N6-甲基腺苷相关调节因子与骨关节炎：生物信息学和实验验证分析

doi:10.12307/2024.224

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (11): 1724-1729.doi: 10.12307/2024.224

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N6-甲基腺苷相关调节因子与骨关节炎：生物信息学和实验验证分析

袁长深1，廖书宁2，李哲2，官岩兵2，吴思萍2，胡琪2，梅其杰1，段戡1

1广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2023-02-14 接受日期:2023-03-22 出版日期:2024-04-18 发布日期:2023-07-27
通讯作者: 段戡，博士，主任医师，广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:袁长深，男，1978年生，广西壮族自治区荔浦市人，汉族，硕士，主要从事骨与关节疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82060875)，项目负责人：袁长深；国家自然科学基金(82160912)，项目负责人：段戡

N6-methyladenosine related regulatory factors in osteoarthritis: bioinformatics analysis and experimental validation

Yuan Changshen1, Liao Shuning2, Li Zhe2, Guan Yanbing2, Wu Siping2, Hu Qi2, Mei Qijie1, Duan Kan1

1Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-02-14 Accepted:2023-03-22 Online:2024-04-18 Published:2023-07-27
Contact: Duan Kan, MD, Chief physician, Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Yuan Changshen, Master, Orthopedic Department of the Limbs, The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, Nos. 82060875 (to YCS) and 82160912 (to DK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨关节炎：是一种以软骨退变、滑膜炎症和软骨下骨硬化为特征的退行性关节疾病，主要症状包括疼痛和活动障碍等，致残率高，目前全球至少有2.42亿人受到其困扰。
N6-甲基腺苷：是指RNA中腺苷的第6位氮原子处发生的甲基化修饰，占所有RNA甲基化修饰的80%以上，是真核生物中最丰富的mRNA修饰。N6-甲基腺苷作为一种可逆的动态表观遗传标记，参与RNA可变剪接、转运、翻译和降解等。

背景：越来越多证据表明N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)调节因子与骨关节炎密切相关，被认为是防治骨关节炎新方向，但具体作用机制不明。

目的：通过对骨关节炎基因芯片数据集进行生物信息学分析，探讨m6A对骨关节炎的作用，解析骨关节炎发病机制。
方法：首先利用R软件提取GEO数据库中GSE1919数据集中骨关节炎相关m6A调节因子及其表达量，进而对提取结果行基因差异分析及GO、KEGG富集分析；接着对PPI网络拓扑学分析结果和机器学习结果取交集得到m6A关键调节因子，并通过体外细胞实验验证。

结果与结论：①提取得到16个骨关节炎相关m6A调节因子表达量，通过差异分析获得ZC3H13、YTHDC1、YTHDF3、HNRNPC等11个m6A差异调节因子；②GO富集分析显示，骨关节炎相关m6A差异调节因子在生物过程中主要于mRNA转运、RNA分解代谢、胰岛素样生长因子受体信号通路调控等发挥作用；③KEGG富集分析显示，差异调节因子主要参与p53、白细胞介素17和AMPK信号通路；④综合PPI网络拓扑学分析和机器学习结果获得m6A关键调节因子——YTHDC1；⑤体外细胞实验结果表明，m6A关键调节因子——YTHDC1在对照组与骨关节炎组中表达存在显著差异(P < 0.05)；⑥结果显示，YTHDC1与骨关节炎发生发展密切相关，有望成为m6A治疗骨关节炎的分子靶点。

https://orcid.org/0000-0001-5749-9859(袁长深)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, N6-甲基腺苷, 生物信息学, 机器学习, 调节因子, 软骨细胞, 实验验证

Abstract: BACKGROUND: Increasing evidence suggests that N6-methyladenosine (m6A) regulators are closely associated with osteoarthritis and are considered to be a new direction in the prevention and treatment of osteoarthritis, but their specific mechanism of action is unknown.
OBJECTIVE: To conduct a bioinformatics analysis of the osteoarthritis gene microarray dataset in order to explore the role of m6A in osteoarthritis and analyze the pathogenesis of osteoarthritis.
METHODS: The m6A regulators associated with osteoarthritis and their expression were first extracted from the GSE1919 dataset in the GEO database using R software, and then the results were analyzed by gene difference analysis and GO and KEGG enrichment analyses. Subsequently, the results of protein-protein interaction network topology analysis and machine learning results were intersected to obtain the m6A Hub regulators, which were validated by in vitro cellular experiments.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 16 osteoarthritis-related m6A regulators were extracted and 11 m6A differential regulators, including ZC3H13, YTHDC1, YTHDF3 and HNRNPC, were obtained by differential analysis. GO enrichment analysis showed that osteoarthritis-related m6A differential regulators played a role in the biological processes such as mRNA transport, RNA catabolism, and regulation of insulin-like growth factor receptor signaling pathway. (3) KEGG enrichment analysis showed that the differential regulators were mainly involved in the p53, interleukin-17 and AMPK signaling pathways. The combined protein-protein interaction network topology analysis and machine learning results obtained the m6A Hub regulator - YTHDC1. (5) The results of in vitro cellular experiments showed that there was a significant difference in the expression of m6A key regulator between the control and experimental groups (P < 0.05). To conclude, YTHDC1 is closely related to the development of osteoarthritis, which is expected to be a molecular target of m6A for the treatment of osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, N6-methyladenosine, bioinformatics, machine learning, regulator factor, chondrocyte, experimental verification

中图分类号:

袁长深, 廖书宁, 李哲, 官岩兵, 吴思萍, 胡琪, 梅其杰, 段戡. N6-甲基腺苷相关调节因子与骨关节炎：生物信息学和实验验证分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(11): 1724-1729.

Yuan Changshen, Liao Shuning, Li Zhe, Guan Yanbing, Wu Siping, Hu Qi, Mei Qijie, Duan Kan. N6-methyladenosine related regulatory factors in osteoarthritis: bioinformatics analysis and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(11): 1724-1729.

图/表（结果） 8

2.1 m6A调节因子根据研究确定广泛认可的26个m6A调节因子作为此次研究的参考文献[7-9]，包括writers“编码器”9个，readers“读码器”15个，erasers“消码器”2个，见表2。

2.2 m6A差异调节因子从GSE1919基因表达矩阵数据集中共提取得到16个m6A调节因子表达量，进而通过差异分析获得11个m6A差异调节因子，包括“编码器”ZC3H13，“读码器”YTHDC1、YTHDF3、HNRNPC、FMR1等；在骨关节炎组中，高表达基因8个，低表达基因3个，见图1，2。

2.3 GO富集分析结果通过对m6A差异调节因子进行功能注释得知，生物过程中主要参与mRNA转运、RNA分解代谢、胰岛素样生长因子受体信号通路的调控以及mRNA代谢的负调节等过程；细胞成分显示差异调节因子主要存在于细胞质应激颗粒、细胞质核糖核蛋白颗粒、Cajal主体、催化步骤2剪接体及细胞质处理小体中；分子功能上，差异调节因子在含m6A的RNA结合、胰岛素样生长因子结合、mRNA 3’-UTR结合、miRNA结合及调节RNA结合等功能上显著富集，见图3。

2.4 KEGG富集分析结果 KEGG富集分析表明，差异调节因子主要参与p53信号通路、白细胞介素17信号通路、AMPK信号通路，同时也在剪接体、细胞衰老、RNA转运等途径中发挥作用，见表3。

2.5 PPI网络m6A Hub调节因子基于m6A差异调节因子，使用STRING数据库构建PPI网络，通过Cytoscape软件将结果可视化，见图4。对PPI网络进行拓扑学分析，将 Degree、MCC、MNC、Betweenness和Stress等5种不同算法结果前5位取交集作为PPI网络m6A Hub调节因子，结果表明5种算法结果前五一致，分别是YTHDC1、HNRNPC、HNRNPA2B1、YTHDF3和ELAVL1。

2.6 m6A关键调节因子通过R软件对应工具包对m6A差异调节因子进行随机森林算法和支持向量机算法，结果分别为随机森林算法：YTHDF3、FMR1、YTHDC1、IGFBP1、ZC3H13；支持向量机算法：IGFBP2、IGFBP1、ELAVL1、YTHDC1。将两种机器学习算法结果和m6A Hub调节因子取交集得到m6A关键调节因子——YTHDC1，见图5。

2.7 体外细胞实验验证 qPCR检测结果表明，骨关节炎组m6A关键调节因子YTHDC1的表达高于正常组(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计生物信息学分析+体外细胞实验验证。
1.2 时间及地点实验于2022年5-6月在广西中医药大学和江西中洪博元生物技术有限公司完成。
1.3 材料人软骨细胞 (CP-H107，普诺赛)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme)；Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO)。
1.4 方法
1.4.1 数据来源利用GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“Osteoarthritis”为关键词，限定研究类型为“Expression profiling by array”以及种属为“Homo sapiens”进行检索，筛选并剔除数据集中无关样本，获得GSE1919[包含5个健康对照及5个骨关节炎患者滑膜样本数据，数据集由GPL91(Affymetrix Human Genome U95A Array)平台生成]骨关节炎基因探针矩阵文件及平台文件。
1.4.2 数据处理使用perl脚本对基因探针矩阵文件进行基因注释得到基因表达矩阵文件。利用R软件(x64 4.1.2)“limma”包中的“normalize Between Arrays”函数对GSE1919基因表达矩阵数据进行常规背景校正和分位数归一化，并输出矫正后的基因表达矩阵。
1.4.3 m6A调节因子表达量的提取将广泛认可的m6A“编码器”“消码器”和“读码器”等26个调节因子作为参考文件，通过R软件“limma”包从矫正后的GSE1919基因表达矩阵中获取交集基因表达量，并将文件输出用以后续分析。
1.4.4 m6A差异调节因子筛选利用R软件“limma”包，以|logFC|>1和P < 0.05为阈值对提取到的m6A调节因子表达量进行差异分析，得到m6A差异调节因子，并利用“ggboxplot”和“pheatmap”包分别绘制箱线图及热图以可视化。
1.4.5 GO及KEGG富集分析基因本体论(gene ontology，GO)富集分析包括生物过程、细胞成分和分子功能等3个部分，用于了解相关生物学过程及功能，通过R软件“clusterProfiler”包，设定过滤条件：P value Filter=0.05，q value Filter=1，对m6A差异调节因子进行GO富集分析。京都基因和基因组数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析用于了解m6A差异调节因子的相关作用通路，使用KOBAS 3.0数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)，以P < 0.05为输出条件，得到通路富集结果。
1.4.6 m6A差异调节因子蛋白互作网络(PPI网络) 利用STRING 11.5(http://www/string-db.org)数据库，设定最低互动分数为0.4，将该研究所获取的m6A差异调节因子构建PPI网络，并输出PPI数据文件及可视化图谱用于后续分析。
1.4.7 PPI网络m6A Hub调节因子筛选通过生物信息学统计软件Cytoscape对m6A差异调节因子PPI网络进行拓扑学分析，使用软件中“CytoHubba”插件的5种不同算法进行计算，分别是Degree(度中心性)、MCC(最大集团中心性)、MNC(最大领域分量)、Betweenness(中介中心性)、Stress(压力中心性)，各算法所得结果前5位取交集即为PPI网络m6A Hub调节因子。
1.4.8 m6A关键调节因子筛选随机森林算法和支持向量机算法属于机器学习的不同分支，已被广泛运用在生物医学研究领域[4-6]。通过R软件“randomForest”“kernlab”和“caret”等包对骨关节炎m6A差异调节因子进行随机森林算法和支持向量机算法，并将两种算法结果取交集，得到基于机器学习算法的骨关节炎m6A重要调节因子；接着将机器算法结果和PPI网络m6A Hub调节因子取交集，最终得到骨关节炎m6A关键调节因子，并通过在线平台OmicStudio (https://www.omicstudio.cn/tool)将结果可视化。
1.4.9 体外细胞实验验证将人软骨细胞分为对照组及骨关节炎组。细胞复苏经0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化后制备细胞悬液，铺板，待次日细胞贴壁良好进行细胞鉴定。将符合鉴定标准的人软骨细胞以2×105/孔的密度接种于6孔培养板中，待细胞融合率达到70%时，去掉原有的培养基，对照组不作处理，骨关节炎组用白细胞介素1β(10 ng/mL)刺激24 h模拟骨关节炎软骨细胞造模[7]，使用qPCR法检测Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达证明造模成功[8]。

造模成功后，采用qPCR法检测m6A关键调节因子YTHDC1的mRNA表达：使用Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO)从软骨细胞中提取总RNA，在50 ℃条件下保持15 min，然后转到85 ℃条件下保持5 s进行反转录反应，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在95 ℃下保持10 min，1个循环；95 ℃下保持10 s、58 ℃下保持30 s、72 ℃下保持30 s，40个循环反应程序下进行qPCR。以β-actin作为内参，分别计算正常对照组及骨关节炎组ΔCt值，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标体外细胞实验中骨关节炎组和对照组骨关节炎相关m6A关键调节因子的表达情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有实验重复3次，数据采用x±s表示。用独立样本t检验进行组间差异比较，P < 0.05则代表差异有显著性意义。广西中医药大学梅其杰已对该文统计学方法进行审核。

讨论

骨关节炎发病机制尚不清楚，但越来越多证据表明骨关节炎与表观遗传学间存在潜在关系，甚至认为表观遗传失调是骨关节炎的发病基础。m6A作为一种动态可逆的表观遗传修饰，对骨关节炎影响较大[10]。m6A调节因子可能通过平衡基质金属蛋白酶及其抑制剂间的表达参与骨关节炎病理改变[11]，过量m6A修饰通过降低RNA稳定性，下调自噬相关酶表达，导致骨关节炎中成纤维细胞样滑膜细胞释放衰老相关分泌表型增加，而抑制m6A相关调节因子则能够改善软骨破坏[12]。除此之外，m6A异常修饰还与骨关节炎炎症反应、细胞外基质合成与降解等紧密相关[13-14]。由于介导m6A修饰可改善炎症状态、细胞外基质降解、细胞老化等[15]，被认为是骨关节炎有效潜在治疗靶点。目前m6A与骨关节炎的研究甚少，仍需进一步深入研究。因而，此次研究利用生物信息学方法分析GEO数据库中的骨关节炎基因表达矩阵，剖析m6A在骨关节炎中的作用机制，期望为骨关节炎治疗提供新的靶点。
GO生物过程分析显示，m6A差异调节因子主要参与mRNA转运和代谢调节、RNA分解代谢、IGFR信号通路的调控过程。m6A作为一种重要的转录后修饰对RNA具有多样性的调控作用，而许多RNA分子目前已被证明是骨关节炎的重要调节因子，通过影响软骨细胞的发育、生存、衰老、凋亡和细胞外基质降解等[16-18]，参与骨关节炎进程。因此，通过调控m6A介导的RNA代谢过程，有望成为治疗骨关节炎的新方法。有研究观察到骨关节炎软骨下骨组织矿化不足，而胰岛素样生长因子1则是调节骨稳态的关键因素，可能与骨关节炎中骨组织硬化有关[19]；不仅如此，胰岛素样生长因子1可能对于维持骨关节炎进展过程中软骨细胞机械敏感性起重要作用[20]，因此，认为胰岛素样生长因子1在骨关节炎发病机制中发挥重要作用。在分子功能上，差异调节因子在含N6甲基腺苷的RNA结合、胰岛素样生长因子1结合、mRNA 3’-UTR结合、miRNA结合及调节RNA结合等功能上显著富集，这与生物过程分析体现一致性。细胞成分显示，差异调节因子主要存在于细胞质应激颗粒、细胞质核糖核蛋白颗粒、Cajal主体、催化步骤2剪接体及细胞质处理小体中，这些基因细胞成分的发现对从m6A方面来挖掘骨关节炎发病机制及干预治疗可能有帮助。
KEGG富集分析表明，差异调节因子主要参与p53信号通路、白细胞介素17信号通路、AMPK信号通路。p53作为经典信号通路与细胞周期阻滞和细胞凋亡密切相关[21-22]，参与骨关节炎软骨细胞凋亡途径[23]；而软骨细胞作为软骨中唯一细胞类型，对维持软骨正常生理功能至关重要，因此，通过调控P53通路介导软骨细胞凋亡可能成为预防骨关节炎的关键。白细胞介素17是一种参与炎症性疾病的多效细胞因子，已被证实能够加速软骨破坏[24]，其表达水平高低与炎症加重下骨关节炎患者的软骨缺损显著相关[25]，证明白细胞介素17在骨关节炎发展中起关键作用。而通过对白细胞介素17的干预研究表明，白细胞介素17水平下降能够减轻骨关节炎关节退变，改善病情[26-27]。AMPK信号通路与骨关节炎密切相关，通过激活AMPK信号能够有效保护软骨细胞、防止骨关节炎进展[28]。KEGG分析差异调节因子也在剪接体、细胞衰老等途径中发挥作用[11]。以上结果表明，m6A差异调节因子与骨关节炎紧密相关，未来研究应重视m6A介导的RNA调节，以此作为深入了解骨关节炎发病机制的又一途径。
通过R软件提取、筛选实验数据集中的m6A调节因子，经差异表达分析后获得11个m6A差异调节因子；设定互动分数为0.4，使用STRING数据库构建PPI网络，共得到7个蛋白节点；对获得的PPI网络运用5种不同算法进行拓扑学分析并与机器算法结果取交集后得到m6A关键调节因子——YTHDC1，这与其他研究结论类似[29-30]。以往研究显示，YTHDC1作为m6A的关键调节因子在骨关节炎中发挥重要作用，但未进行实验验证[29-30]；而此次研究经体外细胞实验证实，YTHDC1表达在对照组与骨关节炎组中存在显著差异
(P < 0.05)。YTHDC1作为一种定位于核内的m6A读码器，在基因转录、表达和染色质修饰中发挥重要作用[31-32]，其功能多样性可能依赖于核凝聚体的形成[31]。YTHDC1过表达能够上调心肌细胞中线粒体自噬相关基因PINK和PRKN表达，影响能量代谢[33]，而其基因多态性被认为可能与肿瘤易感性有关[34-35]。YTHDC1介导m6A能够激活AKT/mTOR通路，影响骨肉瘤的恶性程度[36]，而AKT/mTOR通路作为影响骨关节炎进展的重要通路[37-39]，YTHDC1是否通过介导该通路作用于骨关节炎值得深入研究。
综上，该文利用生物信息学方法和实验验证m6A关键调节因子YTHDC1与骨关节炎密切相关，有望成为从m6A方面治疗骨关节炎的分子靶点。但文章亦存在局限之处：使用GSE1919数据集进行生物信息学分析存在样本量较少的问题；此外，研究仅进行体外细胞实验验证，后期可采用多数据集、多样本量、动物体内实验优化研究方案，结果将更具说服力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

N6-甲基腺苷相关调节因子与骨关节炎：生物信息学和实验验证分析

N6-methyladenosine related regulatory factors in osteoarthritis: bioinformatics analysis and experimental validation

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