2.1   差异表达蛋白质统计   从实验组血清中鉴定出1 027种蛋白质，相对于对照组，实验组血清中有89个差异蛋白质，其中显著性上调蛋白质有45种，显著性下调蛋白质有44种，见图2。根据Ratio比值大小得到的上、下调前20位的差异蛋白见表1。







2.2   差异蛋白质的 GO 功能富集分析   差异蛋白质GO 功能注释包含生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3个部分。根据 GO蛋白数量富集分析发现，在对参与生物学过程(BP)的蛋白质分析中，上述差异蛋白主要富集于：细胞形态发生的调控、细胞骨架组织、免疫应答的正向调节、肌动蛋白细胞骨架组织、免疫反应调节信号通路、B细胞介导免疫、整合素激活等生物过程；在对细胞组分(CC)的蛋白质分析中，上述差异蛋白主要富集于：肌动蛋白细胞骨架、黏附连接、皮质肌动球蛋白、细胞骨架、黏着斑、肌动蛋白丝束、收缩肌动蛋白丝束、应力纤维等细胞成分中；在对分子功能(MF)的蛋白分析中，上述差异蛋白主要富集于：信号受体结合、激酶结合、蛋白激酶活性、MAP激酶活性、整合素结合、转录因子结合、肌动蛋白丝结合、核激素受体结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、免疫球蛋白受体结合等分子功能。气泡图中仅显示了最显著富集的前20种分类的结果，见图3。



2.3   KEGG 通路富集分析    将KEGG通路作为单位，采用超几何检验，筛出与所有鉴定到蛋白质背景比较，在差异蛋白质中具有显著性富集的通路。结果显示实验组与对照组差异最显著的通路共90条，取最显著富集的前20种分类，同时涉及了MYLK，ZYX，VASP，ACTN4，ACTN1，ACTB，ILK，TLN1，FLNA，PRKCB，CDC42，MYL9等29个差异蛋白。32 条 KEGG 信号/代谢通路中粘着斑富集到 12种差异蛋白、志贺菌病富集到 11种差异蛋白，紧密连接、白细胞经内皮迁移均富集到 8种差异蛋白，Rap1信号通路、沙门氏菌感染、耶尔森菌感染均富集到 7种差异蛋白，血小板活化、上皮细胞的细菌侵袭均富集到6种差异蛋白，FcγR 介导的吞噬作用富集到 5种差异蛋白，催产素信号通路、中性粒细胞细胞外陷阱形成富集到 4种差异蛋白，血管内皮生长因子信号通路、人类免疫缺陷病毒1感染、促性腺激素释放激素信号通路、碳水化合物消化和吸收、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用均富集到 3种差异蛋白，逆行内源性大麻素信号传导、肌动蛋白细胞骨架的调节、病毒致癌富集到 2种差异蛋白。气泡图中仅显示了最显著富集的前20种分类的结果，见图4，表2。







2.4   PPI网络分析   通过PPI 网络可研究实验组与对照组的差异蛋白之间相互关系，并从蛋白互作网络分析发现共同差异蛋白中FN1，MAPK1，FGG，ACTN4，ACTB，FGA，CDC42，ACTN1，FGB，ILK等61种位于功能网络节点，其余蛋白均在网络边缘。同时这些共同差异蛋白互作网络涉及到细胞骨架组织、细胞形态发生的调控、免疫反应的激活、肌动蛋白细胞骨架组织、皮质细胞骨架组织、整合素激活等生物过程，见图5。

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脊髓型颈椎病是脊柱外科常见病，也是各型颈椎病中症状最重、预后最差的亚型，其好发于中老年人群，具有发病率高、呈年轻化趋势的特点，主要因素有先天性因素和退变性因素[1-3]。谭雄进[4]认为发育型颈椎管狭窄是脊髓型颈椎病的重要诱发因素，属于先天性因素。据报道，成年人群中4.9%患有颈椎管狭窄[5]，在脊髓型颈椎病患者中约41.0%患有发育性颈椎管狭窄[6]。由于发育因素引起的颈椎管腔狭窄导致脊髓在动态因素的作用下极易遭受压迫，诱发脊髓损伤加重，是诱发脊髓型颈椎病的重要危险因素[7]。因此，通过早期预测发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化以及早日筛查、诊断脊髓型颈椎病，对于提前做出预防具有重要意义。蛋白质是执行机体功能的基本单位，也是研究机体生理或病理变化的主要对象。诸多研究证实，蛋白质组学在研究疾病的早期诊断、分型、过程监测和分子机制等方面已取得重要的进展[8-10]。同位素相对标记与绝对定量技术(Tandem Mass Tag，TMT)是一种基于体外等重同位素标记的相对和绝对定量技术，也是近年来常用于不同样品中蛋白质和代谢物定量的高通量筛选技术[8]。课题组前期研究发现气虚血瘀证是脊髓型颈椎病各种中医证型中的主要证型[3]。然而，用于气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的早期诊断蛋白组学标志物未见相关报道。该研究旨在从差异蛋白质组学角度入手，采用TMT联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，以脊髓型颈椎病患者为研究对象，科学地探寻可用于揭示气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化过程中的早期诊断特异性血清生物标志物。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   回顾性病例分析。
1.2   时间及地点   选取2019年1月到2021年8月广西中医药大学第一附属医院骨科门诊或住院病房确诊为脊髓型颈椎病患者，同时在健康体检中心及“治未病”中心选取发育性颈椎管狭窄人群。
1.3   对象   选取中医辨证分型属气虚血瘀证脊髓型颈椎病者9例(实验组)，其中男4例，女5例，平均年龄(42.00±6.16)岁；气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄人群9例(对照组)，其中男4例，女5例，平均年龄(40.00±8.00)岁。两组受试者在性别、年龄方面均具可比性(P > 0.05)。
该临床研究的实施符合《赫尔辛基宣言》和广西中医药大学第一附属医院对研究的相关伦理要求(审批时间：2018-01-04)。参与试验的患者其家属对试验过程完全知情同意，在充分了解试验方案的前提下签署了“知情同意书”。
纳入标准：①年龄30-60岁；②脊髓型颈椎病参照中华外科杂志编辑部2018年制定《颈椎病的分型、诊断及非手术治疗专家共识》中关于脊髓型颈椎病的诊断标准[11]；③发育性颈椎管狭窄诊断标准参照Horne提出的LM/CD 比值
法[12]；④气虚血瘀证分型符合《中医病证诊断疗效标准》中颈椎病中医证候分类标准[13]；⑤近期无炎症感染；⑥纳入的病例均经2位脊柱外科医师共同确诊；⑦愿意参与该项研究者。
排除标准：①合并肝肾疾病、心脑血管、呼吸系统或精神病等的患者；②合并血液病、糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤等的患者；③合并各类型骨性关节炎的患者。
1.4   材料   
1.4.1   试剂   TMT试剂盒、BCA试剂盒、2-D Quant试剂盒、TMT标记试剂、PAGE银染试剂盒、二硫苏糖醇(DTT)、三氯乙酸(TCA)、乙晴(ACN)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、四乙基溴化铵(TEAB)、过硫酸铵(APS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、碘乙酰胺(IAM)、核酸纯化柱 (Strata X Spin Column)、甲酸(FA)。
1.4.2   仪器   常温离心机、水平震荡仪、多用途旋转摇床酶标仪购买于北京菁美瑞科技有限公司；肽段定量仪、扫描仪、真空浓缩仪购买于北京创世云博科技发展公司；自动化固相萃取仪、液相色普仪购买于北京普源精电科技有限公司；CBS-B程控多功能全自动部份收集器购买于上海沪西分析仪器公司；NanoLC 1000的纳升级高效液相、上样柱、组合式质谱仪、分析柱购买于Thermo公司；Mini-PROTEAN® Tetra 电泳槽、PowerPac™ Basic电泳仪电源购买于Bio-rad公司。
1.5   方法   
1.5.1   样品的采集与保存   在早晨(8：00-10：00 am)采集研究对象空腹(至少12 h)静脉血4.0-5.0 mL，4 ℃放置1 h，3 000×g 离心15 min，收集上清液，分装后置于-80 ℃冰箱冻存备用。
1.5.2   蛋白提取   血清样品从-80 ℃冰箱中取出，4 ℃，18 000×g，10 min离心，清除细胞碎片，转移上清液。取上清液10 µL，稀释10倍后，从中取5 µL稀释液，参照BCA 试剂盒操作要求完成血清蛋白浓度测定。取600 µL蛋白原液分2次加入高丰度柱中，涡旋，混匀。参照高丰度蛋白去除试剂盒Pierce™ Top 14 (Thermo Scientific)操作要求完成去除高丰度蛋白，见图1。

1.5.3   胰酶酶解   各样品均取600 μL蛋白上清液进行酶解，加入适量标准蛋白，通过加入裂解液将调整为等体积，加入3 μL 1 mol/L DTT将终浓度调整为5 mmol/L，经56 ℃还原反应30 min。600 μL样品蛋白中加入12 μL 11 mol/L IAM，室温避光孵育15 min。烷基化后，各样本转移至不同的超滤管中，室温12 000×g，离心20 min；先经过8 mol/L 尿素置换3次，再经过buffer置换尿素3次，然后加入胰蛋白酶(蛋白酶∶蛋白=1∶50)，酶解过夜。室温12 000×g，离心10 min，第1次回收肽段，再用超纯水第2次回收肽段，最终合并两次肽段溶液。
1.5.4   TMT标记   已胰酶酶解的肽段通过Strata X C18(Phenomenex)除盐后，并真空冷冻干燥。以0.5 mmol/L buffer溶解肽段，参照TMT试剂盒操作说明进行肽段标记。操作如下：根据300 μg肽段加入10 μL ACN的比例，制备TMTpro-12标记溶液。取10 μL TMTpro-12标记溶液加入25 μg肽段溶液中，制成0.7 g/L肽段溶液，涡旋、混匀，室温孵育2 h；已标记的肽段混合后，除盐以及真空冷冻干燥。
1.5.5   高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)分级   肽段用高pH反相HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18(5 μm粒径，4.6 mm 内径，250 mm长)。操作如下：250 μg肽段(约666 μL)加入330 μL buffer A溶液(98%纯水+2%ACN)，最终补足1 mL 。涡旋混匀，室温离心，18 000×g，5 min；1 mL肽段溶液注入高效液相色谱仪，关闭入口环。肽段分级梯度为8%-32% ACN pH 9，先60 min时间内分离出60个组，再将肽段合并为9个组，合并后真空冷冻干燥。
1.5.6   液相色谱-质谱联用分析   肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系统进行分离。流动相A水溶液(0.1%FA和2% ACN)，流动相B水溶液(0.1%FA和90% ACN)。液相梯度设置：0-36 min，7%-23% B；36-52 min，23%-32% B；52-56 min，32%-80% B；56-60 min，80% B，流速维持在500 nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进Q Exactive™ HF-X质谱进行分析。
1.5.7   质谱数据搜库   采用MaxQuant分析MS/MS 数据以及对SwissProt人类数据库和反向诱饵数据库进行搜索。根据伪发现率(FDR) < 0.01 的标准筛选数据，以获得高度可信的定性结果。
1.6   统计学分析和生物信息学分析   采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料使用χ2 检验；P < 0.05则差异有显著性意义。使用1.3倍变化或0.83倍和 Wilcoxon 检验(P < 0.05) 阈值确定差异表达蛋白；采用 UniProt GOA 生成基因本体(GO)注释以及京都基因和基因组百科全书(KEGG) 数据库进行富集途径分析；在STRING数据库(v.10.5)中构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)(置信分数 > 0. 7)。

3.1   既往研究的不足及此次研究的局限性   多数研究者认为颈椎钩椎关节、小关节肥大、黄韧带肥厚、椎间盘突出等因素形成的机械性压迫与缺血性改变是构成脊髓型颈椎病脊髓损伤的病理生理基础[14]。慢性受压与反复损伤可影响脊髓灌注充盈度，改变微血管循环，增加血管通透性，释放炎性递质与其他毒性蛋白到髓内实质，诱发继发性炎症反应，从而损伤颈髓功能[15]。同时由于胶质细胞代谢率较高而易损伤，胶质细胞过度活化，白质区会出现胶质瘢痕形成、脱髓鞘现象、灰质萎缩、轴突变性，上述因素是引发脊髓型颈椎病临床症状的主要原因[16]，但其具体的发病机制尚不完全清楚。在动物实验层面，目前多采用拧入螺钉压迫法、套管球囊压迫法、膨胀材料压迫法等制作脊髓型颈椎病模型，但各种制作方法仍存在着明显的不足之处，无法完全复制人的真实发病情况[17]。因此，目前还没有任何一种动物模型可以复制发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的真实病理过程，更无法在动物层面揭示其转化的分子作用机制。
在1956年，由WOLF BS FAU-KHILNANI 等[18]首次提出了颈椎前后矢状径的大小与颈髓压迫症具有密切相关性。张耀等[7]发现发育因素引起的颈椎管腔狭窄导致脊髓在动态因素的作用下极易遭受压迫，诱发脊髓损伤加重，是诱发脊髓型颈椎病的重要危险因素。作者前期研究发现常规的中立位MRI联合动态MRI检查将会更早期发现脊髓型颈椎病[19]，同时发现屈伸位颈椎 MRI扫描可以更详细地显示颈椎管及其周围结构的对颈脊髓的影响情况，上述发现为临床中发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病的演变机制提供了影像学依据[20]。然而，目前业界对发育性颈椎管狭窄与脊髓型颈椎的相关性研究主要集中于解剖学及影像学层面[21-22]。此次研究首次从人体蛋白质组学角度探讨前者向后者转化的分子生物机制，仍存在一些不足之处。虽然TMT定量是目前在定量蛋白质组学中应用最广泛的技术，但它仍有生物学上的局限性。例如，TMT试剂可以标记所有的蛋白质，并且很容易被样品和缓冲液中的杂质污染。此次研究的样本相对较小，对于性别和年龄比较可能由于样本量少而导致结果存在一定偏倚；此外，研究缺乏生分子学验证，使实验结果的可信度受到影响。TMT检测相关试剂价格较昂贵，不利于临床推广使用。尽管有这些限制，此次研究结果初步探讨了发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的分子生物学机制，为进行早日筛查、诊断、精准靶点干预脊髓型颈椎病提供了理论依据。
3.2   研究的意义   通过分析发育性颈椎管狭窄人群和脊髓型颈椎病患者的血清蛋白组的相关差异，寻求发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化相关的特异性蛋白，上述这些潜在的血清蛋白学特异性标志物可以用于脊髓型颈椎病早期预测，为预防发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化提供分子生物学依据，也为提高脊髓型颈椎病的临床防治水平奠定基础。
此次实验采用TMT 联合LC-MS/MS 技术发现了89种与发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的发病机制显著相关的共同差异蛋白，这极其可能是发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化过程中的特异性血清生物标志物。通过KEGG通路注释已获取到与29种主要差异蛋白相关的20条KEGG信号/代谢通路。上述这些显著性差异蛋白主要集中在粘着斑、志贺菌病紧密连接、白细胞经内皮迁移、Rap1信号通路、沙门氏菌感染、耶尔森菌感染、血小板活化、上皮细胞的细菌侵袭、FcγR介导的吞噬作用、催产素信号通路、中性粒细胞细胞外陷阱形成、血管内皮生长因子信号通路、促性腺激素释放激素信号通路、人类免疫缺陷病毒感染1、碳水化合物消化和吸收、AGE−RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、逆行内源性大麻素信号传导、病毒致癌、肌动蛋白细胞骨架的调节等信号通路上，从而揭示气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的病理机制有可能是通过上述信号通路径来发挥调控作用的。
ILK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是细胞与胞外基质相互作用的效应器，能与整合素相互作用，可作为整合肌动蛋白细胞骨架连接和整合素介导的信号转导的中介物，从而对细胞的生长、分化、迁移等起着重要的调控作用[23]。脊髓损伤后导致损伤轴突再生失败的主要原因之一是神经胶质瘢痕的形成。ILK是神经系统损伤后抑制神经胶质瘢痕形成的潜在靶点，在树突状形成过程中，ILK直接磷酸化GSK-3，从而抑制其信号传导，除了其激酶活性外，ILK还可以通过其作为支架蛋白的功能来启动信号转导[24]。ILK也是调节转化生长因子β1信号通路的关键激酶，并与烧伤创面的早期愈合以及后期瘢痕形成有密切关系，当ILK表达上调时可介导相关细胞黏附以及创面细胞信号传递，从而达到促进表皮干细胞增生、器官组织纤维化的作用[25]。在此次研究观察到实验组中ILK表达上调，说明随着气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化，机体处于一种相对应激状态，ILK在脊髓型颈椎病的发病中可能发挥了神经胶质瘢痕形成、软组织纤维化等作用，也可能参与了促进黄韧带肥厚、椎间盘变性、脊髓损伤等病理过程。因此作者推测ILK有可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化早期的诊断标志物。
脊髓缺血损伤可能早期诱发严重凝血功能亢进，因凝血因子大量释放进而引起高凝状态，最终促使凝血因子大量消耗[26]。Fg是凝血因子Ⅰ，由 Aα，Bβ，γ 3 条多肽链构成，且分别对应 FGA，FGB 和 FGG 3个基因编码，也是血浆中含量最高的凝血因子，可以调节纤维蛋白原和凝血因子ⅩⅢ 的量，因此它在凝血和止血过程中均发挥了不可替代的作用[27]。FN1是一种纤维连接蛋白，在细胞黏附、分化、伤口愈合、凝血等过程中发挥了重要的作用。当血管硬化程度的上升时FN1表达量呈现明显地下调趋势，由于血浆 FN1缺乏可促使血管的完整性和增加通透性遭受破坏，最终引起血浆大量外渗，血液浓缩，黏度增加，使有效循环血量进一步减少[28]。纤维连接蛋白和ATP的释放可能刺激脊髓星形胶质细胞增殖，纤维粘连蛋白增加P2Y1的表达将为ATP提供更多的位点，从而加剧脊髓星形胶质细胞的增殖和炎症[29]。由此可推测，由于颈部脊髓血管硬化以及血液高凝状态，可能造成颈髓缺血，释放炎性递质与其他毒性蛋白到髓内实质，诱发继发性炎症反应，从而损伤颈髓功能。此次研究发现FGA，FGB，FGG，FN1均显著下调，主要富集于催产素信号通路，中性粒细胞细胞外陷阱形成，肌动蛋白细胞骨架的调节等信号通路。说明FGA，FGB，FGG，FN1在气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化过程中发挥损害脊髓微循环的作用。可以推测FGA，FGB，FGG，FN1有可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的特异性蛋白标志物。
CDC42是Rho家族蛋白的一种小GTP酶，CDC42活化后可调节Actin聚集或解聚，影响软骨细胞骨架的聚合，参与了软骨发生、细胞的增殖、肥大及凋亡，调节生后骨骺软骨的发育[30]。CDC42可以通过PAK4和 cofilin调控前体细胞的细胞骨架和伪足，影响破骨细胞的分化和形成，CDC42的缺失阻碍了细胞迁移与融合，最终导致破骨细胞分化过程受阻和发育不成熟[31]。有研究发现CDC42在骨关节炎的发生发展中起关键作用，可作为骨关节炎的诊断标志物之一[32]。此次研究已排除了各类型骨关节炎、免疫性疾病、精神疾病患者。两组患者在性别、年龄方面没有差异，排除了各类型骨关节炎对研究结果的影响；研究发现CDC42显著上调，说明CDC42参与了气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的过程。CDC42在神经系统中广泛存在，被认为是一个重要的树突分支和突触可塑性的催化剂。研究表明，CDC42参与细胞骨架-肌动蛋白解聚，诱导伪装丝足的快速形成等过程，从而减少树突棘的密度和体积，树突棘失调与神经系统疾病有关[33]。ROCK蛋白是一种Ras相关单体GTP酶，在Rho/ROCK 信号通路与轴突导向及生长过程的相关研究中，CDC42与Rac是目前了解最清楚2种。研究表明，CDC42和 Rac 能够通过调控肌动蛋白发挥促进轴突生长和稳定的作用[34]，也可抑制神经外生并诱导轴突生长束回缩，抑制轴突再生[35]。在神经系统方面的生物学功能中，Rap 信号通路发挥了重要的调控作用。Rap属于Ras家族，含有Rap1和Rap2两个亚类，Ras和Rap均能共同调控神经突触可塑性的形成，进而发挥神经功能修复的作用，而 Rap1活性在马神经元中具有极性特征，可控制神经突形成轴突[36]。此次研究发现CDC42显著上调，主要显著富集于粘着斑、志贺菌病、紧密连接、Rap1信号通路、白细胞经内皮迁移、耶尔森菌感染、上皮细胞的细菌侵袭、FcγR 介导的吞噬作用、血管内皮生长因子信号通路、沙门氏菌感染、促性腺激素释放激素信号通路、AGE−RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用。说明随着气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化，CDC42在脊髓型颈椎病的发病中可能发挥着影响破骨细胞分化、成熟的过程以及对神经树突的可塑性产生损伤作用，可能加剧了颈椎钩椎关节、小关节增生以及脊髓损伤等病理过程。由此，可以认为CDC42可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的特异性蛋白标志物。
在中枢神经系统损伤性疾病发展过程中，炎症反应对神经再生、突触形成发挥了重要的作用。ACTN1，ACTN4，ACTB均是肌动蛋白交联蛋白家族的重要成员。ACTN1在调控细胞运动的速度、片状伪足的动力机制以及定向迁移等方面发挥了重要的作用，在ACTN1由整合素激活下，其上调与炎性细胞迁移有关[37]。ACTN4可参与细胞骨架重组、细胞形态变化、胞质分裂及细胞黏附，并促进骨肿瘤细胞的迁移及侵袭[38]。另外，ACTN4的表达受核因子κB信号通路调控，在细胞浆内与肌动蛋白相结合后，可以介导细胞突触形成[39]。实验结果显示ACTN1，ACTN4表达量上调，两者均主要显著富集于黏着斑、志贺菌病、白细胞经内皮迁移、紧密连接等4条信号通路。说明ACTN1，ACTN4在发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的病理过程中通过有效调控炎症作用可影响神经再生、突触形成。因此推测ACTN1，ACTN4可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的特异性蛋白标志物。
ACTB是一种脑微血管内皮细胞骨架蛋白的重要构成成分，它主要存在于真核细胞中，主要参与聚合的转化形式、染色质结构和基因转录的调控以及对 mRNA 的加工和运输过程[40-41]；ACTB还参与了联接和定位、神经生长和重建以及突触转运的过程[42]。目前 ACTB 在发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的病理机制尚未见于报道。此次研究结果发现与对照组相比，脊髓型颈椎病患者中ACTB蛋白表达呈显著上调趋势，且ACTB主要显著富集于黏着斑、志贺菌病、紧密连接、白细胞经内皮迁移、沙门氏菌感染、Rap1信号通路、耶尔森菌感染、血小板活化、上皮细胞的细菌侵袭、催产素信号通路等10条信号通路上，表明发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化过程中相关蛋白质的生成及代谢可能发生紊乱或障碍。由此推测，ACTB可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的特异性蛋白标志物，但其作用机制尚需进一步研究阐明。
综上所述，此次研究采用 TMT 联合LC-MS/MS 的蛋白质组学技术，寻找到ILK，FGA，FGB，FGG，FN1，CDC42，ACTN1，ACTN4，ACTB等 89种与气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化有关的差异表达蛋白，上述这些蛋白涉及到了脊髓型颈椎病相关的骨生成与破坏系统、神经系统、凝血系统、细胞炎症等系统，最终明确了ILK，FN1，CDC42，ACTN4有可能是气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化过程中的特异性血清标志物。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：

同位素相对标记与绝对定量技术(Tandem Mass Tag，TMT)：由Thermo Scientific公司推出的一种同量异序化学标签，是通过串联质谱实现对多种不同样品中的蛋白进行同步鉴定和定量的有力工具，其具有高通量、高灵敏度、良好的重复性、低系统偏差和低噪声信号水平等优点，现已被认为是定量蛋白质组学研究领域中常用的高通量筛选技术。
发育性颈椎管狭窄：在1964年Hinck等首次提出的发育性颈椎管狭窄的基本概念，是指在颈椎的发育过程中，由于某些机体内外因素促使椎弓发育过短，椎管矢状径狭窄，这类患者容易遭受神经压迫和功能丧失，现已被确定为是诱发脊髓型颈椎病的重要危险因素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

由于发育因素引起的颈椎管腔狭窄导致脊髓在动态因素的作用下极易遭受压迫，诱发脊髓损伤加重，是诱发脊髓型颈椎病的重要危险因素。因此，通过早期预测发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化以及早日筛查、诊断脊髓型颈椎病，从而提前做出预防具有重要意义。#br#

蛋白质是执行机体功能的基本单位，也是研究机体生理或病理变化的主要对象。诸多研究证实，蛋白质组学在研究疾病的早期诊断、分型、过程监测和分子机制等方面已取得重要的进展。同位素相对标记与绝对定量技术(Tandem Mass Tag，TMT)是一种基于体外等重同位素标记的相对和绝对定量技术，也是近年来常用于不同样品中蛋白质和代谢物定量的高通量筛选技术。课题组前期研究发现气虚血瘀证是脊髓型颈椎病各种中医证型中的主要证型。然而，用于气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化的早期诊断蛋白组学标志物未见相关报道。该研究旨在从差异蛋白质组学角度入手，采用TMT联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，以脊髓型颈椎病患者为研究对象，科学地探寻可用于揭示气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄向脊髓型颈椎病转化过程中的早期诊断特异性血清生物标志物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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