骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间免疫浸润相关基因的筛选及验证

doi:10.12307/2024.154

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (13): 2082-2089.doi: 10.12307/2024.154

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间免疫浸润相关基因的筛选及验证

邓发滑1，胡华丽1，王斯奇1，许建霞1，禄婷婷1，2，黄海1，2，韦四喜1，2

1贵州医科大学医学检验学院临床生化教研室，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2023-04-07 接受日期:2023-05-25 出版日期:2024-05-08 发布日期:2023-08-28
通讯作者: 韦四喜，博士，博士生导师，主任技师，贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学医学检验学院临床生物化学教研室，贵州省贵阳市 550004
作者简介:邓发滑，女，1997 年生，贵州省黔东南州人，贵州医科大学临床检验诊断学在读硕士，主要从事血液肿瘤相关基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81960031，82260033，81660027)，项目负责人：韦四喜；贵州省科技厅资助项目(20185779-70)，项目负责人：韦四喜；贵州医科大学附属医院博士研究启动基金(gyfybsky-2021-29)，项目负责人：禄婷婷；贵州医科大学附属医院国家自然科学基金区域基金培育项目(gyfynsfc-2021-48)，项目负责人：禄婷婷

Screening and verification of genes related to immune infiltration between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

Deng Fahua1, Hu Huali1, Wang Siqi1, Xu Jianxia1, Lu Tingting1, 2, Huang Hai1, 2, Wei Sixi1, 2

1Clinical Biochemistry Teaching and Research Department, School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Clinical Laboratory Center of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2023-04-07 Accepted:2023-05-25 Online:2024-05-08 Published:2023-08-28
Contact: Wei Sixi, MD, Doctoral supervisor, Chief technician, Clinical Biochemistry Teaching and Research Department, School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Clinical Laboratory Center of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Deng Fahua, Master candidate, Clinical Biochemistry Teaching and Research Department, School of Medical Laboratory, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960031, 82260033, 81660027 (to WSX); a grant from Guizhou Provincial Department of Science and Technology, No. 20185779-70 (to WSX); Doctoral Research Initiation Fund of Guizhou Medical University Affiliated Hospital, No. gyfybsky-2021-29 (to LTT); National Natural Science Foundation Regional Fund Cultivation Project of Guizhou Medical University Affiliated Hospital, No. gyfynsfc-2021-48 (to LTT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓增生异常综合征：是一种源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，以髓系细胞分化及发育异常为特征，常表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭及高风险向急性髓系白血病转化。
免疫浸润：肿瘤的免疫浸润是指免疫细胞在肿瘤组织中发生浸润，从而影响肿瘤内免疫反应的过程。

背景：骨髓增生异常综合征具有较高的急性髓系白血病转化风险，有研究表明免疫浸润在二者之间发挥重要作用，但免疫细胞浸润与相关差异表达基因的调控关系仍需更多研究证实。

目的：通过生物信息学分析方法，寻找与骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病具有预后意义的差异表达基因，探讨差异基因与免疫浸润细胞调控在疾病发生发展中的可能作用及机制。
方法：利用GEO数据集筛选差异表达基因用于生物信息学分析，对差异表达基因进行DO、GO、KEGG和GSEA分析。利用TCGA预后数据库绘制差异表达基因的K-M曲线，并对预后相关的差异基因进行受试者工作特征曲线分析判断基因的临床诊断性能。最后，采用CIBERSORT分析预后相关关键基因与免疫浸润细胞分布之间的相关性，利用RT-qPCR检测健康对照、骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病患者外周血样本对筛选出的关键基因进行初步验证。

结果与结论：①在骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病之间共获得150个差异表达基因，其中16个基因表达上调，134个基因表达下调；②DO、GO、KEGG及GSEA分析结果提示差异表达基因可能通过调节免疫应答促进骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病发展，CIBERSORT分析显示骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间存在免疫浸润差异，其中CD4+ T细胞、单核细胞、中性粒细胞、M1巨噬细胞在急性髓系白血病患者中分布降低，而炎症抑制细胞M2巨噬细胞在急性髓系白血病患者中分布增加，可能与急性髓系白血病免疫抑制有关；③利用K-M曲线及受试者工作特征曲线从150个差异基因中筛选出4个与免疫和预后相关且具有较好诊断性能的基因：MANSC1、FLT3、BMX及CXCR2；④RT-qPCR检测结果显示MANSC1、BMX及CXCR2在急性髓系白血病患者中低表达，而FLT3在急性髓系白血病患者中高表达。结果表明，MANSC1、FLT3、BMX及CXCR2在骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病患者间差异表达，不仅与患者预后显著相关，还可能通过调节患者的免疫浸润影响骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的发生和进展，它们可作为骨髓增生异常综合征向急性髓系白血病转化的潜在生物标志物和治疗靶点，为骨髓增生异常综合征“转白”的临床诊疗研究提供新的方向。

https://orcid.org/0000-0003-0305-1746 (邓发滑)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓增生异常综合征, 急性髓系白血病, 免疫浸润, 预后, 生物信息学

Abstract: BACKGROUND: Myelodysplastic syndrome has worse hazards of acute myeloid leukemia transformation, and some studies have revealed that immune infiltration plays a vital part in the two. Nevertheless, more studies are required to confirm the relationship between immune infiltration and related differentially expressed gene regulation.
OBJECTIVE: To screen the differentially expressed genes with prognostic significance between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia by bioinformatics analysis and explore the possible roles and mechanisms among these differentially expressed genes and immune infiltration mechanisms in the occurrence and progression of diseases.
METHODS: The differentially expressed genes were screened for bioinformatics analysis using the GEO datasets, and analyzed by DO, GO, KEGG and GSEA. The TCGA prognostic database was used to plot the K-M curves of differentially expressed genes and receiver operating characteristic curve analysis was applied to evaluate the clinical diagnostic performance. Finally, CIBERSORT analysis was used to intuitively demonstrate the correlation between critical prognostic genes and the distribution of immuno-infiltrated cells. RT-qPCR was employed to detect peripheral blood samples from healthy controls, myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia patients so as to verify the crucial genes preliminarily.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 150 differentially expressed genes were obtained between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia, among which 16 genes were up-regulated and 134 were down-regulated. (2) The results of DO, GO, KEGG and GSEA analysis suggested that differentially expressed genes might promote the development of myelodysplastic syndrome to acute myeloid leukemia by regulating the immune response. CIBERSORT revealed the differences in immune infiltration between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia. The distribution of CD4+ T cells, monocytes, neutrophils and M1 macrophages decreased in acute myeloid leukemia patients. In contrast, the distribution of inflammatory suppressor cells M2 macrophages increased, suggesting that it may be related to the immunosuppression of acute myeloid leukemia. (3) K-M curve and receiver operating characteristic curve analysis of 150 differentially expressed genes screened out four genes relevant to immunity and prognosis with good diagnostic performance: MANSC1, FLT3, BMX and CXCR2. (4) The results of RT-qPCR exhibited that MANSC1, BMX and CXCR2 were low expressed, while FLT3 was highly expressed in acute myeloid leukemia patients. These findings verify that the differential expression of MANSC1, FLT3, BMX and CXCR2 in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is not only significantly correlated with the prognosis of patients but may also affect the occurrence and development of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia by regulating the immune infiltration of patients. They can be used as potential biomarkers and therapeutic targets of the transformation from myelodysplastic syndrome to acute myeloid leukemia, providing a new direction for clinical diagnosis and treatment of the transformation of myelodysplastic syndrome.

Key words: myelodysplastic syndrome, acute myeloid leukemia, immune infiltration, prognosis, bioinformatics

中图分类号:

邓发滑, 胡华丽, 王斯奇, 许建霞, 禄婷婷, 黄海, 韦四喜. 骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间免疫浸润相关基因的筛选及验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(13): 2082-2089.

Deng Fahua, Hu Huali, Wang Siqi, Xu Jianxia, Lu Tingting, Huang Hai, Wei Sixi. Screening and verification of genes related to immune infiltration between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(13): 2082-2089.

图/表（结果） 8

2.1 差异表达基因情况在GEO数据库中检索到符合筛选条件的数据集GSE15061和GSE51082，使用Limma安装包分析MDS及AML患者基因表达情况，共获得150个差异表达基因，其中16个基因表达上调，134个基因表达下调。差异基因表达情况热图及火山图如图1所示。

2.2 GO功能富集分析与KEGG通路分析 GO功能富集分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3个类别。为了进一步明确差异表达基因通过何种途径参与机体功能的调节，将差异表达基因进行GO分析，结果显示差异基因在生物过程中主要富集在抗菌免疫、髓系细胞分化方向；在细胞组分中差异基因主要富集在囊泡腔、细胞分泌颗粒；在分子功能方面，差异表达基因主要通过影响碳水化合物结合、水解酶活性及免疫受体活性等功能影响疾病发展，见图2。

KEGG通路富集分析查找差异表达基因参与调节的信号通路，分析结果显示，差异表达基因参与中性粒细胞外陷阱的形成、癌症中的转录失调、造血细胞系及急性髓样白血病等通路调节。此外，DO分析结果提示差异表达基因与造血系统疾病、贫血及髓系白血病等相关。
2.3 差异基因GSEA分析 GSEA分析是将差异表达基因按照表达情况进行排序，然后将排序后的基因与通路进行一一富集，上调的基因富集在通路的顶部，下调基因富集在通路的底部，是一种对基因集合进行的富集分析。对差异基因进行GSEA分析，结果显示差异基因主要富集在髓系白细胞介导的免疫、特异性颗粒、胚胎骨骼系统形态发生等功能；同时KEGG通路分析结果显示，差异表达基因也在细胞周期、AML等相关通路上富集，见图3。

2.4 MDS与AML的免疫浸润分析利用CIBERSORT包分析MDS与AML之间22种免疫浸润相关细胞的分布情况。结果显示MDS与AML之间存在免疫细胞的差异分布，其中CD4+T细胞、单核细胞、中性粒细胞、M1巨噬细胞等在AML患者中分布降低，M2巨噬细胞在AML患者中分布增加，见图4。

2.5 差异表达基因预后分析为了进一步筛选出差异表达基因中与预后相关的基因，通过TCGA在线数据库下载AML患者生存数据，分析差异表达基因与AML总生存期之间的相关性，结果显示，共有32个差异表达基因与AML患者的总生存期相关，提示它们可能作为AML预后判断的潜在分子靶标，见表3。

2.6 预后相关基因的受试者工作特征曲线分析通过pROC安装包分析预后相关差异表达基因的诊断性能并计算曲线下面积值。曲线下面积> 0.9时说明该基因具有较好的诊断准确性，分析结果显示MANSC1(0.915)、FLT3(0.913)、BMX(0.912)及CXCR2(0.902)的曲线下面积均大于0.9，见表4，图5，提示MANSC1、FLT3、BMX及CXCR2对AML预后具有较好的诊断性能。结合差异表达基因的富集分析结果，通过文献调研发现，这4个关键基因可能与免疫调控相关，因此将该4个关键基因进行进一步免疫浸润相关分析。

2.7 关键基因的免疫浸润分析及RT-qPCR表达验证通过CIBERSORT包分析关键基因与免疫浸润细胞分布之间的相关性，进一步探究关键基因与MDS及AML免疫浸润之间的联系，结果显示，免疫细胞与关键基因的相关性符合免疫细胞在AML中的分布情况，提示MANSC1、FLT3、BMX及CXCR2这4个关键基因可能通过影响免疫浸润细胞的分布参与AML的免疫浸润，从而影响疾病进展。
使用RT-qPCR验证关键基因的表达情况，结果显示MANSC1(2.820±3.725 vs. 0.775±0.922，P < 0.01)、CXCR2 (0.920±1.066 vs. 0.387±0.573，P < 0.05)及BMX(2.191±3.294 vs. 0.677±0.635，P < 0.05)在AML患者中表达显著低于MDS患者，而FLT3(4.878±5.493 vs. 9.903±10.051，P < 0.05)在AML患者中表达显著高于MDS患者，其表达情况与生信预测的分子表达情况一致，见图6。

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引言

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一类以骨髓克隆性增生异常为主的血液系统疾病，其特征表现为造血前体细胞向成熟血细胞分化缺陷而导致的无效造血、血细胞形态和功能异常[1-2]，MDS在临床表现、形态学、遗传学及分子学等方面均表现出异质性，从预期寿命接近正常的无病痛状态到接近急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)的形式，其具体的发病机制尚不明确。临床上约有30%的MDS患者可发展为AML，转化为白血病后患者对化疗敏感性降低、预后较差[3]，对患者生活质量及生命健康均造成很大影响[4-5]。因此寻找MDS疾病进展及“转白”的分子标志一直是MDS诊疗的难点。
骨髓微环境是髓系恶性疾病的重要易感因素，因此，当骨髓微环境发生免疫细胞浸润时将可能发生免疫稳态失衡，导致肿瘤细胞的免疫逃逸[6]。研究表明，免疫细胞及其下游信号失调在MDS和AML发生、发展中起着至关重要的作用，并且与MDS及AML的化疗反应性和高复发风险相关[7-8]。基于肿瘤细胞逃避免疫监视这一特性，越来越多的研究开始关注肿瘤的免疫功能失调，但目前针对MDS及AML免疫浸润的相关研究较为鲜见。
骨髓微环境是一种由细胞和非细胞成分组成的动态而复杂的生物组织[9]，能够为MDS及AML的发生、发展提供环境支持，而免疫细胞作为骨髓微环境中的重要组成部分之一，一般分为2种类型：一种是肿瘤拮抗免疫细胞，主要由效应T细胞(包括CD8+细胞毒性T细胞和效应CD4+ T细胞)、自然杀伤细胞、树突状细胞、M1巨噬细胞和中性粒细胞组成；另一种是促肿瘤免疫细胞，主要由Treg细胞和髓系来源抑制细胞组成。正常情况下，骨髓微环境中的免疫细胞分泌各种细胞因子维持骨髓免疫环境的稳定，在骨髓微环境发生免疫浸润后，一方面可能导致细胞因子分泌失调，促进白血病细胞的增殖及发育，加速白血病的发生，并抑制造血干细胞向下游血细胞的分化；另一方面，白血病患者骨髓微环境发生免疫浸润之后免疫细胞能够通过激活多种信号通路调节白血病的发展。
免疫浸润受到肿瘤细胞内在因素的影响，包括趋化因子的分泌以及癌症驱动基因的表达[10]，为了进一步探究MDS及AML患者基因差异表达及免疫浸润之间的关系，筛选MDS及AML疾病发生发展的潜在生物学标志物，该研究首先通过生物信息学技术筛选MDS及AML预后相关的差异表达基因，然后通过受试者工作特征曲线分析其诊断性能，探究其与MDS及AML免疫浸润关系，为MDS疾病发生、“转白”相关研究提供理论研究方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学分析结合患者外周血样本验证，RT-qPCR结果采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年12月至2023年3月在贵州医科大学医学检验学院中心实验室进行。
1.3 对象经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准(审批号为：2019169)及患者知情同意，收集2022年1月至2023年3月于贵州医科大学附属医院就诊的健康体检人群、MDS患者及AML患者外周血样本各30例，其中健康人群包括男14例，女16例，年龄(46±13)岁；MDS患者包括男16例，女14例，年龄为(50±18)岁；AML患者包括男18例，女12例，年龄(44±19)岁。
纳入标准：依据WHO诊断标准，明确诊断为MDS/AML的患者，其中AML共纳入初诊患者18例，复发患者12例；MDS共纳入MDS-EB分型患者30例。
1.4 试剂和仪器 RNA反转录试剂盒购自日本Takara公司；实时荧光定量PCR试剂购自北京康润诚业生物科技有限公司；以管家基因GAPDH作为内参基因；引物序列均为自行设计，并经过 NCBI BLAST特异性比对，由上海生工生物工程有限公司合成；普通PCR仪、AppliedBiosystems QuantStudio 5实时荧光定量 PCR 仪购自美国 Thermo Fisher公司。
1.5 方法

1.5.1 数据来源基因表达谱数据从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载，在数据库中搜索AML和MDS相关芯片，检索词为“MDS，AND，AML”，物种为“Homo sapiens”，筛选条件为“Expression profiling by array”，下载芯片数据集GSE15061和GSE51082，数据集下载链接如表1所示，两数据集共包含健康对照骨髓/外周血样本69例，MDS骨髓/外周血样本174例以及AML骨髓/外周血样本240例。基因注释平台使用GPL97。此外，利用癌症基因组图谱数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获取AML患者的生存数据。

1.5.2 差异表达基因筛选使用Sva及Limma R包对2个数据集进行合并处理，比较MDS患者及AML患者基因表达谱，获得差异表达基因。差异基因筛选标准为：logFCfilter=1，adj.P.Val.Filter < 0.05。获得的差异表达基因使用R语言安装包pheatmap及ggplot2绘制差异基因热图及火山图。条件为 adj.P.Value < 0.05，|log FC|> 1，获得符合筛选条件的差异表达基因，分别使用R语言ggplot2包和pheatmap包绘制火山图和热图。
1.5.3 KEGG通路分析、GO功能富集分析和DO分析使用BiocManager包中的“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”对差异表达基因进行GO功能富集分析及KEGG通路分析，并采用气泡图使其可视化。同时，使用“DOSE”对差异基因进行富集分析，分析差异基因是否与相关疾病存在潜在相关。
1.5.4 GSEA分析采用“GSEAbase”对差异基因进行基因集富集分析，按照Foldchange进行排序富集，计算富集得分(ES)。选取富集得分前5的通路绘图。
1.5.5 差异表达基因预后分析通过TCGA在线数据库下载AML患者预后数据集，使用“survival”和“survminer”安装包构建差异表达基因的预后模型，获得与AML患者预后相关的基因。
1.5.6 差异表达基因受试者工作特征曲线分析受试者工作特征曲线用于评估基因对疾病的诊断效能，通过计算得出曲线下面积，曲线下面积> 0.9说明基因对该疾病具有较好的诊断性能。使用“pROC”安装包分析预后相关差异表达基因的曲线下面积，选取曲线下面积> 0.9的基因进行后续分析。
1.5.7 免疫浸润分析利用“CIBERSORT”安装包对GSE15061和GSE51082数据集进行分析，得到22种免疫相关细胞在MDS及AML患者中差异分布情况。使用“limma”和“reshape2”包对差异表达基因及免疫细胞、免疫浸润进行相关分析，通过“ggpubr”及“ggExtra”进行可视化。

1.5.8 RT-qPCR检测收集健康体检人群、骨MDS患者及AML患者抗凝全血各30例，提取总RNA，使用Nanodrop One 分光光度计检测RNA浓度及纯度，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA，并使用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix进行qPCR检测，引物序列如表2所示，以GAPDH为内参，2-ΔΔct计算目的基因的相对表达量。

1.6 统计学分析采用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。图形使用GraphPad Prism 8进行绘制。文章统计学方法已经通过贵州医科大学统计学专家审核。

讨论

MDS及AML在老年人群中高发，近年来随着人口老龄化的增长，MDS及AML的发病率以及MDS的“转白”风险也随之逐年上升，并且其化疗缓解率逐渐降低、复发率逐渐升高。
骨髓微环境是白血病细胞赖以生存的支持环境，它不仅能分泌多种炎症递质调节血液肿瘤的免疫应答，并且其中的多种免疫细胞还能直接参与MDS及AML的发病及进展[6]。目前已有研究表明骨髓微环境内的AML原始细胞能够通过增加髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞促进AML细胞的增殖及发育[11]；而研究发现MDS患者中的髓系来源抑制细胞与Treg细胞呈正相关，且髓系来源抑制细胞能够抑制效应T细胞发挥作用从而促进MDS转化为AML，髓系来源抑制细胞与Treg细胞呈正相关，且髓系来源抑制细胞能够抑制效应T细胞发挥作用[12]。这些结果均提示MDS与AML之间可能存在免疫浸润的差异，且这种差异能够促进MDS进一步向AML转化。
该研究通过GEO数据集筛选MDS与AML之间存在的差异表达基因，并进一步进行富集分析，GO富集结果提示差异表达基因在生物过程富集中主要涉及各类体液免疫反应、在分子功能富集中涉及免疫受体活性的调节；在GSEA富集分析中同样提示差异表达基因可能参与髓系白细胞介导的免疫。以上结果提示MDS与AML之间差异表达基因可能通过调节骨髓微环境中的免疫反应、影响细胞表面免疫受体活性等途径参与MDS及AML间的病程进展。为了进一步明确差异表达基因与MDS及AML之间免疫反应的调控关系，使用CIBERSORT算法对MDS及AML间22种免疫细胞分布情况进行分析，结果显示在AML中肿瘤拮抗免疫细胞及肿瘤杀伤细胞如中性粒细胞、M0型巨噬细胞、γδ T细胞、激活的CD4+记忆T细胞、单核细胞、初始B细胞、激活的自然杀伤细胞分布均少于MDS(P < 0.001)，此外，肿瘤促进免疫细胞M2型巨噬细胞在AML中的分布升高(P < 0.001)，提示AML中免疫浸润细胞分布减少，免疫反应减弱。
在明确了MDS与AML间存在免疫浸润细胞的分布差异后，进一步使用生存数据对差异基因进行K-M曲线分析，找到与AML患者预后相关的32个基因。在此基础上进行受试者工作特征曲线分析，找到其中具有较好诊断性能的4个分子——MANSC1、FLT3、CXCR2、BMX。联合CIBERSORT算法分析4个关键基因与免疫浸润细胞的调控关系，分析结果显示MANSC1、CXCR2、BMX在AML中呈低表达，它们与中性粒细胞、M0型巨噬细胞、γδ T细胞、激活的CD4 +记忆T细胞等在AML中低分布的免疫细胞呈正相关，而与M2型巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等在AML中高分布的免疫细胞呈负相关；而FLT3则在AML中高表达，并且与M2型巨噬细胞、记忆B细胞等AML中高分布细胞呈正相关，与中性粒细胞、M0型巨噬细胞等细胞呈负相关。这一结果提示MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3可能参与MDS与AML间的免疫调控。
最后，使用RT-qPCR验证MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3在MDS及AML患者外周血样本中的表达情况，结果显示，相较于MDS患者，MANSC1、CXCR2与BMX在AML患者中表达降低，FLT3在AML患者中表达升高，4个基因的表达验证情况与前期生物信息学分析得到的基因表达结果一致，但结合K-M生存曲线分析结果发现，MANSC1与CXCR2在AML中低表达，低表达与AML患者预后呈负相关。由于生存分析数据来源于AML患者，因此进一步分析这一情况，作者认为可能存在以下原因：①MANSC1与CXCR2在MDS向AML进展过程中呈现低表达趋势，但在AML患者的疾病进展过程中表达量发生改变；②分子发挥功能的过程并不是单一的，低表达的MANSC1与CXCR2可能与其他分子共同调控MDS向AML进展这一过程，但它们在AML疾病进展过程中可能发挥其他作用从而影响AML患者的预后。因此，两者的表达与MDS及AML疾病进展的关系仍需要进一步研究证实。
通过文献调研发现，MANSC1位于12p染色体缺失区域[13]，有关MANSC1参与肿瘤进展的证据目前尚未见报道，但有文献报道显示12p缺失是MDS及AML的预后不良因素之一[14]，因此推测MANSC1缺失或表达降低可能是影响MDS与AML疾病进展因素之一。CXCR2是G蛋白偶联受体家族的成员之一，CXCR2编码白细胞介素8受体蛋白，白细胞介素8是一种强效的促炎因子并且对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等起关键作用[15]。CXCR2表达降低不仅能够抑制白细胞介素8对中心粒细胞的招募作用，影响中心粒细胞到炎症部位的迁移[16]、抑制巨噬细胞的迁移和激活[17]，还能在肿瘤微环境中充当肿瘤细胞与宿主细胞之间的桥梁，促进肿瘤的发生发展[18]。BMX是一种X染色体上的非受体酪氨酸激酶，它在骨髓造血干细胞中表达，BMX可以通过调节炎症因子的分泌、肿瘤坏死因子α诱导的p38、JNK及NF-κB活化来调节免疫反应，从而影响肿瘤的发生发展[19]，此外有研究表明BMX能够活化STAT5信号通路介导AML细胞的吉瑞替尼耐药，从而影响AML患者的化疗效果[20]。FLT3是一种跨膜配体FLT3L激活的受体酪氨酸激酶，约在90% AML患者中表达，越来越多的报道显示约30% AML患者及部分MDS患者中存在FLT3突变，FLT3作为最常见的AML突变分子标志物之一，与患者不良预后相关[21]。FLT3L与FLT3结合发挥作用不仅能够激活PI3K、RAS等信号通路促进细胞存活、增殖和造血干细胞分化，还能通过调节树突状细胞的浸润发挥抗肿瘤作用[22]，此外，FLT3还能通过调节B细胞发育和功能影响体液免疫[23]。
MDS向AML的这一转化过程是临床上MDS疾病治疗亟待解决的难点，综上所述，MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3均可能通过多种途径调节免疫反应来参与MDS及AML的疾病进展。生物信息学分析及临床外周血样本验证结果均提示MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3在MDS及AML患者中存在表达差异，它们的表达差异与AML患者的预后相关，受试者工作特征曲线分析结果显示对于MDS及AML患者，MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3具有较好的临床诊断性能。此外，基于差异基因富集在免疫相关功能这一前提，此研究进一步分析了MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3与免疫细胞的相关性，揭示了它们与MDS及AML患者免疫浸润情况的联系，推测MANSC1、CXCR2、BMX及FLT3可能成为MDS向AML病程转化过程中的潜在生物学标志物。当然此研究也存在一定的局限性，虽然通过RT-qPCR对关键分子表达情况进行验证，但分子的具体机制仍待后续实验进一步明确；对于MANSC1及CXCR2的表达与预后预测结果存在异议，有待进一步的预后随访验证；同时，对于免疫浸润相关的检查也应进行相应实验验证，从而为MDS及AML的临床诊疗提供更加客观可靠的实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓增生异常综合征与急性髓系白血病之间免疫浸润相关基因的筛选及验证

Screening and verification of genes related to immune infiltration between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

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