骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

doi:10.12307/2024.156

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 2953-2959.doi: 10.12307/2024.156

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骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

龙智生，龚飞鹏，温家宾，闵欢，舒阳，赖卓玺，陈钢

江西省人民医院，南昌医学院第一附属医院骨科，江西省南昌市 330006

收稿日期:2023-04-22 接受日期:2023-05-25 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-25
作者简介:龙智生，男，1983年生，湖南省娄底市人，汉族，副主任医师，在职博士，主要从事骨组织工程再生研究、脊髓损伤修复。
基金资助:
国家自然科学基金项目(32060222)，项目负责人：龙智生；江西省中医药管理局课题(2021B018)，项目负责人：龙智生；江西省卫生健康委课题(202310014)，项目负责人：龙智生

Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes combined with epigallocatechin-3-gallate in treatment of spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats

Long Zhisheng, Gong Feipeng, Wen Jiabin, Min Huan, Shu Yang, Lai Zhuoxi, Chen Gang

Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital, Nanchang Medical College, Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Received:2023-04-22 Accepted:2023-05-25 Online:2024-07-08 Published:2023-09-25
About author:Long Zhisheng, Associate chief physician, MD, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital, Nanchang Medical College, Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 32060222 (to LZS); Project of Jiangxi Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 2021B018 (to LZS); Project of Jiangxi Provincial Health Commission, No. 202310014 (to LZS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

内质网应激：葡萄糖/营养素缺乏、蛋白质糖基化抑制、二硫键形成障碍、蛋白质转运异常、Ca2+耗竭等刺激均可导致内质网功能失调，即内质网应激。
茶多酚：别名茶蹂质、茶单宁，经非发酵程序从绿茶的叶中加工而成，是茶叶中儿茶素类、丙酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称，约占绿茶干质量的30%。它是一种稠环芳香烃，属黄烷醇类，主要成分包括儿茶素、黄酮、黄酮醇类、花青素类、花白素类、酚酸及缩酚酸类。

背景：研究表明，抑制内质网应激所致的细胞凋亡能够挽救神经部分功能。茶多酚能抑制内质网应激，但是存在生物利用率差不易透血脑屏障等问题，结合外泌体靶向脊髓修复及高效载药，理论上两者结合能够发挥更优的脊髓保护效能。

目的：探讨茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体对脊髓缺血再灌注损伤大鼠神经功能及内质网应激的影响。
方法：SD雄性大鼠50只，随机分为假手术组、模型组、茶多酚组、外泌体组、联合治疗组，每组10只，除假手术组外，其余4组制作脊髓缺血再灌注损伤模型，术后2 h经尾静脉注射生理盐水、外泌体、茶多酚、茶多酚+骨髓间充质干细胞外泌体混合液；脊髓损伤后7，14，28 d进行BBB神经功能评分，脊髓损伤后14 d，取脊髓组织进行苏木精-伊红染色、尼氏染色、ATF6和GADD153内质网应激标志物免疫荧光染色。

结果与结论：①神经功能评分：与假手术组比较，模型组、外泌体组、茶多酚组、联合治疗组神经功能评分均不同程度下降，术后14 d联合治疗组神经功能评分优于茶多酚组、外泌体组、模型组(P < 0.05)，术后28 d后联合治疗组神经功能评分优于模型组和茶多酚组(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色和尼氏染色显示：模型组大鼠神经元细胞数量减少，脊髓损伤区域内大量空洞坏死及瘢痕增生，茶多酚组、外泌体组、联合治疗组神经元数量和周边空洞坏死有不同程度改善，联合治疗组改善最为明显；③内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达：术后14 d联合治疗组GADD153表达低于模型组和茶多酚组(P < 0.05)，联合治疗组ATF6表达低于模型组、外泌体组和茶多酚组(P < 0.05)；④结果表明：茶多酚联合骨髓间充质干细胞外泌体能改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的神经功能，可能与抑制内质网应激相关蛋白ATF6、GADD153表达有关。

https://orcid.org/0000-0003-4899-6049 (龙智生)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脊髓损伤, 外泌体, 间充质干细胞, 茶多酚, 内质网应激, 细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Studies have exhibited that inhibiting apoptosis caused by endoplasmic reticulum stress can save part of nerve function. Epigallocatechin-3-gallate can inhibit endoplasmic reticulum stress, but it has poor bioavailability and is difficult to penetrate the blood-brain barrier. In combination with exosomes targeting spinal cord repair and high-potency drug loading, theoretically, the combination of the two can play a greater role in spinal cord protection.
OBJECTIVE: To investigate the effects of epigallocatechin-3-gallate combined with bone marrow mesenchymal stem cell exosomes on endoplasmic reticulum stress and neurological function in rats with spinal cord ischemia/reperfusion injury.
METHODS: Fifty SD male rats were randomly divided into sham surgery group, model group, epigallocatechin-3-gallate group, exosome group, and combined treatment group, with 10 rats in each group. The spinal cord ischemia/reperfusion injury model was made in the other four groups except for the sham surgery group. Local injection of physiological saline, exosomes, epigallocatechin-3-gallate, epigallocatechin-3-gallate + bone marrow mesenchymal stem cell exosomes was performed 2 hours after surgery through a caudal vein. Neurological function scores were performed on 7, 14 and 28 days after spinal cord injury. 14 days after spinal cord injury, hematoxylin-eosin staining, Nissl staining, and immunofluorescence staining of endoplasmic reticulum stress markers such as ATF6 and GADD153 were performed in the spinal cord tissues.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the sham surgery group, neurological function scores of the model group, exosome group, epigallocatechin-3-gallate group and combined treatment group all decreased to different degrees. The neurological function score of combined treatment group was better than that of the epigallocatechin-3-gallate group, exosome group and model group 14 days after surgery (P < 0.05). The neurological function score of the combined treatment group was better than that of the model group and epigallocatechin-3-gallate group 28 days after surgery (P < 0.05). (2) Hematoxylin-eosin staining and Nissl staining displayed that the number of neurons in the model group decreased, with a large number of cavity necrosis and scar hyperplasia in the spinal cord injury area. The number of neurons and peripheral cavity necrosis improved to varying degrees in the epigallocatechin-3-gallate group, exosome group, and combined treatment group, with the most significant improvement in the combined treatment group. (3) The expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins ATF6 and GADD153: 14 days postoperatively, the expression of GADD153 in the combined treatment group was lower than that in the model group and epigallocatechin-3-gallate group (P < 0.05), and the expression of ATF6 in the combined treatment group was lower than that in the model group, exosome group, and epigallocatechin-3-gallate group (P < 0.05). (4) These findings confirm that epigallocatechin-3-gallate combined with bone marrow mesenchymal stem cell exosome can enhance the neurological function in rats with spinal cord ischemia/reperfusionn injury, which may be associated with the inhibition of the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins ATF6 and GADD153.

Key words: spinal cord injury, exosome, mesenchymal stem cell, epigallocatechin-3-gallate, endoplasmic reticulum stress, apoptosis

中图分类号:

龙智生, 龚飞鹏, 温家宾, 闵欢, 舒阳, 赖卓玺, 陈钢. 骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 2953-2959.

Long Zhisheng, Gong Feipeng, Wen Jiabin, Min Huan, Shu Yang, Lai Zhuoxi, Chen Gang. Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes combined with epigallocatechin-3-gallate in treatment of spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 2953-2959.

图/表（结果） 7

2.1 骨髓间充质干细胞形态第3代骨髓间充质干细胞呈梭形改变，生长状态良好，见图1A。免疫荧光检测特异标记物对间充质干细胞进行鉴定，可见其CD90表达明显，见图1B。

2.2 BMSCs-Exo鉴定结果 BMSCs-Exo颗粒直径大小为100 nm左右，外泌体颗粒物浓度为6.0×106个/mL，透射电镜下呈圆盘状，中间凹陷，与对照组比较，外泌体的特异性标记物CD63和TSG-101表达显著升高，见图2。

2.3 实验动物数量分析实验共纳入50只SD大鼠，每组10只，中途因出现麻醉过量、出血、术后感染及原因不明等造成8只大鼠死亡，重新补充大鼠进行造模及相应的干预。
2.4 神经功能评分术后7 d，假手术组大鼠神经功能正常，而模型组、外泌体组、茶多酚组及联合治疗组有不同程度的神经功能障碍，术后7，14，28 d，假手术组BBB评分均优于其余4组(P < 0.05)；7 d评分：联合治疗组优于模型组(P < 0.05)；14 d评分：联合治疗组优于模型组、茶多酚组、外泌体组(P < 0.05)；28 d评分：联合治疗组优于模型组，茶多酚组(P < 0.05)，见图3，表1。

2.5 苏木精-伊红染色结果脊髓损伤后14 d，假手术组神经元形态正常，脊髓中央灰质区域内见大量神经元细胞，无明显空洞及瘢痕组织生成；模型组神经元数量少于假手术组，同时神经元周围可见大量瘢痕组织和空泡状坏死区域；外泌体组、茶多酚组神经元数量和坏死区域较模型组有所改善，联合治疗组神经元结构较为完整，损伤恢复良好，胶质空洞坏死区域较少，见图4。

2.6 尼氏染色结果脊髓损伤14 d，假手术组有大量正常神经元分布，而模型组神经损伤较为严重，观察区域内神经元分布最少，联合治疗组神经元分布优于茶多酚组及外泌体组，见图5。

2.7 ATF6免疫荧光染色结果各组均可见ATF6表达，其中模型组ATF6表达最高，模型组与其余4组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明脊髓损伤后内质网应激明显增强，经茶多酚、外泌体、联合治疗等干预，ATF6表达有不同程度下降，其中联合治疗组ATF6表达最低，其与茶多酚组、外泌体组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果说明联合治疗组抑制内质网应激最显著，见图6。

2.8 GADD153免疫荧光染色结果各组均可见GADD153表达，其中模型组GADD153表达最高，假手术组GADD153表达最少，与模型组比较，其余4组GADD153表达下降(P < 0.05)。联合治疗组GADD153低于茶多酚组(P < 0.05)。结果说明茶多酚、外泌体及两者联合治疗能够降低GADD153表达，均能够降低内质网应激所致的神经元损伤，联合治疗组抑制内质网应激最显著，见图7。

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引言

脊髓损伤病理病机制复杂，迄今为止尚无有效的治疗手段。目前研究发现脊髓损伤后伴随的缺血再灌注对后期功能影响重大，干预脊髓缺血再灌注损伤可为神经修复提供有效的治疗手段[1-2]。
目前研究证实细胞凋亡在脊髓缺血再灌注损伤中发挥了重要作用，细胞凋亡包括死亡受体、线粒体及内质网应激途径，其中内质网应激通过PERK、ATF6、IRE1 3条信号途径影响下游分子Casepase12、CHOP从而导致细胞凋亡。课题组团队前期研究示内质网应激及激素干预能够改善脊髓损伤后的神经功能，理论上通过人为干预降低内质网应激所导致的细胞凋亡能够缓解继发性损伤[3-4]。
茶多酚(epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶中最主要活性成分，能够清除氧自由基并保护神经。目前骨髓间充质干细胞在治疗脊髓损伤中发挥了重要作用，其能够定向分化为神经元细胞，旁分泌生长因子保护神经。理论上茶多酚能够通过抑制内质网应激达到保护神经功能作用，但其透过血脑屏障和生物利用效率差，限制了其大范围使用，如何克服这些缺陷成为新的研究方向[5]。
间充质干细胞外泌体兼具神经修复功能，同时具有药物递送和纳米结构的优点，其属于有效突破各种生物屏障实现药物高效转运的生物活性材料[6-7]，借助骨髓间充质干细胞外泌体(bone marrow mesenchymal stem cells-derived exosomes，BMSCs-Exo)搭载茶多酚构建该新型复合物，理论上具有靶向修复、高效递送等多重生物功能，从而实现最大程度的神经保护作用。该研究拟从抑制内质网应激所致神经损伤角度，探讨BMSCs-Exo/茶多酚新型复合物的神经保护机制，为后续临床应用提供实验数据支撑。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计制作大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，给予茶多酚、BMSCs-Exo以及两者联合进行干预，比较各组之间神经损伤及内质网应激相关指标变化，数据分析组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年3月在江西省人民医院动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性SD大鼠50只，6-8周龄，SPF级，体质量为(210±20) g，动物采购于江西中医药大学动物中心，动物许可证号：SCXK(赣)2018-0003。研究方案已通过江西省人民医院动物伦理委员会审批，编号为KT010。
1.3.2 实验细胞骨髓间充质干细胞购自华拓生物科技有限公司，该细胞系为原代细胞，已进行CD90免疫荧光染色鉴定。
1.3.3 实验试剂和仪器脱水机(意大利迪佩斯，Donatello)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)；涡旋混合器(武汉赛维尔生物科技有限公司，MV-100)；掌上离心机(武汉赛维尔生物科技有限公司，MS6000)；脱色摇床(武汉赛维尔生物科技有限公司，DS-2S100)；正置荧光显微镜(日本尼康，Nikon Eclipse C1)；EDTA抗原修复液(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1202)；组织自发荧光淬灭剂(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1221)；牛血清白蛋白(武汉赛维尔生物科技有限公司，GC305010)；抗荧光淬灭封片剂(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1401)；GADD153抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司，G101)；ATF6抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司，G1017)。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs-Exo提取冰箱中取出原代骨髓间充质干细胞，放置水浴锅中解冻，将悬浮细胞加入至离心管中，管中添加5 mL预冷的DMEM高糖培养基，离心处理(250×g，5 min)，再次将1 mL DMEM高糖培养基加入管中，混匀，按照(2.5-4.0)×104 的细胞密度接种于培养瓶中，将培养瓶放置在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养2 d，按照试剂盒提示方法提取外泌体，提取好的外泌体放置-80 ℃冰箱中保存。
1.4.2 BMSCs-Exo鉴定
(1)透射电镜观察：取10 μL外泌体滴加于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液，滴加10 μL醋酸双氧铀于铜网上沉淀1 min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，100 kV进行电镜检测成像，获得透射电镜成像结果。
(2)粒径分析：取10 μL外泌体用PBS稀释至30 μL，先用标准品进行NTA性能测试，性能测试合格后方可进行外泌体样品上样，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针，待样本完成检测即可获得外泌体的粒径和浓度信息。
(3) Western blot检测CD63、TSG-101的表达：取20 μL外泌体用PBS稀释至90 μL，取30 μL稀释外泌体，避光37 ℃孵育30 min，加入1 mL预冷的PBS，选择超速转子，4 ℃，110 000×g超速离心70 min，小心去除上清，加入1 mL预冷的PBS，选择超速转子，再次4 ℃，110 000×g超速离心70 min，小心去除上清，用50 μL预冷的1×PBS重悬，将所得蛋白样品与5倍上样缓冲液混合并煮沸5 min，行凝胶电泳并转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入CD63(1∶200)，TSG-101(1∶200)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗10 min×3次，加入二抗(1∶300)，室温孵育1 h，TBST洗10 min×3次，ECL化学发光系统检测，重复实验3次。
1.4.3 大鼠脊髓缺血再灌注模型的制作及分组 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、茶多酚组、外泌体组、联合治疗组，每组10只。采用文献[8]方法制作大鼠脊髓缺血再灌注模型。大鼠麻醉后仰卧位取正中切口，游离并显露腹主动脉，动脉夹在肾动脉下端完全阻断腹主动脉，夹闭30 min松开动脉夹，伤口缝合，假手术组不夹闭血管。术后2 h用微量注射器尾静脉注射给药。茶多酚组：将茶多酚(河北润步生物科技有限公司)放入1 mL生理盐水中，配置成质量浓度为0.5 mg/μL茶多酚溶液，治疗剂量为20 mg/kg茶多酚溶液[5]。外泌体组：BMSCs-Exo质量浓度为200 μg/mL，治疗剂量为200 μL外泌体溶液[9]。联合治疗组：将外泌体和茶多酚混合，用超声方法予以孵化处理，孵化条件：超声振幅强度20%，超声开30 s，关3 min，总计6个循环，之后将混合液放置于37 ℃水浴锅静置30 min保存，治疗剂量为200 μL混合液[10]。模型组注射等量生理盐水。假手术组不做任何处理。
1.4.4 术后护理手术动物分笼饲养，大鼠每天予以20万青霉素腹腔注射，持续3 d，伤口局部予以碘伏消毒，人工辅助排尿。
1.4.5 大鼠神经功能评价脊髓损伤后的第7，14，28天，采用BBB评分评价大鼠神经功能，具体操作步骤如下：大鼠放置于观察台，2名独立研究者(分组不知情)观察大鼠关节、躯干和运动协调状态，记录并评分，最终结果取二者平均值。
1.4.6 苏木精-伊红染色脊髓损伤后14 d麻醉后处死动物，游离整个脊柱标本放置于40 g/L多聚甲醛中浸泡，固定30 min后再游离取出L4水平1 cm长度脊髓组织。经脱水，包埋及固定处理后，切至5 μm切片备用。随机取切片10张按照苏木精-伊红染色步骤染色，显微镜下观察损伤后局部神经元状态、胶质区域空洞及瘢痕组织分布情况。
1.4.7 尼氏染色同1.4.6进行脊髓取材、制备切片，根据尼氏染色方法将损伤区域内的脊髓进行相应尼氏染色，主要观察神经元的形态和数量分布，以评估损伤后神经元的功能情况。
1.4.8 ATF6及GADD153免疫荧光检测将制备完成脊髓组织切片放入环保型脱蜡液Ⅰ10 min-环保型脱蜡液Ⅱ10 min-环保型脱蜡液Ⅲ10 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ5 min-蒸馏水洗，加入柠檬酸修复液进行抗原修复；修复完成后，自然冷却；将切片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，滴加封闭液(一抗是山羊来源用体积分数10%驴血清封闭，一抗其他来源用3%牛血清白蛋白封闭)，封闭30 min；滴加配好的一抗(GADD153，稀释比例1∶500；ATF6，稀释比例1∶500)，切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜；玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；滴加对应的二抗，避光室温孵育50 min；玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；滴加加DAPI染液，避光室温孵育10 min；玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上洗涤3次，每次5 min；滴加加自发荧光淬灭剂B液5 min，流水冲洗10 min；抗荧光淬灭封片剂封固；采集图像：DAPI激发波长330-380 nm，发射波长420 nm；488激发波长465-495 nm，发射波长515-555 nm；CY3激发波长510-560 nm，发射波长590 nm；激光共聚焦显微镜拍照，每张切片在400×镜下随机选取5个视野采集图像，每个标本取3张切片，ImagePro Plus 分析获得积分吸光度值，取平均值。
1.5 主要观察指标 ①各组大鼠脊髓损伤后神经功能评分；②各组大鼠脊髓组织苏木精-伊红染色、尼氏染色结果；③各组大鼠脊髓组织ATF6和GADD153的表达。
1.6 统计学分析实验数据均以x±s表示，使用SPSS 20.0进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，并进行LSD多重比较，同时进行方差齐性检验，检验水准为P=0.05。文章统计学方法已经通过南昌医学院生物统计学专家审核。

讨论

脊髓损伤作为目前最严重的灾难性损伤给家庭与社会带来了沉重负担。脊髓损伤病理病机复杂，迄今为止尚无有效治疗方法[11]。缺血再灌注损伤是原发性损伤后的二次损伤，近年研究发现细胞凋亡在缺血再灌注中发挥重要作用。细胞凋亡又称细胞程序性死亡，广泛存在于多细胞生物的各种组织中，是细胞内一个主动积极的程序性生理过程，死亡受体活化(外源性途径)和线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞内2条经典的途径[12]。
内质网应激启动的凋亡是最近发现的新途径。内质网是一个重要的细胞器，其功能如Ca2+调节、生物大分子的合成加工等[13]。因营养缺乏、蛋白质糖基化抑制、Ca2+耗竭等均可导致内质网功能失调，从而激活内质网后续的折叠蛋白反应，抑制蛋白质合成并启动内质网应激相关基因转录[14]。
内质网应激持续存在或过强时将诱导内质网应激相关性细胞凋亡，造成组织损伤。折叠蛋白反应是由一个内质网分子伴侣GRP78/BIP和3个内质网应激感受蛋白所介导的，分别是PERK、ATF6和 IRE-1，无内质网应激时，PERK、ATF6、IRE-1分别与分子伴侣GRP78/BIP结合，处于无活性状态，内质网应激存在时，未折叠蛋白在内质网内堆积使GRP78/BIP从3种跨膜蛋白上解离，转而去结合未折叠蛋白[15]。解离后的感受蛋白被活化并启动折叠蛋白反应，降低未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的积累，通过PERK-eIF2、ATF6、IRE-1信号途径恢复内质网的正常功能，是一个促生存响应。长时间或者过量的应激，也会损伤内质网，这3个通路同时也能诱导由内质网应激介导的细胞凋亡信号通路，以去除无功能细胞。内质网应激并不是直接诱导凋亡，而是通过激活下游的凋亡信号分子Casepase12、GADD153、激酶ASK1/JNK等诱导凋亡[16]。研究表明Casepase12、GADD153是内质网应激特异的转录因子，在死亡受体和线粒体信号通路中不被活化[17]。研究表明内质网应激参与了多种常见疾病如糖尿病[18]、心脑组织缺血和神经系统变性[19]、肝炎等[20]，鉴于脊髓缺血再灌注时也存在缺氧、酸中毒、ATP耗竭、钙超载及大量自由基生成等，其均可作为诱导内质网应激的刺激因素。课题组团队前期也发现了内质网应激在脊髓缺血再灌注损伤的发生发展中具有重要临床意义，在对大鼠脊髓损伤后相关基因检测中发现，急性脊髓损伤能够诱导CHOP表达，CHOP表达增高可能与内质网应激诱导的神经细胞凋亡有关，证实了内质网应激相关蛋白如GADD153、CHOP的重要调控机制及新的治疗靶点[3]。基于此研究，通过靶向内质网应激保护脊髓功能成为新的治疗策略，课题组团队对于甲强龙的脊髓保护机制进行了深层次的探索，发现甲强龙通过抑制内质网应激来缓解脊髓继发性性损伤的机制[21]。该研究模型组大鼠出现的内质网应激性蛋白(GADD153、ATF6)高表达，与先前研究结果类似，外泌体组、茶多酚组及联合治疗组不同程度内质网应激相关蛋白表达下调，说明了靶向内质网应激所致凋亡治疗的有效性。
茶多酚学名别名茶蹂质、茶单宁，经非发酵程序从绿茶的叶中加工而成，是茶叶中儿茶素类、丙酮类、酚酸类和花色素类化合物的总称。它是一种稠环芳香烃，属黄烷醇类，主要成分包括儿茶素、黄酮、黄酮醇类、花青素类、花白素类、酚酸及缩酚酸类[22]。AHADI等[23]发现经蛛网膜下腔给予茶多酚注射后具有神经保护作用，其作用机制为消除自由基、抑制炎症反应、调节细胞生存凋亡基因和细胞传导通路等。茶多酚通过以下途径调节氧化应激诱导的细胞凋亡蛋白激酶B和c-JunN端激酶信号通路，已经证明茶多酚与其他药物的组合能够明显改善应激所致的损伤[24]。国内韩晓光等[5]也证实了茶多酚的神经保护作用，TIAN等[25]发现了茶多酚等通过脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子来修复损伤神经，RENNO等[26]则发现茶多酚处理可抑制损伤诱导的异前列腺素产生，刺激总抗氧活性的恢复，并与神经损伤后运动和感觉损伤显著减轻以及神经元再生相关。
此实验研究也发现了茶多酚组术后功能评分及内质网应激相关蛋白ATF6和GADD153表达下降，证实了其具有保护神经的功能和抑制内质网所致的细胞凋亡，但是该分子透过血脑屏障效能较差，影响了部分疗效[25]，如何促进其透过血脑屏障是提高其疗效的有效手段[27]。
外泌体易于提取保存，无免疫排斥，且携带有高效的生物活性物质，是一种理想的生物调控介质，文献表明间充质干细胞外泌体通过其携带的蛋白质、miRNA、长链非编码RNA能维持骨代谢平衡[28]。外泌体具有与细胞整合的双层脂质表面结构和纳米尺寸，通过膜融合和内吞作用改善药物的吸收[29]。目前多项研究证实了间充质干细胞外泌体能够直接修复神经损伤[30-31]，ZHOU等[6]则证实了外泌体良好的生物相容性、高效的药物靶向作用及容易透过血脑屏障等功能。FAN等[32]用负载外泌体的导电水凝胶修复脊髓损伤，外泌体通过M2巨噬细胞极化调控PTEN/PI3K/AKT/mTOR通路促进神经修复，而RAN等[33]则设计负载生物活性肽以及靶向递送以修复脊髓损伤，外泌体负载神经元靶向肽和生长促进肽具有无毒、高生物活性及高效修复神经的特性。
因此，理论上利用外泌体携带药物进行治疗具有靶向修复及高效搭载药物的双重效能，此研究联合使用BMSCs-Exo和茶多酚治疗脊髓缺血再灌注损伤，大鼠神经功能得到了不同程度改善，ATF6、GADD153等内质网应激相关标记物表达明显下降，同时苏木精-伊红染色和尼氏染色从形态上说明了联合治疗组对于神经保护的作用，通过BMSCs-Exo和茶多酚的联合使用，能够减少胶质瘢痕增生及空洞形成，打破抑制神经元、轴突再生的屏障，结合内质网应激相关蛋白的表达变化，推测联合治疗手段的可能途径为抑制ATF6/CHOP信号通路降低内质网应激所致的细胞凋亡从而改善神经功能。
综上所述，茶多酚和BMSCs-Exo联合使用能够改善神经功能，同时抑制内质网应激相关蛋白ATF6/CHOP表达，这为未来借助于BMSCs-Exo靶向内质网应激修复脊髓损伤的新策略提供新的实验数据。当然，此研究也存在部分缺陷，茶多酚及外泌体及联合治疗组等生物活性材料在治疗中缺乏药物梯度治疗，仅依据于文献报道给予单梯度干预；其次为给予方式为单次给药，与临床实践中多次给药存在一定差别；再次在生物活性材料的合成上方法较为简单，目前存在的不足将在后续实验中予以改良，以期达到更加合理的实验
方案。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞外泌体联合茶多酚治疗大鼠脊髓缺血再灌注损伤

Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes combined with epigallocatechin-3-gallate in treatment of spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats

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