α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰

doi:10.12307/2024.205

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5577-5582.doi: 10.12307/2024.205

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α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰

齐雪1，李家慧1，朱远峰1，禹璐1，王鹏1，2

北华大学基础医学院，1人体解剖学教研室，2神经退行性疾病研究室，吉林省吉林市 132013

收稿日期:2023-03-10 接受日期:2023-03-20 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-01
通讯作者: 王鹏，博士，副教授，硕士导师，北华大学基础医学院，人体解剖学教研室，神经退行性疾病研究室，吉林省吉林市 132013
作者简介:齐雪，女，1996年生，内蒙古自治区呼伦贝尔市人，汉族，北华大学在读硕士，主要从事帕金森病机制研究。
基金资助:
吉林省自然科学基金(YDZJ202201ZYTS575)，项目负责人：王鹏；吉林省卫生与健康技术创新项目(2018J083)，项目负责人：王鹏；北华大学研究生创新项目(北华研创合字[2021]017)，项目负责人：齐雪

Phosphorylation modification of alpha synuclein in serum of patients with Parkinson’s disease

Qi Xue1, Li Jiahui1, Zhu Yuanfeng1, Yu Lu1, Wang Peng1, 2

1Department of Human Anatomy, 2Laboratory of Neurodegenerative Diseases, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China

Received:2023-03-10 Accepted:2023-03-20 Online:2023-12-18 Published:2023-06-01
Contact: Wang Peng, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China; Laboratory of Neurodegenerative Diseases, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China
About author:Qi Xue, Master candidate, Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Jilin Province, No. YDZJ202201ZYTS575 (to WP); the Health Department of Jilin Province, No. 2018J083 (to WP); Postgraduate Innovative Project of Beihua University, No. 2021017 (to QX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

磷酸化修饰：磷酸化是一种常见的翻译后修饰，主要调节蛋白质功能和活性，主要是指附着在蛋白质丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸上的磷酸基团由激酶催化后蛋白发生折叠。
α-突触核蛋白：是一种中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白，在病理改变后错误折叠生成不可溶性聚集体，与帕金森病的发病有密切的关系。

背景：α-突触核蛋白翻译后修饰后形成的聚集体是帕金森病主要的病理学改变。α-突触核蛋白可通过血脑屏障由中枢进入外周血分布至机体各部，这成为帕金森病病理播散的重要途径。因此研究血液中的α-突触核蛋白变化对揭示帕金森病的机制以及早期诊断尤为重要。
目的：拟分析α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰位点及生成聚集体间的结构稳定性的差异。
方法：构建重组人α-突触核蛋白原核表达系统，亲和层析法纯化蛋白，采用SDS-PAGE电泳和Western blot方法检测α-突触核蛋白单体纯度和特异性。收集北华大学附属医院神经内科住院的26例帕金森病患者血清和26例正常人血清，完成各组血清中α-突触核蛋白聚集体的制备；采用质谱SWATH方法检测帕金森病患者血清中α-突触核蛋白发生磷酸化修饰的修饰位点，并对不同位点的蛋白聚集体进行定量分析。将不同磷酸化修饰的蛋白聚集体免疫亲和层析法纯化后，Western blot方法检测帕金森病患者血清中各磷酸化修饰后聚集体的稳定性。

结果与结论：①实验通过SDS电泳和Western blot方法检测显示得到纯度较高、特异性较高的α-突触核蛋白单体。②质谱SWATH分析结果显示，在帕金森病患者和正常人血清中均发生磷酸化修饰，其中帕金森病患者血清中磷酸化修饰的位点明显多于正常人，帕金森病患者血清中发生磷酸化的位点有丝氨酸(Serine，Ser)87、Ser129、酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)125、Tyr133和Tyr136等。③帕金森病患者血清中孵育后的α-突触核蛋白中，Ser129位点磷酸化修饰占总磷酸化的53.65%，Tyr125，Tyr133，Tyr136和Ser87磷酸化各为17.21%，15.79%，15.79%，9.52%和1.03%。④Western blot检测结果显示，帕金森病患者血清中Ser129位点磷酸化修饰后形成的聚集体较Tyr125，Tyr133和Tyr136更为稳定。⑤上述数据证实，帕金森病患者血清中的α-突触核蛋白磷酸化修饰位点数量明显多于正常人；在诸多修饰位点中，血清α-突触核蛋白的Ser129位点经过磷酸化修饰后形成的聚集体最稳定，这可能为帕金森病早期诊断提供诊断标志物参考。

https://orcid.org/0009-0008-8647-2469(齐雪)；https://orcid.org/0000-0003-3781-3702(王鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: α-突触核蛋白, 帕金森病, 磷酸化, 血清, 丝氨酸, 酪氨酸, 聚集体, 诊断生物标志物

Abstract: BACKGROUND: The aggregates formed after translational modification of α-synuclein are the main pathological changes of Parkinson’s disease. α-Synuclein can penetrate the blood-brain barrier and be delivered from the central nervous system to the peripheral blood to all parts of the body, which becomes an important pathway for the pathological dissemination of Parkinson’s disease. Therefore, it is particularly important to study the changes of blood markers in patients with Parkinson’s disease to reveal the mechanism of Parkinson‘s disease as well as for early diagnosis.
OBJECTIVE: To analyze the differences in the structural stability of phosphorylation modification sites and generated aggregates of α-synuclein in serum of patients with Parkinson’s disease.
METHODS: A recombinant human α-synuclein prokaryotic expression system was constructed, and the protein was purified by affinity chromatography. The purity and specificity of α-synuclein monomer was detected by SDS-PAGE and western blot. Serum samples of 26 normal controls and 26 patients with Parkinson’s disease in the Department of Neurology, Affiliated Hospital of Beihua University were collected to complete the preparation of serum α-synuclein aggregates. The modified sites for phosphorylation modification of α-synuclein protein in normal serum and serum of patients with Parkinson’s disease were identified using SWATH-mass spectrometry, and protein aggregates at different sites were quantitatively analyzed. The protein aggregates with different phosphorylation modifications were purified by immunoaffinity chromatography, and then detected for stability in the serum of patients with Parkinson’s disease by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of SDS-PAGE and western blot showed that α-synuclein monomers with high purity and specificity were obtained. The results of the SWATH-mass spectrometry analysis showed that phosphorylation modifications occurred in both Parkinson’s disease patients and normal human serum, with significantly more phosphorylated sites in Parkinson’s disease patients than in normal humans. The phosphorylation sites in the serum of patients with Parkinson’s disease were Serine (Ser) 87, Ser129, L-tyrosine (Tyr)125, Tyr 133 and Tyr 136. After incubation in the serum of patients with Parkinson’s disease for α-synuclein, the phosphorylation modification at Ser129 accounted for 53.65% of the total phosphorylation, with 17.21%, 15.79%, 15.79%, 9.52%, and 1.03% for Tyr125, Tyr133, Tyr136, and Ser87, respectively. The serum levels of Ser129 phosphorylation-modified aggregates were detected by western blot to be more stable than those of Tyr125, Tyr133 and Tyr136 in patients with Parkinson’s disease. To conclude, the number of α-synuclein phosphorylation modification sites in the serum of patients with Parkinson’s disease was significantly higher than that of normal subjects. The aggregate structure generated by phosphorylation modification at Ser129 in the serum of patients with Parkinson’s disease was the most stable. This may provide a diagnostic marker for the early diagnosis of Parkinson’s disease.

Key words: , α-synuclein, Parkinson’s disease, phosphorylation, serum, serine, tyrosine, aggregate, diagnostic biomarker

中图分类号:

齐雪, 李家慧, 朱远峰, 禹璐, 王鹏. α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5577-5582.

Qi Xue, Li Jiahui, Zhu Yuanfeng, Yu Lu, Wang Peng. Phosphorylation modification of alpha synuclein in serum of patients with Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5577-5582.

图/表（结果） 5

2.1 α-突触核蛋白的蛋白单体表达情况 Western blot和SDS-PAGE检测结果显示，实验制备获得的α-突触核蛋白单体条带单一，无杂蛋白，蛋白纯度较高，见图1。

2.2 帕金森病患者与正常人基线资料比较共收集26例帕金森病患者血清和正常人血清作为对照组。如表1所示，帕金森病组平均年龄(56.47±13.78)岁，健康对照组为(58.68±14.65)岁，选取的帕金森病患者和正常人男女比例均为18∶8，所有参与者均通过蒙特利尔认知评估和贝克抑郁量表测评，无抑郁和认知障碍。帕金森病患者根据统一帕金森病评分量表评估运动症状的严重程度，并记录服用左旋多巴的日剂量为(509.3±269.4) mg。帕金森病患者记录疾病持续时间为(3.6±3.4)年。帕金森病组与正常组相比在年龄、性别、教育、蒙特利尔认知评估和贝克抑郁量表无显著差异(P > 0.05)。

2.3 磷酸化位点检测结果质谱检测结果显示，在正常人血清中α-突触核蛋白中包含鉴定到的肽段序列数量为105-123个，帕金森病患者血清中肽段序列数量在133-141个；正常人血清中α-突触核蛋白氨基酸覆盖度为97.86%-99.29%，帕金森病患者血清中α-突触核蛋白氨基酸覆盖度为95.71%-97.86%。在帕金森病患者和正常人血清中均发生磷酸化修饰，共检测到15个磷酸化位点，如表2所示，帕金森病患者血清中磷酸化修饰的位点明显多于正常人，识别到帕金森病患者血清中较为特异的磷酸化位点为Ser87，Ser129，Tyr125，Tyr133，Tyr136。

2.4 帕金森病患者血清中不同磷酸化位点定量分析结果为进一步分析帕金森病患者血清中磷酸化α-突触核蛋白的表达量，同时采用质谱进行定量分析。结果如图2所示，Ser129位点磷酸化修饰占α-突触核蛋白总磷酸化的53.65%，占比最多，而Tyr125，Tyr133，Tyr136和Ser87磷酸化分别占17.21%，15.79%，15.79%，9.52%和1.03%。其中Ser87位点位于蛋白的中心疏水区域，占比最少，其余位点均位于蛋白的羧基端。因此下面着重观察Tyr125，Tyr133，Tyr136和Ser87磷酸化修饰蛋白的特性。

2.5 帕金森病患者血清中不同磷酸化位点α-突触核蛋白聚集体结构差异性为进一步确定Ser129，Tyr125，Tyr133和Tyr136位点磷酸化修饰后帕金森病患者血清中α-突触核蛋白聚集体的结构稳定性，以体积分数1% Triton X-100和2% SDS处理α-突触核蛋白聚集体，用Western blot法检测结果如图3所示，Ser129位点磷酸化形成的聚集体较Tyr125，Tyr133和Tyr136更为稳定。除Ser129位点磷酸化形成的聚集体外，Tyr125，Tyr133和Tyr136的聚集体均有不同程度地分解。

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引言

帕金森病是人类最常见的复杂神经系统退行性疾病之一[1]，其发病率随患者的年龄增长而增加，预计到2040年，帕金森病患者可达1 200万以上[2]。帕金森病诱导的并发症严重影响患者的健康和生活质量，增加死亡的风险，造成巨大的社会经济负担[3]。当前中国人口老龄化程度形势严峻[4]，积极干预帕金森病等老龄相关的疾病显得异常重要。帕金森病主要病理变化是中脑黑质内多巴胺能神经元中α-突触核蛋白异常积聚，进而形成路易小体导致多巴胺能神经元的缺失或变性[5]，并且早在2003年有研究提出的α-突触核蛋白病理学组织扩散模型，阐明散发性帕金森病中的路易小体起源于嗅球和延髓，后其可通过朊病毒样播散到黑质、中脑和基底神经节[6]，促使神经元的功能障碍或减退，从而导致运动症状和非运动症状的出现。目前帕金森病的诊断仍以运动症状为主，主要包括静止性震颤(最初为单侧)、运动迟缓、肌强直、步态蹒跚和姿势不稳定[7]，虽然非运动症状明显早于运动症状出现[8]，但其发病隐匿，大部分患者未能察觉。然而常规的以典型运动症状来诊断帕金森病，通常已在帕金森病患者病程进展的后期，因此需要明确早期诊断标志物来确诊帕金森病。
α-突触核蛋白是帕金森病发病的关键性蛋白，是一种中枢神经系统突触前表达的小分子量可溶性蛋白[9]，一级结构由氨基端、中心疏水区域和羧基端3个功能区组成，其氨基端区域易于发生磷酸化修饰影响其分子间相互作用[10]，进而增强α-突触核蛋白聚集倾向。在基因突变、翻译后修饰、α-突触核蛋白的合成和降解失衡以及环境因素发生改变的情况下均会影响α-突触核蛋白构象不稳定，加速蛋白聚集倾向[11]。已有研究证实，在帕金森病患者的中脑内α-突触核蛋白不可溶嗜酸性包涵体内，超过90%的α-突触核蛋白会发生磷酸化修饰[12]，而在健康人脑中α-突触核蛋白磷酸化修饰不到4%，这提示磷酸化修饰对路易小体的形成有重要的作用。有报道表明，帕金森病患者的血清中polo样激酶2活性升高，可上调α-突触核蛋白磷酸化修饰水平[13]，因此推测帕金森病患者血清更易于促进α-突触核蛋白的异常聚集。虽然α-突触核蛋白磷酸化修饰的聚集体在帕金森病患者外周血及脑组织中高表达已被证实[14]，但在血液中主要修饰的磷酸化位点并未系统阐明。
文章将血液对关键蛋白α-突触核蛋白的磷酸化修饰变化作为研究对象，检测血清中α-突触核蛋白磷酸化修饰位点，并分析帕金森病患者血清中磷酸化修饰位点的差异对聚集体形成的影响，希望为帕金森病的诊断与早期预警提供潜在的诊断标志物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计非随机对照试验，血清学样本检测，独立样本t检验，单因素方差分析和LSD-t事后检验。
1.2 时间及地点于2021年4-12月在北华大学基础医学院神经退行性疾病实验室完成。
1.3 对象课题组招募了2021年3-12月在北华大学附属医院神经内科就诊的帕金森病患者26例。
纳入标准：①所有性别和年龄匹配的患者均根据2016年汉化版国际运动障碍协会修订的统一帕金森病评定量表第Ⅲ部分评分评估运动症状的严重程度[15]。②帕金森病患者均用H&Y分期量表评估患者病程进展情况，纳入的为H&Y分期2-3级；③接受左多巴和/或多巴胺治疗的特发性帕金森病患者。
排除标准：①特发性帕金森病以外的帕金森病、脑手术史/深部脑刺激史或《精神障碍诊断与统计手册》第4版标准定义的痴呆[16]；②合并抑郁症(根据贝克抑郁量表评估)者；③合并痴呆症(根据蒙特利尔认知评估)者。
课题组同时收集年龄和性别相匹配的北华大学附属医院健康体检的正常人作为健康对照组26例。该研究得到了北华大学附属医院的机构审查委员会和伦理委员会的批准(批准号：2020年临审第25号)，且所有参与者或其法定监护人都签署了参与研究的书面知情同意书。
1.4 实验方法
1.4.1 α-突触核蛋白单体的制备与纯化在NCBI Genbank基因数据库中检索人α-突触核蛋白 cDNA序列，并插入pGEX-4T-1载体质粒(由上海生工生物工程有限公司合成)中，随后将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中表达。表达后的菌种在含有终浓度为100 mg/mL 氨苄青霉素LB固体培养基中进行划板后放于CO2恒温培养箱(购自上海善志仪器设备有限公司)37 ℃孵育过夜；次日，取菌种在LB液体培养基中进行小培养，37 ℃，230 r/min，孵育16 h；再在含有氨苄青霉素的YTA 培养液中37 ℃，230 r/min大培养孵育3 h，加入终浓度为0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)37 ℃，230 r/min，孵育5 h诱导重组蛋白表达。将表达后的重组型蛋白采用亲和层析法纯化使用GST标签蛋白纯化试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)纯化。纯化后的α-突触核蛋白的蛋白单体于-80 ℃冰箱保存。采用BCA试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)检测蛋白浓度，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况，经Western blot以α-Synuclein Rabbit pAb兔单克隆抗体(均购自英国剑桥Abcam公司；1∶1 000)配制一抗孵育4 ℃过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；1∶5 000)室温1 h孵育二抗，鉴定重组人α-突触核蛋白单体的特异性。
1.4.2 血清样本的处理清晨抽取受试对象空腹外周静脉血10 mL，使用不含有抗凝剂的采血管收集帕金森病患者和正常人的血液样本，3 500 r/min，离心10 min，离心后吸取表面的血清，再用免疫共沉淀的方法去除血清中内源性人α-突触核蛋白。最后将血清样本分装，在-80 ℃冻存备用。
1.4.3 α-突触核蛋白聚集体的制备将帕金森病患者和正常人血清加入的1×PBS缓冲液稀释至体积分数30%，然后取0.5 μg的α-突触核蛋白单体蛋白溶解于体积分数30%帕金森病患者和正常人血清中，使其终浓度为100 μmol/L。单体与血清混合溶液经0.22 μm滤器过滤除菌后，恒温混合器(购自于海门市其林贝尔仪器制造公司)中37 ℃，离心650 r/min，恒温振荡72 h孵育聚集体。采用Western blot检测鉴定α-突触核蛋白聚集体的表达。
1.4.4 α-突触核蛋白磷酸化修饰位点及含量的鉴定将帕金森病与正常人血清孵育的聚集体混合物送往质谱SWATH检测(委托武汉金开瑞生物工程有限公司分析检测)，确定α-突触核蛋白磷酸化修饰位点及对磷酸化蛋白进行定量分析。
1.4.5 免疫亲和层析质谱检测确定磷酸化修饰位点后，激活固相介质CNBr-activated SepharoseTM 6B磁珠(购自上海碧云天生物技术有限公司)，将磁珠置于层析柱内，1×PBS 3倍体积冲洗。将不同的特异性α-突触核蛋白磷酸化单克隆抗体α-synuclein(phospho Ser129)pAb(ab51253)、α-synuclein(phospho Tyr125)pAb(ab124955)、α-Synuclein(phospho Tyr133)pAb(ab194910)、α-Synuclein(phospho Tyr136)pAb(ab131491)(均购自英国剑桥Abcam公司；1∶1 000)与偶联缓冲液混合后，加入层析柱内，摇床4 ℃过夜，次日放出液体，PBS冲洗层析柱。乙醇胺室温封闭3 h。取0.22 μm滤器过滤帕金森病和正常人孵育的聚集体混合物后，加入层析柱内，室温静置1 h后，缓慢过柱。PBS冲洗后，经特异性洗脱、收集洗脱液。α-突触核蛋白聚集体鉴定后，保存于-80 ℃冰箱。
1.4.6 Western blot 检测蛋白结构稳定性经过免疫亲和层析分离后的α-突触核蛋白聚集体按照BCA试剂盒说明蛋白定量后，将目的蛋白与5×样本缓冲液按1∶4的比例配置，充分混匀后，电锅煮沸3 min变性后；取10 μL作为上样量，进行Western blot检测(浓缩胶80 V，分离胶100 V)，以根据PVDF膜的面积恒流(2 mA/cm2)进行半干式转膜50 min；转膜后室温封闭1 h，洗膜3次后，加入兔单克隆α-突触核蛋白(phospho Ser129)抗体按照(1∶1 000)比例、兔单克隆α-突触核蛋白(phospho Tyr125)抗体按照(1∶1 000)、兔单克隆α-突触核蛋白(phospho Tyr133)抗体(1∶1 000)、兔单克隆α-突触核蛋白(phospho Tyr136)抗体(1∶1 000)孵育一抗，摇床4 ℃过夜。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；1∶5 000)室温孵育1 h。ECL试剂盒说明按照配制1∶1比例配制A液和B液。混合显影液后，打开显影仪，曝光2 min拍照，保存成片。
1.5 主要观察指标 ①Western blot检测和SDS-PAGE电泳鉴定α-突触核蛋白的蛋白单体表达情况。②正常人与帕金森病患者的基线特征及临床特点。③质谱SWATH分析帕金森病和正常人血清中α-突触核蛋白磷酸化修饰的位点。④质谱SWATH对帕金森病患者血清中α-突触核蛋白磷酸化修饰的位点定量分析。⑤Western blot检测帕金森病患者血清中不同磷酸化位点聚集体的稳定性。
1.6 统计学分析采用IBM SPSS Statistics 21.0软件进行统计学分析处理，所有计量数据经检验符合正态分布并用x±s表示，两组间数据比较采用独立样本t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t事后检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过北华大学生物统计学专家审核。

讨论

帕金森病的病因错综复杂，尽管现在已经对帕金森病进行深入研究[17]，但其病理生理学机制仍不完全清楚。帕金森病的主要病理特征是错误折叠的α-突触核蛋白聚集体导致黑质内纹状体的多巴胺能神经元的逐渐丢失，当纹状体内多巴胺水平降低至60%-80%时[18]，会出现明显的运动症状。目前，帕金森病诊断生物标志物主要从脑脊液[19]、血液、尿液和皮肤样本中检测，但其特异性和灵敏性均未达到临床要求[20]。样本中标志物检测的不稳定，促使该课题组聚焦于帕金森病患者血液环境变化以及关键蛋白α-突触核蛋白在外周血液环境的修饰。
α-突触核蛋白是第一个作为路易体和路易神经突的主要成分而被确定为与帕金森病相关的基因的产物[21]。具有细胞毒性作用聚集的α-突触核蛋白，在突触核蛋白病的发病机制中起核心作用。α-突触核蛋白的翻译后修饰对其结构与功能影响极大，不同构象的α-突触核蛋白在稳定性和传播能力方面表现出差异[22]。现有研究证实α-突触核蛋白发生磷酸化修饰后会加速其纤维化和不溶性聚集体的形成，对帕金森病病理的形成起重要作用[23]。另外在体内实验中向大鼠腹腔注射Ser129磷酸化α-突触核蛋白聚集体可建立稳定的帕金森病模型[24]，加速大鼠中枢神经变性过程。但Ser129磷酸化仅占α-突触核蛋白总磷酸化修饰的一部分，更多的磷酸化修饰位点未完全明确。
文章通过先期实验方法将帕金森病患者血清和健康人血清孵育的α-突触核蛋白聚集体进行质谱SWATH分析[25]。实验结果经数据库比对后显示，在正常人血清和帕金森病患者血清中孵育的α-突触核蛋白均可发生磷酸化修饰，与帕金森病脑内的研究结果报告相一致[26]，提示血液环境的变化对α-突触核蛋白的翻译后修饰与中枢内的变化相似。文章通过质谱检测已证实在帕金森病患者血清中发生磷酸化位点多数位于蛋白的羧基端(Ser129，Tyr125，Tyr133和Tyr136)。在帕金森病患者脑内，仅残留羧基端肽段的α-突触核蛋白更易于聚集，降低神经细胞活力并促进形成原纤维[27]。前期研究证实，在路易体病患者脑内提取出α-突触核蛋白体外扩增后，仍可保持较强的稳定性[28]。
以往有研究发现在转基因果蝇中α-突触核蛋白羧基端发生Ser129和Tyr125磷酸化，α-突触核蛋白聚集体含量会因Ser129磷酸化程度增加而增加，但Tyr125磷酸化则反之[29]。而且在帕金森病动物模型中G蛋白偶联受体激酶的过表达可增加Ser129上α-突触核蛋白的磷酸化，增加磷酸化蛋白含量的升高，增强聚集体的神经毒性[30]。所以文章分析α-突触核蛋白聚集体的含量是否与磷酸化修饰的位点密切相关。该研究通过质谱定量后，结果证实不同磷酸化位点修饰生成聚集体含量存在明显差异。以往报道证实在路易体痴呆症患者脑内存在含量较多且结构稳定不可溶性Ser129磷酸化α-突触核蛋白聚集体[31]。因此文章推测，在帕金森病患者血清中孵育的含量占比最多的Ser129聚集体与其他位点修饰的聚集体结构稳定性是否存在差异。为验证这一猜测，将帕金森病患者血清孵育的不同位点磷酸化修饰的聚集体分离后加入Triton X-100和SDS处理，鉴定结果显示帕金森病患者血清孵育的Ser129位点磷酸化α-突触核蛋白聚集体较Tyr125，Tyr133和Tyr136更为稳定，其他聚集体均有不同程度分解，结果证实了含量多的Ser129位点磷酸化修饰的聚集体结构稳定性较好。
此次实验结果证实在帕金森病患者血液中主要磷酸化的位点有Ser129，Tyr125，Tyr133和Tyr136，在进一步鉴定后Ser129磷酸化修饰的α-突触核蛋白聚集体含量大、稳定性高，与其他聚集体相比更易在血液环境中传播，造成帕金森病病理变化在机体内的弥散。因而Ser129磷酸化修饰后的α-突触核蛋白聚集体可作为帕金森病临床患者早期诊断标志物。鉴于帕金森病患者血清在α-突触核蛋白磷酸化修饰中的重要作用，已有研究检测到患者体内葡萄糖脑苷脂酶活性和神经酰胺含量下降可诱导蛋白磷酸酶2A表达水平下调，从而促进Ser129磷酸化生成聚集体[13]，其聚集体对神经细胞具有毒性作用[32]。该课题组下一步将致力于揭示血液中磷酸化修饰的机制，以及明确经不同位点修饰的α-突触核蛋白聚集体的神经毒性作用变化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰

Phosphorylation modification of alpha synuclein in serum of patients with Parkinson’s disease

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