C2神经酰胺对帕金森病模型鼠多巴胺能神经元的保护作用

doi:10.12307/2024.229

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (11): 1653-1659.doi: 10.12307/2024.229

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C2神经酰胺对帕金森病模型鼠多巴胺能神经元的保护作用

李家慧1，齐雪1，朱远峰1，禹璐1，刘立峰1，王鹏1，2

北华大学基础医学院，1人体解剖学教研室，2神经退行性疾病研究室，吉林省吉林市 132013

收稿日期:2023-03-10 接受日期:2023-03-24 出版日期:2024-04-18 发布日期:2023-07-26
通讯作者: 王鹏，博士，副教授，硕士生导师，北华大学基础医学院人体解剖学教研室，神经退行性疾病研究室，吉林省吉林市 132013
作者简介:李家慧，女，1998年生，吉林省吉林市人，汉族，北华大学在读硕士，主要从事帕金森病机制的研究。
基金资助:
吉林省自然科学基金(YDZJ202201ZYTS575)，项目负责人：王鹏；吉林省卫生与健康技术创新项目(2018J083)，项目负责人：王鹏；北华大学研究生创新项目(北华研创合字[2021]054)，项目负责人：李家慧

Protective effect of C2 ceramide on dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson’s disease

Li Jiahui1, Qi Xue1, Zhu Yuanfeng1, Yu Lu1, Liu Lifeng1, Wang Peng1, 2

1Department of Human Anatomy, 2Laboratory of Neurodegenerative Diseases, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China

Received:2023-03-10 Accepted:2023-03-24 Online:2024-04-18 Published:2023-07-26
Contact: Wang Peng, PhD, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China; Laboratory of Neurodegenerative Diseases, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China
About author:Li Jiahui, Master candidate, Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Beihua University, Jilin 132013, Jilin Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Jilin Province, No. YDZJ202201ZYTS575 (to WP); Jilin Province Health and Health Technology Innovation Project, No. 2018J083 (to WP); Postgraduate Innovative Project of Beihua University, No. [2021]054 (to LJH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经酰胺：作为神经鞘磷脂信号途径的第二信使，是细胞膜的脂质双分子层的基本结构元素，通过介导多种细胞生物学效应，直接参与信号系统，在调节细胞分化、增殖、凋亡及衰老等生命活动中具有重要的作用。
Alpha突触核蛋白：由同源染色体4q21上的SCNA基因编码，是相对分子质量14 000的可溶的且内在无序的酸性蛋白，其在帕金森病的发病机制中起着重要的作用，被认为是引发帕金森病病变的关键蛋白。
蛋白磷酸酶2A：是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由支架亚单位A、调节亚单位B及催化亚单位C三类亚单位组合而成，共包含约60种全酶。研究显示，蛋白磷酸酶2A可催化蛋白质的去磷酸化，参与体内多种酶及转录因子的调控，并在能量代谢、DNA损伤与修复、细胞周期调控和细胞信号转导等方面发挥着重要作用。

背景：C2神经酰胺可减少Alpha突触核蛋白(Alpha-Synuclein，α-Syn)寡聚体的形成，其作为蛋白磷酸酶 2A激动剂在中枢神经系统对细胞老化具有重要调节作用。

目的：探究C2神经酰胺对多巴胺能神经元的保护作用机制。
方法：将25只C57BL/6 系小鼠随机分为对照组、模型组及C2神经酰胺低、中、高剂量组，每组5只。除对照组之外，其他各组均通过左侧纹状体注射突变型 A53T α-Syn寡聚体建立帕金森病小鼠模型，在纹状体注射第30天后，3个C2神经酰胺各剂量组小鼠一次性经胃灌注溶于生理盐水中的各剂量C2神经酰胺(1，5，10 μg/g)，对照组及模型组同法灌注等量生理盐水，于造模后第30-90天，连续每天给药，共60 d，期间观察各组小鼠行为学变化。在纹状体注射第90天后，在适度麻醉条件下对各组小鼠灌注取脑，以免疫组织化学染色分析小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的变化，以ELISA法检测小鼠中脑α-Syn寡聚化和磷酸化水平，并分析影响α-Syn磷酸化的相关酶活性变化。

结果与结论：① C2神经酰胺对经纹状体注射的突变型A53T α-Syn寡聚体所导致的小鼠帕金森病样运动障碍具有改善作用，且C2神经酰胺高剂量组对帕金森病模型鼠运动障碍的改善作用更为明显(P < 0.01)；② 突变型A53T α-Syn寡聚体致使小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数目明显减少(P < 0.01)，而C2神经酰胺高剂量组黑质多巴胺能神经元数目则明显增多(P < 0.01)；③与模型组相比，C2神经酰胺高剂量组小鼠中脑内α-Syn寡聚体和磷酸化α-Syn水平明显降低(P < 0.01)，而神经酰胺的水平增高(P < 0.05)，蛋白磷酸酶 2A活力明显上调(P < 0.01)； ④上述数据说明，C2神经酰胺可通过改善小鼠中脑组织α-Syn的磷酸化修饰环境，缓解了由寡聚的α-Syn所诱导的神经毒性作用，保护了小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数量的减少，从而减轻帕金森病的运动障碍程度。

https://orcid.org/0009-0003-7176-3603(李家慧)；https://orcid.org/0000-0003-3781-3702(王鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: C2神经酰胺, 多巴胺能神经元, 帕金森病, Alpha突触核蛋白, 蛋白磷酸酶2A, 寡聚体, 磷酸化, 保护作用

Abstract: BACKGROUND: C2 ceramide reduces the formation of Alpha-Synuclein (α-Syn) oligomers as the protein phosphatase 2A agonist, which has an important regulatory effect on cell aging in the central nervous system.
OBJECTIVE: To investigate the protective mechanism of C2 ceramide on dopaminergic neurons.
METHODS: Twenty-five C57BL/6 mice were randomly divided into control group, model group, C2 ceramide low-, medium- and high-dose groups (n=5 per group). Except for the control group, a mouse model of Parkinson’s disease was established by injecting mutant A53T α-Syn oligomers into the left striatum in the other groups. On the 30th day after the striatal injection, three C2 ceramide groups were intragastrically administered with C2 ceramide (1, 5, 10 μg/g) dissolved in saline at one time, while the control and model groups were administered with the same amount of saline within 30-90 days after modeling, for a total of 60 days. Behavioral changes in each group of mice were observed during this period. On the 90th day after striatal injection, mouse brain tissue was extracted by perfusion under anesthesia, and the changes of dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra were analyzed by immunohistochemical staining. The levels of α-Syn oligomerization and phosphorylation in the midbrain of mice were detected by ELISA, and the changes of enzyme activities related to α-Syn phosphorylation were analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: C2 ceramide had an ameliorating effect on Parkinson’s disease-like dyskinesia in mice caused by the striatal injection of mutant A53T α-Syn oligomers. High-dose C2 ceramide showed better effects on dyskinesia in mice with Parkinson’s disease (P < 0.01). The mutant A53T α-Syn oligomers significantly reduced the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra of mice (P < 0.01), while the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra increased significantly in the C2 ceramide high-dose group (P < 0.01). The levels of α-Syn oligomers and phosphorylated α-Syn in the brain were significantly reduced in the C2 ceramide high-dose group compared with the model group (P < 0.01), while the level of ceramide was increased (P < 0.05) and the activity of protein phosphatase 2A was significantly upregulated (P < 0.01). To conclude, C2 ceramide can attenuate the neurotoxic effects induced by oligomerized α-Syn by the phosphorylation modification environment of α-Syn in mouse midbrain tissue and protect against the reduction in the number of nigrostriatal dopaminergic neurons in mice, thereby reducing the degree of dyskinesia in Parkinson’s disease.

Key words: C2 ceramide, dopaminergic neuron, Parkinson’s disease, alpha-synuclein, protein phosphatase 2A, oligomer, phosphorylation, protective effect

中图分类号:

李家慧, 齐雪, 朱远峰, 禹璐, 刘立峰, 王鹏. C2神经酰胺对帕金森病模型鼠多巴胺能神经元的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(11): 1653-1659.

Li Jiahui, Qi Xue, Zhu Yuanfeng, Yu Lu, Liu Lifeng, Wang Peng. Protective effect of C2 ceramide on dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(11): 1653-1659.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验中的25只C57BL/6 系小鼠在实验过程中无脱失，最终25只小鼠全部纳入结果分析。
2.2 小鼠一般情况左侧纹状体注射造模后第30天，模型组小鼠开始出现肢体轻微震颤、行动迟缓，个别小鼠表现为竖毛、后肢张开、背部上弓以及步态不稳等帕金森病样行为学改变。而在造模后第90天，C2神经酰胺高剂量组小鼠较模型组相比，震颤明显减轻，且未见竖毛及后肢张开等异常表现。
2.3 行为学评估在纹状体注射后的第30，60，90天，各实验组小鼠的爬杆实验结果均与对照组无显著性差异(P > 0.05)，见图2A。
悬挂实验和滚轴实验结果显示，注射后的第60天，模型组小鼠较对照组相比，出现运动能力的下降(P < 0.05)，随着造模时间的增加，第90天时，模型组小鼠运动能力较对照组相比明显降低(P < 0.01)。悬挂实验以检测小鼠上、下肢肌力为主要评分标准，滚轴实验则主要考察小鼠的反应能力及综合运动能力。结果表明，C2神经酰胺低剂量组(1 μg/g)
小鼠的运动能力与模型组相比无显著性差异，而中剂量组
(5 μg/g)小鼠在第90天时表现为较模型组运动能力的提升 (P < 0.05)。高剂量组小鼠(10 μg/g)则在第90 天时表现出较模型组相比更为明显的运动能力的恢复(P < 0.01)，其运动能力与对照组相比无显著性差异(P > 0.05)，见图2B，C。
平衡木实验的结果表明：注射后30 d，模型组小鼠较对照组相比出现平衡能力的下降(P < 0.05)，且在第60，90天，模型组小鼠平衡能力降低更为明显(P < 0.01)。而在C2神经酰胺各剂量组中，中剂量组小鼠在第90天时出现了较模型组小鼠能力提升(P < 0.05)，但仍表现为较对照组小鼠平衡能力的下降(P < 0.01)；高剂量组小鼠在造模第30天时，并未表现出与对照组小鼠相比运动能力的显著性差异(P > 0.05)，而在第60，90天时，均表现出与模型组小鼠相比更为明显的运动能力的恢复(P < 0.01)，见图2D。

2.4 小鼠黑质多巴胺能神经元数量变化免疫组织化学染色结果显示，模型组小鼠黑质内酪氨酸羟化酶染色阳性神经元数目较对照组相比显著下降 (P < 0.01)。在给予C2神经酰胺治疗后，低剂量组小鼠黑质内酪氨酸羟化酶染色阳性神经元数目与模型组比较无显著性差异(P > 0.05)，依旧与对照组酪氨酸羟化酶染色阳性神经元数目相差显著(P < 0.01)。但随着C2神经酰胺的剂量增加，给予每天一次性灌胃10 μg/g剂量的C2神经酰胺高剂量组小鼠黑质内酪氨酸羟化酶染色阳性神经元数目与对照组相比差异减小(P < 0.05)，且出现较模型组相比明显增多的酪氨酸羟化酶染色阳性神经元(P < 0.01)，见图3。

2.5 小鼠脑匀浆内α-Syn寡聚化和磷酸化水平以双抗体夹心ELISA法定量检测各实验组小鼠在第90天后，中脑内α-Syn的寡聚化和磷酸化水平。结果表明，模型组、C2神经酰胺低、中剂量组均检测到较对照组相比明显增高的α-Syn寡聚体含量(P < 0.01)，其中，C2神经酰胺中剂量组小鼠中脑内含有的α-Syn寡聚体水平较模型组有所降低(P < 0.05)，而随着剂量的增加，C2神经酰胺高剂量组小鼠中脑表现出较模型组明显减弱的寡聚化水平(P < 0.01)，与对照组寡聚化水平差异也有所缩小(P < 0.05)，见图4A。另外，并未在对照组中检测出发生Ser129磷酸化的α-Syn(pS-α-Syn)，而其他4组在小鼠中脑内均检测到较对照组相比明显增高的pS-α-Syn含量
(P < 0.01)，这当中，C2神经酰胺中剂量组pS-α-Syn浓度较模型组相比有所下降(P < 0.05)，而高剂量组中α-Syn发生磷酸化异常修饰的水平较模型组差异最大(P < 0.01)，见图4B。

2.6 小鼠脑匀浆内影响α-Syn磷酸化的相关酶活性变化与对照组相比，模型组、C2神经酰胺低剂量组小鼠脑匀浆内神经酰胺水平较对照组有所降低(P < 0.05)，抑制α-Syn磷酸化的酶PP2A的活力较对照组出现明显下降(P < 0.01)。随着C2神经酰胺剂量的增加，高剂量组小鼠脑匀浆内神经酰胺水平、PP2A的活力已与对照组并无显著性差异，表现出较模型组相比内神经酰胺表达水平的提高(P < 0.05)，以及PP2A活力的明显上升(P < 0.05)，见图5。

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引言

帕金森病是一种影响人体中枢及周围神经系统的与年龄相关的退行性疾病，以中脑黑质内嗜酸性包涵体——路易小体的形成以及多巴胺能神经元进行性缺失为主要病理变化[1-3]。
广泛存在于路易小体内发生错误折叠并聚集的Alpha突触核蛋白(α-Synuclein，α-Syn)在帕金森病的发病机制中起着重要作用，被认为是引发帕金森病的关键蛋白[4-6]。有报道称，虽然帕金森病通常以一种散发性疾病出现，但其中家族性的病例约占10%，基因突变与家族性帕金森病常染色体显性遗传密切相关[7-8]。且课题组前期已证实，家族型突变体A53T寡聚体在模型鼠体内表现出较强的神经毒性作用[9]。
虽然在各项实验研究中表明，众多因素都促进了上述α-Syn发生聚集，但丝氨酸(Serine，Ser)129位点的磷酸化被认为是在帕金森病病理条件下诱导α-Syn聚集的主要因素[10-12]。有研究称，在帕金森病患者尸检样本中检测到的路易小体中约90%的α-Syn在Ser 129处被磷酸化，而在正常大脑中只有约4%的α-Syn被磷酸化[13]。且研究表明这些磷酸化的α-Syn可促进毒性α-Syn寡聚体的形成[14]。另外，α-Syn的磷酸化受各种激酶的调控，包括丝氨酸/苏氨酸polo样激酶2 (polo-like kinase 2，PLK2)的调节[15-16]。有研究表明，PLK2能够在Ser-129位点特异性磷酸化α-Syn，而与其作用相反的蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)则会逆转上述蛋白激酶的磷酸化作用，是目前发现的惟一能使α-Syn去磷酸化的酶[17-18]。
神经酰胺作为神经鞘磷脂信号途径的第二信使，通过干预多种细胞途径，在细胞的分化、增殖、凋亡及衰老等生命活动中具有重要的作用[19-21]。有报道称，PP2A是神经酰胺的直接下游靶点之一，而α-Syn则作为PP2A的靶蛋白存在[22]，因此，其磷酸化模式与帕金森病的疾病进展密切相关。而C2神经酰胺则被报道对PP2A具有特异性的作用，通过激活PP2A以异三聚体形态存在，使其具有生物活性[23-24]。
迄今为止还没有研究能完整阐述清楚神经酰胺的调控与PP2A作用于α-Syn的确切分子病理学机制。已有研究证实，C2神经酰胺可减少毒性α-Syn寡聚体的形成[25]，但C2神经酰胺在体内所诱导的与病理性α-Syn磷酸化相关的分子机制仍未明确，以及其能否在体内减少路易小体形成、并通过进一步保护黑质多巴胺能神经元、减缓帕金森病的病程进展尚未得到研究证实。
因此，实验建立帕金森病动物模型，通过准确量化评估其运动能力，以免疫组织化学染色及ELISA等实验方法，证实C2神经酰胺对多巴胺能神经元的保护作用，并进一步阐述其参与调控α-Syn磷酸化的分子机制，以期进一步揭示疾病的发病机制，为临床提供控制帕金森病病程进展的有效措施。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，独立样本 t 检验，单因素方差分析和LSD-t事后检验。
1.2 时间及地点实验于2023年2月在北华大学基础医学院神经退行性疾病实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 C57BL/6 系小鼠，雄性，8周龄，体质量18-22 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证：SCXK (吉) 2020-0002。实验将动物采用随机数字表法划分每笼5只为一组，分别饲养于5个26 cm×18 cm×18 cm笼箱内，室内温度(22±2) ℃，相对湿度(55±5)%，12 h/12 h开关灯正常饲养。全部小鼠适应性行为训练7 d后，进行体质量测量和纹状体脑区注射等干预操作。实验中进行的所有动物相应实验操作和动物管理均经北华大学实验动物伦理学委员会批准(批准号：20210507)，批准时间：2021年5月。实验操作及过程遵循了全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC 281)《实验动物福利伦理审查指南》。
1.3.2 主要药品与试剂实验主要药品与试剂包括Anti-Alpha-synuclein antibody(ab52168；英国Abcam公司)、α-synuclein(phospho S129)pAb(ab51253；英国Abcam公司)、生物素化ab52168(中国北京康为世纪生物科技有限公司)、Tyrosine Hydroxylase Rabbit Monoclonal Antibody(中国上海碧云天生物技术公司)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(中国上海碧云天生物技术公司)、C2神经酰胺(纯度：≥99.0%，CAS No.3102-57-6；美国MCE公司)、PP2A Colorimetric Assay kit(美国GenMed Scientific公司)和Human ceramide ELISA kit (DRE12657；美国Rapidbio Biosource 公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组将小鼠随机分为5组，分别为对照组、模型组(5 μg突变型A53T α-Syn寡聚体，体积为2 μL)、C2神经酰胺低剂量组(5 μg A53T寡聚体+1 μg/g C2神经酰胺)、C2神经酰胺中剂量组(5 μg A53T寡聚体+5 μg/g C2神经酰胺)、C2神经酰胺高剂量组(5 μg A53T寡聚体+10 μg/g C2神经酰胺)，除对照组外，其他4组小鼠随机分组后立即进行纹状体注射造模，见图1。

1.4.2 纹状体注射制备帕金森病模型小鼠除对照组外，其他各实验组小鼠均采用左侧纹状体侧注射，每只注射5 μg突变型 A53T α-Syn寡聚体，体积为2 μL。小鼠用体积分数0.3%的戊巴比妥钠0.01 mL/g适度麻醉后，头颅水平位固定于RWD脑立体定位仪上，参照George Paxinos小鼠脑图谱，确定左侧纹状体的三维立体定向坐标位置，即以前囟点(Bregma点)为三维坐标系原点，距前囟冠状位中线向前0.8 mm(Y=2.0 mm)，前囟外侧缘旁开2.0 mm(X=2.0 mm)，距硬脑膜深约3.0 mm(Z=2.0 mm)，开骨窗，注射样品。术后小鼠包被保暖，清醒后置于笼内正常饲养。
1.4.3 给药处理方法在小鼠纹状体注射后的第30天，进行C2神经酰胺给药。参考现有文献中C2神经酰胺的使用方法及剂量[26]，并经预实验浓度筛选，选择向C2神经酰胺低、中、高剂量组分别一次性经胃灌注1，5，10 μg/g溶于生理盐水中的各剂量C2神经酰胺，对照组及模型组同法灌注等量生理盐水，连续每天给药至第90天，观察各组小鼠行为学变化。

1.4.4 模型鼠行为学评估实验在小鼠纹状体注射前、注射后的第30，60，90天由正式培训的实验工作人员通过双盲原则对模型鼠出现的运动障碍通过各项行为学实验进行评估。此部分实验参考该实验室已有研究方法，即评估爬杆实验(pole test)、悬挂实验(suspension test)、滚轴实验(rotorod test)和平衡木实验(beam balance test)来反映其肌力、平衡和协调能力的变化，需在正式评估实验前对小鼠进行适应性训练3 d，然后开始正式行为学检测。

(1)爬杆实验：选取直径为0.8 cm、长60 cm木杆，顶部置外覆纱布的防滑小木球，将小鼠放置于杆顶端，记录2个时间：即从开始运动到完全转为头向下的时间及其下到杆底的时间，爬杆实验以记录2个行动时间检测小鼠肌力及是否存在行动迟缓等运动障碍，测5次取平均值。
(2)悬挂实验：选取直径约1.5 mm水平电线，以小鼠用两后爪抓住电线，记3分；用一个后爪抓住电线，记2分；两后爪均抓不住电线，记1分为评分标准，计算总得分情况，以此评估小鼠肌力的损伤情况，测5次取平均值。
(3)滚轴实验：采用小鼠RotaRod转棒测试仪(Rotamex-5)，滚轴直径为6 cm，设定转速为20 r/min，记录小鼠停留在滚轴上的时间长短，评估小鼠的反应能力及综合运动能力的改变，连续测 20 次取平均值。
(4)平衡木实验：以两端木架支撑105 cm×4 cm×3 cm 长木杆，评估时，小鼠放在起始区面对鼠笼方向，训练3次后正式实验，记录小鼠走过起始区时间及小鼠走过整个平衡杆时间，以此评估小鼠的平衡和协调能力的改变，测3次取平均值。
1.4.5 免疫组织化学染色在小鼠纹状体注射后第90天，在以体积分数0.3%的戊巴比妥钠(0.01 mL/g)对小鼠进行适度麻醉后，将各组实验小鼠灌注取脑，制备脑组织冰冻切片。将组织切片放入体积分数0.3% Triton X-100的PBS中，4 ℃浸泡2-4 d，增加组织切片通透性。后续将组织切片在含有体积分数0.5% H2O2的PBS中处理30 min，去除组织中内源性过氧化物酶。在含体积分数1%山羊血清中封闭60 min后，加入以1∶1 000稀释的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)兔单克隆抗体(中国上海碧云天生物技术公司)，4 ℃反应过夜。次日，PBST冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记的的山羊抗兔IgG(1∶1 000，中国上海碧云天生物技术公司)，室温孵育2 h。将切片用Tris-HCl缓冲液漂洗后，放入含有DAB和H2O2的显色剂中显色。显色时，为确保显色效果，备好显微镜，先取一两张切片试显色，于显微镜下观察显色效果，确定最佳显色时间，再将其他切片放入显色剂里，完成全部显色。显色完成后，将切片移入Tris-HCl缓冲液中终止显色。最后，将漂浮切片贴附于玻片上，低温烤干，然后在不同体积分数的乙醇中逐次脱水(体积分数：70%，80%，90%，95%，100%)，每次5 min，移入二甲苯溶液中透明，3 min×3次，以中性树脂封固，晾干后，于生物显微镜(德国 Leica公司，型号：DM 1000，×200放大倍数)下统计中脑黑质组织内酪氨酸羟化酶神经元染色阳性细胞，对免疫组织化学染色结果拍照，每组记录5张照片，计数中脑黑质(黑质头、体部组织)中酪氨酸羟化酶染色阳性神经元数目。
1.4.6 α-Syn寡聚化及磷酸化的ELISA定量分析在96孔酶标板中用200 mmol/L的NaHCO3缓冲液将Anti-Alpha-synuclein antibody或α-synuclein(phospho S129)pAb稀释至终浓度为1 μg/mL，4 ℃孵育过夜。次日，以PBST冲洗后加封闭液，37 ℃孵育2 h。冲洗、晾干后，加入100 μL稀释后小鼠中脑组织匀浆样品，37 ℃孵育2 h。冲洗后以封闭液稀释生物素化ab52168(中国北京康为世纪生物科技有限公司)至终浓度1 μg/mL，37 ℃孵育2 h。再以封闭液按1∶5 000浓度稀释亲和素标记的碱性磷酸酶，37 ℃孵育1 h。冲洗后，向酶标板每孔加入100 μL pNPP反应液，37 ℃显色 30 min。以酶标仪于测定紫外线405 nm波长处的吸光度值。
1.4.7 小鼠脑匀浆内PP2A的活性检测依据组织PP2A活性比色法定量检测试剂盒操作指南，取500 mg小鼠中脑组织，以Reagent A清洗后移入液氮冻存管，过夜。次日取出，即刻用研磨棒碾碎组织成粉末状，加入预冷的Reagent B，充分混匀后，置于冰盒内孵育30 min，4 ℃，13 000 r/min离心，5 min，留存上清液，蛋白定量(Bradford法)，即刻放入-70 ℃下保存或置于冰盒内继续后续操作。准备待测样品和标准品，放入分光光度计中，于紫外线波长660 nm处检测吸光度值，构建PP2A活力标准曲线。获得样品背景磷浓度、样品总活性磷浓度、样品非特异活性磷浓度，以下列公式计算样品活性：标准曲线获得样品总活性或非特异活性磷浓度(μmol/L)-标准曲线获得样品背景磷浓度(μmol/L)×10(体系倍数)×样品稀释倍数/20(反应时间；min)=nmol/(mL·min)除以(样品蛋白浓度)mg/mL=nmol/(mg·min)。
1.4.8 脑匀浆内神经酰胺(Ceramide)的检测依试剂盒操作方法指南，进行标准品的稀释与加样，添加样品后，密封，置于37 ℃下，温浴30 min。洗涤后，每孔加入50 μL酶标试剂，37 ℃，30 min。再次洗涤后加入显色剂，37 ℃，15 min后，每孔加终止液，15 min内，在紫外线450 nm 波长依序测量各孔的吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①各组小鼠帕金森病样运动障碍的行为学观察与评估；②各组小鼠脑内黑质多巴胺能神经元的数目及形态；③各组小鼠脑匀浆内α-Syn寡聚化和磷酸化水平；④各组小鼠脑内影响α-Syn磷酸化的酶活性的变化。
1.6 统计学分析统计图表采用 Sigma-Plot软件(中国上海宸开网络科技有限公司)及Microsoft Excel 2010软件(中国微软有限公司)制作。采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，其他各项实验数据均以x±s表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t事后检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过北华大学生物统计学专家审核。

讨论

中枢神经系统内变性蛋白的异常聚集已被认为是神经退行性疾病发生发展的典型特征[27-29]。虽然有关帕金森病的临床表现及其病理变化的阐述已经较为明确，但有关帕金森病的发病机制学说依旧存有争议，这在一定程度阻碍了对帕金森病及时、准确的诊断和有针对性的治疗[30-31]。在众多有关帕金森病的发病机制的学说中，残基Ser129位点上磷酸化的异常修饰仍被大多数学者认为在调节α-Syn聚集和神经毒性中起关键作用[32-33]。研究表明，调节α-Syn磷酸化的酶于存在病理性路易小体的大脑中发生了表达和活性的变化，其潜在参与了有毒性α-Syn的聚集过程，加速了帕金森病的病程进展。例如，促进α-Syn磷酸化的PLK2在阿尔茨海默病和路易小体病患者的大脑中表达为上调；而负责α-Syn去磷酸化的PP2A活性在路易小体痴呆病例中表达水平降低[34]。所以，研究者们能否通过找寻到调节与上述α-Syn磷酸化密切相关的酶活性变化的机制通路，并以此为治疗靶点，降低帕金森病患者体内的磷酸化水平，减少帕金森病病变关键蛋白α-Syn的聚集，以达到延缓帕金森病病程进展的最终目的。
基于此，实验发现了被报道对PP2A具有特异性作用的C2神经酰胺，旨在阐明神经酰胺的调控与PP2A作用于α-Syn的分子病理学机制。过去的研究表明，α-Syn的异常聚集可以抑制一种可将葡萄糖基神经酰胺分解为葡萄糖和神经酰胺的溶酶体水解酶β-葡萄糖脑苷脂酶(β-Glucocerebrosidase，GCase)的活性，而GCase 活性的下降一方面使得细胞内出现溶酶体功能障碍，促使α-Syn发生进一步聚集，产生更大的神经毒性；另一方面又导致其分解产物神经酰胺的水平下降，由于神经酰胺是PP2A的天然激活剂，它的降低也削弱了PP2A的活性，从而间接促进了α-Syn的磷酸化，以产生更多具有神经毒性作用的α-Syn寡聚体[35-37]。而该研究以灌胃形式对通过纹状体注射突变型A53T α-Syn寡聚体的帕金森病模型小鼠进行C2神经酰胺日剂量的给药治疗，在造模结束后，分析小鼠中脑内α-Syn寡聚体和pS-α-Syn的浓度，更直观地展示了C2神经酰胺可减轻小鼠帕金森病病变关键部位，即小鼠中脑内α-Syn寡聚化和磷酸化水平。
为进一步证实C2神经酰胺是如何参与调控α-Syn磷酸化的分子机制，并影响帕金森病样病理特征及运动障碍的产生？实验通过检测小鼠中脑组织中PP2A的活性和神经酰胺的表达水平，阐明C2神经酰胺通过提升小鼠脑内神经酰胺的表达水平，激活PP2A的活力，从而降低小鼠脑内α-Syn寡聚化和磷酸化的异常修饰，改善了小鼠脑内易于α-Syn发生异常聚集的病理环境，缓解了由寡聚的α-Syn所诱导的神经毒性作用。该课题组前期的研究工作表明，致帕金森病患者脑内神经元发生异常死亡可能是由于α-Syn寡聚体的存在，并通过体外实验证实，在孵育体系中添加α-Syn寡聚体在大鼠脑原代神经元生长初期对其突起生长具有抑制作用[38]。而实验以C2神经酰胺为治疗关键，通过观察在造模及给药干预后，小鼠脑切片中残存黑质多巴胺能神经元的数目，证实了C2神经酰胺参与调节α-Syn病理性的异常修饰，减少了α-Syn寡聚体的生成，保护了黑质多巴胺能神经元，从而致使模型鼠出现帕金森病样运动障碍程度的减轻。
尽管该实验证实了C2神经酰胺对帕金森病模型鼠多巴胺能神经元具有保护作用，其参与调控的α-Syn磷酸化的分子机制也为阐述帕金森病复杂的发病机制学说提供证据，但C2神经酰胺的这种保护作用是否涉及其他的信号通路仍未可知。而神经酰胺作为鞘脂代谢的中心枢纽，也被更多的报道通过在细胞内积累参与神经变性的关键步骤，是导致神经退行性疾病和衰老与氧化应激的直接原因[39-41]。有研究表明，帕金森病患者的血浆表现为甘油磷脂和神经酰胺水平的改变，且与健康人群相比，帕金森病患者尸检脑样本中的鞘磷脂和神经酰胺表达水平出现升高[42]。
在临床分子生物学诊断标志物日益完善的今天，研究者们是否可以通过检测血液中与调控α-Syn磷酸化密切相关的各种酶活性变化，为帕金森病的早期诊断与鉴别诊断提供辅助诊断标准。截至目前，已有实验通过采用单分子计数方法，用3D打印显微镜检测分析了帕金森病患者大脑脊髓液中α-Syn的表达情况，证实了帕金森病患者脑脊液样本中存在与正常人群脊髓液样本的差异，但个体间的差异性和重叠性阻碍了脊髓液 α-Syn作为诊断辅助标志物的进一步应用[43-44]。另有学者通过探讨血浆内路易小体相关蛋白对帕金森病患者与健康人群的联合诊断价值，推测其作为一种非侵入性的生物学诊断标志物，帮助早期诊断帕金森病[45]。课题组后续也将进一步验证以神经酰胺及相关酶为早期诊断帕金森病的分子生物学诊断标志物的可能，以期对帕金森病进行早期的诊断和预防。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

C2神经酰胺对帕金森病模型鼠多巴胺能神经元的保护作用

Protective effect of C2 ceramide on dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson’s disease

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