢神经系统的复杂性和观察到的自发功能恢复的病例，因此认为脊髓损伤后肌肉萎缩可能是特殊病理机制的结果。为了开发新的治疗策略或找到新的诊断标志物，需要研究介导脊髓损伤后肌肉萎缩的分子机制和信号传导途径。以前的研究已经证明了在这个病理过程中某些分子和基因的参与。然而，脊髓损伤后肌肉萎缩的病理机制是复杂的，因此仅研究某些分子是不够的。全基因谱数据提供了脊髓损伤后肌肉萎缩的mRNA表达水平变化的一些提示。

Gorgey等^[16]的研究表明不完全性脊髓损伤患者在伤后几周就会出现肌肉萎缩，并在伤后4.5个月进一步加重。另外的研究认为脊髓损伤后电机偶联和肌膜通透性改变导致肌肉萎缩。随着脊髓损伤，小鼠、大鼠和人随之发生快速和广泛的肌萎缩，这与氧化磷酸化相关的酶活性降低、肌肉收缩能力及抗疲劳能力降低有关^[17]。有研究报道驱动肌肉萎缩的因素包括泛连接蛋白1(Panx1)和肌膜上连接蛋白39、43、45的含量升高激活NF-κB的P65亚基^[18]。

GO分析：基于基因本体论(Gene Ontology，GO)数据库进行基因功能注释，得到基因参与的所有功能(生物学过程)，而后利用 Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平(P-value)和误判率(FDR)。从而筛选出差异基因所体现的显著性功能，显著性筛选的标准：P value < 0.05，FDR < 0.05。