跑台运动对帕金森病模型大鼠肠道菌群结构及多样性的影响

doi:10.12307/2024.223

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2227-2233.doi: 10.12307/2024.223

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跑台运动对帕金森病模型大鼠肠道菌群结构及多样性的影响

马欣然1，刘欣昊1，李宇佳1，罗开亮2，马书杰3，胡军1，3

1上海中医药大学康复医学院，上海市 201203；2 福建医科大学附属第一医院康复医学科，福建省福州市 350005；3上海市第二康复医院，上海市 200441

收稿日期:2023-01-19 接受日期:2023-03-13 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 胡军，博士，主任医师，副教授，上海中医药大学康复医学院，上海市 201203；上海市第二康复医院，上海市 200441
作者简介:马欣然，女，1998年生，浙江省余姚市人，汉族，在读硕士，主要从事老年病与运动系统疾病的康复研究。
基金资助:
国家自然科学青年基金项目(81603713)，项目负责人：马书杰；上海市卫生健康委员会科研基金项目(202040485)，项目负责人：胡军；上海市宝山区科学技术基金项目(20-E-43)，项目负责人：马书杰

Effect of treadmill exercise on the structure and diversity of intestinal microflora in rats with Parkinson’s disease

Ma Xinran1, Liu Xinhao1, Li Yujia1, Luo Kailiang2, Ma Shujie3, Hu Jun1, 3

1School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2Department of Rehabilitation, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China; 3The Second Rehabilitation Hospital of Shanghai, Shanghai 200441, China

Received:2023-01-19 Accepted:2023-03-13 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Hu Jun, MD, Chief physician, Associate professor, School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; The Second Rehabilitation Hospital of Shanghai, Shanghai 200441, China
About author:Ma Xinran, Master candidate, School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Youth Project), No. 81603713 (to MSJ); Scientific Research Fund Project of Shanghai Municipal Health Commission, No. 202040485 (to HJ); Shanghai Baoshan District Science and Technology Fund Project, No. 20-E-43 (to MSJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

16S rDNA：是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区(Variable region)和10个保守区(Constant region)。可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起到重要作用。
肠道菌群：是存在于人体肠道内的所有微生物的统称，对宿主免疫系统有重要意义。可能通过促进神经炎性反应、干扰神经递质、紊乱宿主免疫反应及影响微生物-肠-脑轴等，加速帕金森病的发生发展。跑台运动对于帕金森病所导致的肠道微生物失衡具有显著调节作用，可缓解与菌群相关的疾病症状。

背景：运动对于肠道菌群失调具有调节作用，能有效保护有益菌群，改善肠道环境；但跑台运动对帕金森病肠道微生物群落结构及多样性的影响及具体作用机制尚不明确。

目的：利用16S rDNA技术分析跑台运动对帕金森病模型大鼠肠道菌群群落结构及多样性的影响，并探讨非药物跑台运动改善帕金森病的作用机制。
方法：18只SD大鼠随机选取12只，利用单侧黑质2点法脑注射6-羟基多巴胺诱导建立帕金森病大鼠模型；剩余6只为假手术组，采用相同定位及注射方式注射同等剂量含0.2%抗坏血酸的生理盐水。造模成功的12只帕金森病模型大鼠随机分为帕金森病模型组和跑台运动组，每组6只。跑台运动组进行中低强度跑台运动干预(10 m/min，30 min/d，5 d/周)，连续干预4周。在最后 1 次跑台运动结束后24 h取大鼠新鲜粪便并置于液氮冻存，采用16S rDNA测序技术分析大鼠粪便菌群结构的变化。

结果与结论：①跑台运动可明显改善帕金森病模型大鼠的行为学及黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞表达，缓解由帕金森病引起的肠道微生物群落结构及多样性的变化，增加大鼠操作分类单位(OTUs)数量，调节Alpha及Beta多样性；②在肠道菌群门和属水平，帕金森病模型组中Firmicutes(厚壁菌门)/Bacteroidetes(拟杆菌门)丰度比值较假手术组减少，而Prevotella(普雷沃氏菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)、Clostridium_XlV(梭菌属)等有益菌经跑台运动后有明显上升；③结果提示：跑台运动对于帕金森病所导致的行为学异常、多巴胺能神经元的毒性损伤及肠道微生物失衡具有显著调节作用，可缓解与菌群相关的疾病症状，对帕金森病改善具有积极作用。

https://orcid.org/0000-0002-0985-1261(马欣然)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 跑台运动, 帕金森病, 肠道菌群, 16S rDNA, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Exercise has a regulatory effect on intestinal flora dysbiosis, which can effectively protect the beneficial flora and improve the intestinal environment. However, the effect of treadmill exercise on the structure and diversity of intestinal microbial community in Parkinson’s disease and the specific mechanism are not clear.
Objective: Using 16S rDNA technique to analyze the effect of treadmill exercise on the structure and diversity of the intestinal flora of rats with Parkinson’s disease, and to investigate the mechanism of non-pharmacological treadmill exercise to improve Parkinson’s disease.
METHODS: Twelve of the 18 Sprague-Dawley rats were randomly selected to make animal models of Parkinson’s disease using unilateral 2-point nigrostriatal injection of 6-hydroxydopamine. The remaining six rats were used as sham-operation group, which were injected with the same dose of saline containing 0.2% ascorbic acid using the same positioning and injection method. After successful modeling, 12 rats with Parkinson’s disease were randomly divided into model group and treadmill exercise group (n=6 per group). The treadmill exercise group was subjected to a middle and low intensity tread mill exercise, 10 m/min, 30 minutes per day, 5 days per week for 4 weeks. Fresh feces were collected and stored in liquid nitrogen 24 hour after the last exercise session, and the changes in fecal flora were analyzed by 16S rDNA sequencing technique.
Results and conclusion: Treadmill exercise significantly improved behavior and nigrostriatal tyrosine hydroxylase-positive cell expression in rats with Parkinson’s disease model and alleviated changes in the structure and diversity of the gut microbial community caused by Parkinson’s disease, increased the number of operational taxonomic units and modulated Alpha and Beta diversity in rats. At the phylum and genus levels, the abundance ratio of Firmicutes/Bacteroidetes in the model group decreased compared with the sham-operated group, while beneficial bacteria such as Prevotella, Bacteroides, and Clostridium_XlV increased significantly after treadmill exercise. To conclude, treadmill exercise has a significant modulating effect on behavioral abnormalities, toxic damage to dopaminergic neurons and gut microbial imbalance caused by Parkinson’s disease, alleviates the symptoms of flora-related diseases, and has a positive effect on the improvement of Parkinson’s disease.

Key words: treadmill exercise, Parkinson’s disease, intestinal flora, 16S rDNA, rat

中图分类号:

马欣然, 刘欣昊, 李宇佳, 罗开亮, 马书杰, 胡军. 跑台运动对帕金森病模型大鼠肠道菌群结构及多样性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2227-2233.

Ma Xinran, Liu Xinhao, Li Yujia, Luo Kailiang, Ma Shujie, Hu Jun. Effect of treadmill exercise on the structure and diversity of intestinal microflora in rats with Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2227-2233.

图/表（结果） 11

2.1 实验动物数量分析选取造模成功的12只PD模型大鼠和只注射抗坏血酸的6只正常大鼠用于实验和分析。
2.2 大鼠旋转测试结果开始干预前，即模型制备术后第7天，PD模型组大鼠30 min旋转圈数为(364.65±11.33) r，跑台运动组大鼠30 min旋转圈数为(355.83±21.24) r，两组未见明显差异。干预第10及20天，与PD模型组同期相比，跑台运动组大鼠旋转圈数显著下降(P < 0.01)，见表1。

2.3 大鼠爬杆实验结果在跑台运动干预第3天时，3组间的爬杆时间未产生明显差异。跑台运动的第10，15，20 天，与假手术组相比，PD模型组爬杆时间分别增加了90.1%，78.8%和91.5%，两组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)；与PD模型组相比，跑台运动组爬杆时间分别减少23.3%，21.7%和24.6%，两组间比较差异有显著性意义(P < 0.01) ，见表2。

2.4 大鼠黑质致密部TH阳性细胞检测结果假手术组可见密集的TH阳性细胞，呈棕褐色。与假手术组相比，PD模型组可见少量、稀疏TH阳性细胞，且TH表达较假手术组明显下降(P < 0.01)。经过跑台运动干预后，TH阳性细胞数量及强度表达明显升高，与PD模型组和假手术组差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图1A，B。

2.5 大鼠样本肠道菌群的 OTU 分析假手术组共有805个OTUs，独有142个OTUs；PD模型组共有689个OTUs，独有26个OTUs；跑台运动组共有736个OTUs，独有49个OTUs；3组共有的OTUs为 545个，见图2A。进一步分析，发现PD模型组OTUs 的相对丰度低于假手术组，而跑台运动组大鼠的OTUs相对丰度则显示高于PD模型组，见图2B。结果表明跑台运动干预后，可回调PD模型组大鼠各分类水平上的 OTUs 丰富度。

2.6 大鼠样本肠道菌群的 Alpha 多样性分析随着测序深度的增加及数据量的扩大，局域均匀生境下的物种丰富度也随之改变，见图3，表3。与假手术组相比，PD模型组的Chao指数有所降低(P < 0.05)，Ace指数及Sobs指数均显著降低(P < 0.01)；经跑台运动干预后，可回调PD模型组的 Chao指数、Ace指数及Sobs指数，虽然无显著性差异，但仍可发现跑台运动对由PD引起的肠道菌群丰富度及多样性的变化具有一定程度改善作用。

2.7 大鼠样本肠道菌群的分类学组成分析在门水平，样本菌群中相对丰度最高的前4种菌群分别为Bacteroidetes (拟杆菌门) 、Firmicutes (厚壁菌门) 、Verrucomicrobia (疣微菌门)和Proteobacteria (变形菌门)，四者比例之和在各组中均达97%以上。值得关注的是，与假手术照相比，PD模型组中Tenericutes(无壁菌门)的丰度水平由0.016 2%升高为0.071 3%，Actinobacteria(放线菌门)的丰度水平由0.259 6%显著降低至 0.097 1%； Candidatus_Saccharibacteria的丰度水平由0.492 6%显著降低至0.239 3%；经跑台运动干预后，Tenericutes的丰度水平升高至0.268 7%，Actinobacteria和Candidatus_Saccharibacteria的丰度分别降低至0.030 6%和0.099 3%。进一步对肠道菌群进行属水平分析，发现与PD模型组的优势菌群相比，跑台运动组的Barnesiella、Ruminococcus、Lactobacillus、Romboutsia均有所降低，而有益菌Prevotella、Bacteroides、Clostridium_XlVa等呈上升趋势，见图4，5和表4，5。

2.8 大鼠样本肠道菌群的Beta多样性分析采用Beta多样性热图和基于UniFrac 距离的样本聚类分析，考察样本微生物群落结构间的差异和相似性。结果显示假手术照组与PD模型组间样本明显分开，说明造模对群落的结构产生了一定影响；同时跑台运动组与假手术组的组间区域相接近，与PD模型组区域相距较远，说明跑台运动对PD模型的肠道菌群结构具有回调作用，见图6A，B。

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引言

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)作为全球第二大神经退行性疾病，常见于60岁以上人群，且随年龄增长发病率升高[1]。数据显示，中国现有PD患者超过300万，每年约有10万新发病例。PD的临床诊断以运动症状为主，非运动症状为辅[2]。由于PD患病初期就诊率低、误诊率高，且确切病因及发病机制尚不明确，治疗效果欠佳，所造成的家庭、社会经济负担不断增加。目前，药物与非药物疗法已被大量运用于PD的康复治疗中，尽管产生了一定的疗效，但也只能做到延缓症状的发生，无法做到根治，且药物治疗的功效会随时间而降低，而长期服药带来的毒副作用可能加速疾病的发展，因此寻找更对症的治疗方法至关重要[3-5]。肠道菌群是存在于人体肠道内的所有微生物的统称，对宿主免疫系统有重要意义。机体内环境稳定时，肠道菌群维持着动态平衡并与中枢神经系统进行双向调节；当机体内环境紊乱时，肠道菌群失调，并可能通过促进神经炎性反应、干扰神经递质、紊乱宿主免疫反应及影响微生物-肠-脑轴等对神经系统产生负面影响，减缓治疗的进程甚至加速神经系统的退
化[6-10]。
近几年，运动训练作为一种重要的非药物治疗方法被广泛用于PD患者的康复治疗中。研究表明，运动对于肠道菌群失调具有调节作用，能有效保护有益菌群，改善肠道环境[11]。中低强度的跑台运动具有改善肠道功能、增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、减轻PD模型大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元的退变及降低α-突触核蛋白的表达水平等作用，并能促进厚壁菌门和双歧杆菌等有益菌群的发展[12-13]。由此可见，跑台运动在干预PD的进展中拥有重要价值。因此，该研究基于Illumina Hiseq测序平台的16S rDNA技术，从肠道菌群角度研究跑台运动对PD肠道微生物群落结构及多样性的影响，进而探讨跑台运动改善PD病理症状的可能作用机制，为其在临床诊断与治疗中应用提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组对照，多组间比较采用单因素方差分析，组内差异采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年7-10月在上海中医药大学动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠18只，6-8周龄，体质量160-200 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2018-0006。饲养环境：动物房温度(23±2) ℃，相对湿度 60%-65%。空气洁净度7级，交替进行12 h光照、12 h黑暗处理，6只/笼，正常饮食。
该实验方案经上海中医药大学动物实验中心伦理委员会批准(审批号：PZSHUTCM201204004)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司，批号：R510-22)；6-羟基多巴胺(批号：MKCJ2199)、抗坏血酸(批号：WXBD2611V)、阿扑吗啡(批号：LRAC4767)均购自美国Sigma公司；柠檬酸(pH6.0)抗原修复液(批号：G1202)、PBS(批号：G0002)、BSA(批号：G5001)、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)一抗(批号：GB11181)、HRP-山羊抗兔二抗(批号：GB23303)均购自Servicebio公司；试剂盒DAB显色剂(DAKO，批号：K5007)。
1.3.3 主要仪器小动物跑步机(上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-PT-10B)；增强型小动物麻醉机(型号：R540)、大鼠脑立体定位仪(型号：68018)均购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；微量进样器(上海高鸽工贸有限公司，规格：5 μL)；小动物颅骨钻(深圳赛德克斯医疗科技有限公司，型号：78001)；涡旋混合器(Servicebio，型号：MX-F)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组将造模成功的12只PD大鼠，随机分为PD模型组(n=6)和跑台运动组(n=6)，另纳入只注射抗坏血酸的6只大鼠为假手术组。

1.4.2 动物模型制备采用右侧黑质2点法注射6-羟基多巴胺诱导建立PD大鼠模型[14-15]。异氟烷气体麻醉大鼠并固定于脑立体定位仪上，暴露颅骨，确定2个定位点(第1定位点：前囟后5.2 mm，中线右侧1.0 mm，硬膜下9 mm；第2定位点：前囟后5.2 mm，中线右侧1.5 mm，硬膜下8.5 mm)并标记。轻缓钻透颅骨，用微量注射器抽取质量浓度为2 g/L的6-羟基多巴胺溶液(使用含0.2%抗坏血酸溶液配制)，每定位点注射3 μL，进针速度1 mm/min，注射速度1 μL/min，留针时间 5 min，退针速度1 mm/min，所有操作完成后缝合皮肤。假手术组采用相同定位及注射方式，注射同等剂量含0.2%抗坏血酸的生理盐水。模型制备手术后第7天，通过腹腔注射0.5 mg/kg阿扑吗啡(apomorphine，APO)，诱导其进行旋转测试判定PD模型大鼠的制备情况(记录30 min内平均旋转圈数> 7次/min表明模型合格)[16]。

1.4.3 跑台运动干预方案第1次旋转测试后，进行中低强度跑台运动干预。训练方案为：10 m/min，30 min/d，5 d/周(周六、日休息)，持续4周。假手术组和PD模型组正常饲养，不进行跑台干预。
1.4.4 旋转测试在跑台运动干预前、干预第10，20天3个时间点，用阿扑吗啡诱导PD模型组和跑台运动组的2组大鼠进行对侧旋转测试。
1.4.5 爬杆实验在跑台运动后第3，10，15，20天，通过爬杆实验考察3组大鼠运动及肢体协调能力。将长50 cm、直径 1 cm 的金属杆底端固定，并将塑料小球固定于顶端，为保证杆表面粗糙防止打滑，将杆身缠绕纱布。将大鼠头向下置于杆顶，同时双后肢置于球上，自然爬下的同时开始计时。当双前肢接触底端时，结束计时。实验前让大鼠先行适应性训练。
1.4.6 肠道样本采集在最后1次跑台运动结束后 24 h，待动物排便后立即将新鲜粪便装入离心管中，放入-80 ℃超低温冰箱保存。
1.4.7 TH阳性细胞免疫组化检测在最后1次跑台运动结束后24 h，各组取3只大鼠进行异氟烷气体麻醉，灌注，取脑黑质切片，置于柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复，PBS洗3次，5 min/次；切片放入体积分数3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，PBS洗3次，5 min/次；3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min；甩掉封闭液，滴加按比例配好的一抗(1∶500)，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗后滴加二抗(1∶200)，室温孵育50 min；PBS冲洗后滴加DAB溶液，显微镜下显色，自来水冲洗切片终止显色；苏木精复染，自来水洗返蓝，脱水透明，中性树胶封固；镜下观察，图像采集。
1.4.8 16S rDNA 基因扩增提取样本 DNA，并放入-80 ℃低温保存，干冰条件下运输寄送至检测机构(深圳华大基因股份有限公司)。取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应的融合引物配置PCR反应体系，选择V3-V4 区扩增。引物341F：ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG，806R：GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT。使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序。
1.4.9 生物信息学数据分析下机数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的Clean data方可用于后期分析；通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags；在给定的相似度下(通常按照97%为标准)将Tags聚成操作分类单位(operational taxonomic units，OTUs)，然后通过OTU与数据库比对，对OTU进行物种注释；基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析等，主要包括肠道菌群的Alpha多样性分析、分类学组成分析、Beta多样性分析及群落结构数据PLS-DA分析( Partial least squares discriminant analysis)。
1.5 主要观察指标 ①大鼠旋转测试指标；②爬杆实验指标；③脑黑质TH阳性细胞；④肠道菌群的OTU分析；⑤肠道菌群的Alpha多样性分析；⑥肠道菌群的分类学组成分析；⑦肠道菌群的Beta多样性分析；⑧肠道菌群群落结构分析。
1.6 统计学分析采用 SPSS 24.0 统计软件对各组样本数据进行处理，若计量资料服从正态分布，实验结果以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组内差异采用LSD-t检验。若资料不符合正态分布，采用Kruskal-Wallis检验。P < 0.05 时认为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经上海中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

PD是中枢神经系统常见的进行性疾病，由于其发病率不断升高及暂未发现适宜有效的治疗举措，已逐渐成为人们关注与讨论的热点。在医学研究方面，由于缺乏PD研究的模型系统，尚不清楚其发生和发展，也暂未有合适方法对PD进行有效治疗。当前的医学治疗通常以改善PD症状为主要治疗方式[17-18]。如在病情初始阶段使用左旋多巴[19]，配合使用多巴胺激动剂进行治疗[20]。但已有研究指出3-5年后，左旋多巴的疗效出现减退，并在治疗的5年和15年后，运动并发症的发生率可达到60%甚至更高[21-22]。
有研究表明，6-羟基多巴胺注射后24 h内即出现黑质多巴胺神经元变性，因大脑纹状体多巴胺系统被破坏，多巴胺受体失神经支配导致敏感性增高，此时应用多巴胺受体激动剂，如阿扑吗啡，可使大脑患侧兴奋作用占优产生健侧旋转，以此对PD症状进行量化，此方法也是判断6-羟基多巴胺诱导PD模型是否成功的金标准[23]。因此，课题组在干预前、干预第10，20天利用阿扑吗啡诱导大鼠旋转，以30 min内大鼠平均旋转圈数> 7次/min为造模成功指标。结果表明，造模后大鼠转圈数增加明显，PD模型组在4周后，旋转圈数依然符合标准，说明使用单侧黑质2点法脑注射6-羟基多巴胺诱导建立PD大鼠模型成功且相对稳定。与PD模型组同期相比，跑台运动组旋转圈数在干预第10，20天出现明显下降，说明运动可有效缓解PD模型大鼠多巴胺系统的损毁程度(表1)。结合爬杆实验的结果，与PD模型组同期比较，跑台运动组也在干预后第10天出现了爬杆时间明显缩短，并且效果持续至干预结束，说明运动可一定程度改善PD模型大鼠的行为学表现(表2)。为了进一步明确造模是否成功以及跑台运动对多巴胺能神经元的作用，使用免疫组化法检测了TH阳性神经元的表达情况。黑质TH是多巴胺合成的限速酶，其数量与多巴胺能含量有直接关联[24]。免疫组化结果显示假手术组可见密集、呈棕褐色的TH阳性细胞；与假手术组相比，PD模型组TH阳性细胞数量明显减少，存在多巴胺能神经元的死亡。而经过4周跑台运动的干预，改善了这一趋势，说明早期运动干预能促进多巴胺能神经元的表达，减缓6-羟基多巴胺对大鼠黑质多巴胺能神经元的毒性损伤程度(图1)。
人体肠道菌群结构复杂，数量庞大，参与机体的各类活动[25]。肠道菌群作为疾病治疗的新靶点与机体健康紧密相关。已有研究表明，肠道菌群失调会影响中枢神经系统，明显增加PD的患病概率[26]。HOUSER等[27]于2017年讨论了肠道菌群与PD之间的联系，认为PD起源于肠道，并以炎症为基础机制不断发展。SCHEPERJANS等[28]发现，PD患者肠道菌群中普氏菌(Prevotellaceae)的平均丰度较健康对照组减少了77.6%。除此之外，Hill-Burns等[29]在一项纳入了197例PD患者和130位健康人的研究中，发现了PD患者肠道菌群失调的特征，并指出该PD患者的肠道内的Bifidobacterium(双歧杆菌)、Christensenellaceae(克里斯滕森菌)、Tissierellaceae(铁丝菌)、Lachnospira(毛螺旋菌)、Lactobacillaceae(乳杆菌科)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)和Verrucomicrobiaceae(疣微菌科)的丰度显著变化。
值得关注的是，运动作为一种非药物干预手段，能够有效调节肠道菌群的分布，提高菌群多样性，促进肠道微生态平衡。越来越多的研究证明，通过运动的方式如转轮、跑台，游泳等均能对肠道菌群产生不同程度的影响[30-31]。尽管目前PD致病机制尚未明确，但可以确定PD的发生与肠道菌群失调具有紧密联系。已有证据表明将PD小鼠的粪便移植给健康小鼠，会导致健康小鼠出现不同程度的运动功能障碍，并且黑质-纹状体多巴胺与5-羟色胺含量下降[32-33]。在此背景下，此次实验选择了跑台运动作为研究的运动模型来探讨对PD的潜在价值，采用16s rDNA技术对各组大鼠的肠道微生物多样性进行研究，将获得的OTUs信息、Alpha多样性、Bate多样性等对样本进行分析，从肠道菌群层面分析跑台运动对PD的治疗效果。
首先，此次实验结果证实了运动可改变大鼠肠道菌群的丰度及比例。当肠道微生物丰度及多样性减少时，会使肠道黏膜向炎性状态转变，产生的炎性因子可能通过肠-脑轴对大脑产生影响从而导致PD的发生发展[34]。跑台运动组大鼠的菌群丰富度(OTUs)较PD模型组升高(图2)，并且在Alpha多样性分析中，Chao、Ace和Sobs指数都是反映菌群物种丰富度的重要指标。PD模型组大鼠肠道菌群丰度显著下降，通过跑台运动可一定程度改善由PD引起的肠道菌群丰富度及比例失调(图3)。在门水平下占主要比例的Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)与Proteobacteria(变形菌门)均发生显著性变化。如，PD模型组中Firmicutes/Bacteroidetes丰度比值较假手术组减少(图4A，图5A，表4)，表明肠道环境已经发生明显改变，且该比值升高很可能与认知障碍改善存在关联[35]。有意思的是，进一步分析发现在属水平下，Prevotella(普雷沃氏菌属)、Bacteroides(拟杆菌属)、Clostridium_XlV(梭菌属)等有益菌经跑台运动后有明显上升(图4B，图5B，表5)。Bacteroides产生的γ-氨基丁酸是基底神经节-丘脑-皮质环路中的重要神经递质，PD患者的γ-氨基丁酸表达均明显降低，进而影响了直接回路和间接回路的兴奋-抑制平衡[36-37]。因此，保护基底神经节γ-氨基丁酸能神经元对防治PD具有重要作用[38]。与此同时，有研究指出Prevotella丰度的升高可以提高黑质-纹状体中多巴胺含量，改善肠道通透性，而肠道通透性与α-突触核蛋白聚集、氧化应激等也有显著相关性[39]；Clostridium_XlV可产生具有抗炎作用的丁酸盐，其可以促进血脑屏障功能恢复，并可显著改善认知功能。运动干预使此类有益菌群上升，通过抑制炎症反应等避免多巴胺神经元凋亡，缓解PD相关症状[40-41]。以上结果提示，微生物-肠-脑轴很可能是PD发生发展的潜在机制，而通过早期中低强度的运动干预，可有效调节肠道菌群及其代谢物，并由血液运输至脑内从而间接地对中枢神经系统产生影响，一定程度改善PD病理症状。另一方面，运动也可能通过抑制炎症因子表达、降低氧化应激水平等直接影响中枢神经系统，缓解多巴胺能神经元的毒性损伤，从而间接改善肠道菌群环境。
此外，此次实验从样本微生物群落结构间的差异和相似性的结果中发现，假手术组与PD模型组间样本明显分开(图6 A)，说明PD造模对肠道菌群的群落结构产生了一定影响。值得一提的是，经过对跑台运动组大鼠的肠道菌群进行分析和比较，发现经跑台运动后其与假手术组的组间区域相接近，而与PD模型组区域相距较远，说明跑台运动对PD模型的肠道菌群结构具有明显改善作用(图6)。除此，对群落结构数据进行PLS-DA分析，也发现了类似规律，即3组各自类聚，其中跑台运动组对PD模型组菌群有一定的回调作用(图7)。
综上所述，跑台运动作为非药物和无创的治疗手段，在改善PD行为学异常、促进多巴胺能神经元的表达、调节肠道菌群结构组成及机体肠道微环境的稳态等方面具有积极的作用和独特的意义。此次研究通过16s rDNA 测序技术证实了跑台运动可明显改善PD模型的肠道菌群结构和丰度，改善的菌群涉及对PD患者具有重要调节作用的神经递质γ-氨基丁酸、黑质-纹状体多巴胺功能和肠道免疫炎症反应等。虽然肠道菌群失调与PD之间是如何进行双向环路调节的机制尚有待探究，但研究已证明跑台运动可通过调控肠道菌群为PD防治提供新策略。后期作者将扩大样本量，并针对运动训练的持续时间、运动强度进行更深入系统的研究，弥补此次实验存在的局限。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

跑台运动对帕金森病模型大鼠肠道菌群结构及多样性的影响

Effect of treadmill exercise on the structure and diversity of intestinal microflora in rats with Parkinson’s disease

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