铜死亡调节因子在骨关节炎诊断及亚分型中的作用

doi:10.12307/2023.702

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (34): 5530-5537.doi: 10.12307/2023.702

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铜死亡调节因子在骨关节炎诊断及亚分型中的作用

熊波1，王斌2，刘金富1，陆冠宇1，陈财1，黄悦1，陈莉华1

1广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530299；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2022-09-24 接受日期:2022-11-08 出版日期:2023-12-08 发布日期:2023-04-22
通讯作者: 王斌，主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:熊波，男，1994年生，汉族，湖南省永州市人，广西中医药大学在读硕士，主要从事四肢骨病与创伤的防治研究。
基金资助:
广西中医药大学校级项目(YCXJ2021070)，项目负责人：熊波；广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2022KY0282)；项目负责人：刘金富；广西中医药大学校级项目(YCXJ2021071)，项目负责人：黄悦

Role of cuproptosis regulator in diagnosis and subtype of osteoarthritis

Xiong Bo1, Wang Bin2, Liu Jinfu1, Lu Guanyu1, Chen Cai1, Huang Yue1, Chen Lihua1

1Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-09-24 Accepted:2022-11-08 Online:2023-12-08 Published:2023-04-22
Contact: Wang Bin, Chief physician, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Xiong Bo, Master candidate, Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
School Level Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. YCXJ2021070 (to XB); Basic Research Ability Improvement Project of Young and Middle Aged Teachers of Guangxi Colleges and Universities, No. 2022KY0282 (to LJF); School Level Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. YCXJ2021071 (to HY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

列线图模型：是基于多元分析，根据个体患者特征集成多个预测因子，实现对事物概率的准确预测。
单基因GSEA分析：通过目的基因表达量将样本分为高表达组和低表达组，在已有的基因定位、功能、生物学意义等知识的基础上，构建了一个分子标签数据库，通过分析基因表达数据，得到表达状况是否在某种功能上显著富集。

背景：滑膜在骨关节炎的病程发展过程中发挥着重要作用，而铜死亡是近期最新发现的一种新型细胞程序性死亡，目前尚未有从滑膜角度探究铜死亡基因在骨关节炎中的相关机制研究。
目的：以滑膜为切入点从铜死亡角度探究影响骨关节炎发生发展的潜在机制。
方法：通过GEO数据库检索符合条件的骨关节炎相关芯片，对其进行标准化处理，基于处理后的基因表达矩阵进行铜死亡相关基因提取和量化，通过随机森林树模型、支持向量机模型、机器学习、列线图模型构建疾病预测模型以预测骨关节炎患病的风险。然后，运用共识聚类算法、主成分分析(PCA)、单样本基因组富集分析(ssGSEA)及免疫浸润分析铜死亡分子亚型与免疫微环境及炎症因子的相关性。

结果与结论：①首次建立了基于铜死亡特征基因的风险预测模型，由3个铜死亡特征基因(DBT、LIPT1、FDX1)构建的疾病预测模型可以较好预测骨关节炎患病的风险；②首次发现骨关节炎患者可分型为两种完全不同的铜死亡分子亚型(族A和族B)，族B与Th1/Th2 细胞比例失衡高度相关，具有更高的白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5表达水平。

https://orcid.org/0000-0001-7951-8336 (熊波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 膝骨关节炎, 铜死亡, 预测模型, 机器学习, 免疫浸润, 炎症因子, 分子亚型

Abstract: BACKGROUND: Synovium plays an important role in the development of osteoarthritis, and cuproptosis is a new type of programmed cell death recently discovered, up to now, there is no research on the mechanism of cuproptosis gene in osteoarthritis from synovial angle.
OBJECTIVE: The synovial membrane was used as the entry point to explore the potential mechanism of the development of osteoarthritis from the perspective of cuproptosis.
METHODS: The coincident osteoarthritis related chips were retrieved through Gene Expression Omnibus (GEO) database and standardized. Cuproptosis related genes were extracted and quantified based on the gene expression matrix after treatment. Random Forest model, Support Vector Machines model, Machine learning and Nomogram Model were used to construct disease prediction model to predict the risk of osteoarthritis. Then, consensus clustering algorithm, principal component analysis, single sample gene set enrichment analysis and immune infiltration were used to analyze the correlation of cuproptosis molecular subtypes with immune microenvironment and inflammatory factors.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A risk prediction model based on cuproptosis characteristic gene was established for the first time. The disease prediction model constructed by three cuproptosis characteristic genes (DBT, LIPT1, FDX1) could predict the risk of osteoarthritis. (2) It is found for the first time that patients with osteoarthritis can be classified into two distinct subtypes of cuproptosis molecule (cluster A and cluster B). Cluster B is highly correlated with the imbalance of Th1/Th2 cell ratio, and has higher expression levels of interleukin-2, interleukin-4, and interleukin-5.

Key words: knee osteoarthritis, cuproptosis, prediction model, machine learning, immune infiltration, inflammatory factor, molecular subtype

中图分类号:

熊波, 王斌, 刘金富, 陆冠宇, 陈财, 黄悦, 陈莉华. 铜死亡调节因子在骨关节炎诊断及亚分型中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(34): 5530-5537.

Xiong Bo, Wang Bin, Liu Jinfu, Lu Guanyu, Chen Cai, Huang Yue, Chen Lihua. Role of cuproptosis regulator in diagnosis and subtype of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(34): 5530-5537.

图/表（结果） 7

2.1 铜死亡基因的差异分析为分析铜死亡相关基因在骨关节炎和非骨关节炎患者之间的表达差异，课题组利用t检验分析方法一共筛选出9个与骨关节炎密切相关的铜死亡特征基因，与健康对照组相比SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、PDHA1、PDHB在骨关节炎患者中呈现过表达，而NFE2L2、GLS、DBT在骨关节炎患者中为低表达，见图1。

2.2 模型的构建与选择从9个铜死亡差异基因中构建了随机森林树和支持向量机模型用于预测骨关节炎疾病的发生。研究显示：“残差箱线图”(图2A)和“残差反向累计分布图”(图2B)均表明随机森林树模型的残差最小，说明选择随机森林树模型用于预测骨关节炎疾病的发生更有意义。因此，随机森林树模型在此研究中定为预测骨关节炎疾病发生的最佳模型。ROC曲线(图2C)的AUC值也同样表明随机森林树模型比支持向量机模型具有更高的准确性。绘制特征基因的重要性评分图(图2D)评分的高低决定基因的重要性，选择评分> 4的特征基因用于后续的分析。

2.3 构建列线图模型预测骨关节炎的患病率将上一步筛选获得的关于骨关节炎的铜死亡特征基因，基因得分> 4的基因构建列线图模型(图3A)，获得了每个基因在骨关节炎疾病中的评分，总和这些特征基因的评分，并根据评分情况以预测骨关节炎的患病率。校准曲线图(图3B)显示该列线图模型诊断骨关节炎阳性率与实际阳性率相一致。在决策分析曲线图(图3C)中研究发现，在0-1之间，表明列线图模型比单个特征基因具有更高的临床价值，对预测骨关节炎疾病的发生具有意义。临床影响曲线(图3D)中同样预示着列线图模型具有较强的预测能力。

2.4 基因分型分析基于9个铜死亡特征基因的表达对骨关节炎样本进行了共识聚类分析，通过分析这些铜死亡特征基因的不同表达，可确定两种不同的骨关节炎亚型[cluster A(族A)、cluster B(族B)](图4A)。将两种亚型进行PCA分析后，结果表明(图4B)9个铜死亡特征基因可以区分完全不同的两种模式，且两种族群之间存在明显差异。绘制热图和箱线图以说明这些铜死亡特征基因在两个族群之间的差异表达水平。族群中热图及箱线图(图4C，D)可见NFE2L2、FDX1、GLS、DBT在族B中的表达量高于族A；而SLC31A1、LIAS、LIPT1、PDHA1、PDHB在族B中的表达量低于族A。

2.5 免疫浸润分析单样本基因组富集分析(ssGSEA)结果显示(图5A)，族A组患者高表达的主要有肥大细胞、γδT细胞、CD56高表达自然杀伤细胞，而族B组患者高表达的主要有Th1辅助细胞、Th2辅助细胞、免疫B细胞。研究还评估了其与免疫细胞之间的相关性(图5B)，可以发现，DBT与许多免疫细胞呈正相关，随后进一步探究了骨关节炎患者中DBT高表达和低表达间的免疫细胞浸润相关差异(图5C)，结果表明高DBT表达的骨关节炎患者免疫功能较强。

2.6 铜死亡基因模式和特征基因的鉴定为了进一步验证铜死亡的基因模式，使用共识聚类方法根据20个铜死亡相关差异表达基因将骨关节炎患者分为不同的基因组亚型。研究发现可存在两种不同的铜死亡基因模式(基因族A和基因族B)，这与铜死亡模式的分组相一致(图6A)。基因族A和基因族B中20个铜死亡相关DEGs的表达水平见图6B。图6C，D结果表明，9个铜死亡特征基因的差异表达水平及基因族A和基因族B之间的免疫细胞浸润也与铜死亡模式中的结果相近，再进一步验证了共识聚类方法分组的准确性；且为了量化铜死亡模式，利用PCA算法计算了在两种不同的铜死亡模式或铜死亡基因模式之间每个样本相应的铜死亡分数，结果显示(图6E，F)，族B或基因族B的铜死亡得分高于族A和基因族A。

2.7 铜死亡模式在骨关节炎中的作用铜死亡模式、铜死亡基因模式和铜死亡评分之间的关系以桑基图的形式展现(图7A)。为了进一步揭示铜死亡模式与骨关节炎之间的关系，研究了铜死亡模式与骨关节炎之间的关系，通过探究铜死亡与白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素13之间的相关性，结果表明(图7B，C)，族B或基因族B中的白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5的表达水平高于族A或基因族A，这表明族B或基因族B与以炎症反应为特征的骨关节炎高度相关。

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引言

骨关节炎是以关节软骨退变、骨赘形成、软骨下骨重塑和滑膜炎症为特征的慢性退行性关节疾病。世界卫生组织将骨关节炎称为“第一致残疾病”，目前的医疗手段只能在一定程度上减轻患者的症状体征，延缓疾病的进展，难以从根本上治疗此病[1-3]。而目前骨关节炎的发病机制尚不清楚，滑膜是关节内部结构与骨骼肌肉组织连接的桥梁，其分泌的透明质酸可以保持关节软骨面的润滑、减小关节活动时产生的摩擦力并为关节内的其他软组织提供营养，从而保持关节软骨表面的完整性[4-5]。但是，人们对骨关节炎的研究大多集中于软骨细胞，而滑膜细胞病变被认为是软骨破坏的继发性改变，一直未被重视，随着对骨关节炎的深入研究，越来越多的研究数据表明，骨关节炎是一种与滑膜组织密切相关的关节疾病，可由滑膜与多种组织如软骨、骨等之间通过分泌可溶性介质进行相互作用诱发[6-7]。然而，目前滑膜病变在骨关节炎发生发展中的机制尚不明确，因此，该研究从滑膜的角度出发探究骨关节炎的潜在机制和诊断标志物，对于寻找骨关节炎的治疗靶点、改善患者症状体征及预后方面有重要意义。
铜是维持从微生物到植物、非人类动物以及人类生命活动的基本元素，其作为必需酶的辅助因子发挥着必不可少的作用。正常情况下，细胞内铜离子浓度通过主动稳态机制保持在较低水平[8]；当铜离子水平逐渐累积超过阈值后，过载的铜离子会导致细胞的过度呼吸作用，产生细胞毒性最终诱导其死亡[9]。2022-03-17，一篇发表在国际学术期刊《Science》上的研究显示，在人类细胞中铜依赖性受控细胞死亡是一种不同于已知细胞死亡机制的新型细胞死亡方式，研究团队将这种细胞死亡方式命名为铜死亡，它是通过铜离子与线粒体呼吸中的三羧酸循环中的脂酰化成分直接结合而发生的，导致脂酰化蛋白质聚集和随后的铁硫簇蛋白下调，从而使得蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡[8]。目前尚未有从滑膜角度探究铜死亡基因在骨关节炎中的相关机制研究。
随着高通量测序技术的发展和推广应用，许多疾病病理过程中的转录组等信息可被获取，这些海量的数据将极大地助力人类深入探索疾病的发生、发展和转归等的机制和规律[10-11]。在骨科领域，国内外已有部分研究基于高通量测序技术，运用生物信息学方法筛选骨关节炎生物标志物的相关研究，但是存在样本量较少、数据分析方法单一的问题。机器学习作为人工智能的一个子集，已被广泛应用于多个医学领域[12-13]。在心血管方面，机器学习已被应用于探索疾病生物标志物、发病机制、治疗靶点、预测生存结局及保健等方面[13-15]。由于集成学习方法具有良好的准确性和泛化能力，近年来受到了医疗大数据研究者的关注。随机森林树(RandomForest，RF)作为集成学习方法之一，在癌症存活性预测研究中逐渐流行，其较之于人工神经网络、Logistic回归以及等模型具有更高的预测精度[16-17]。支持向量模型是最近广泛使用的一种机器学习技术，按照边距计算的原理，在两个类别之间创建一个决策边界，使边距与类别之间的距离最大，从而使分类的误差最小。支持向量机(support vector machines，SVM)的分类功能也扩大了其在癌症基因组学中的用途，在癌症基因组分类或分型中，可以用来发现新的生物标志物、新的药物靶点以及深层次的理解癌症诱导的基因等[18]。此次研究对随机森林树及支持向量模型进行对比，从而选择最佳的模型。
列线图模型是基于多元分析，根据个体患者特征集成多个预测因子，实现对事物概率的准确预测，可以用于多指标联合诊断或预测疾病发病或进展，近些年来在高质量临床论文中用的越来越多[19]。基于此，该研究通过GEO数据库检索符合条件的骨关节炎相关芯片，对其进行标准化处理，基于处理后的基因表达矩阵进行铜死亡相关基因提取和量化，通过随机森林树模型、支持向量机机器学习、列线图模型建立了一个基于3个候选铜死亡调节因子(DBT、LIPT1、FDX1)的基因预测模型来预测骨关节炎易感性，并发现基于该模型可有效判断骨关节炎患者预后，从而为临床决策提供据。此外，运用共识聚类算法、主成分分析(principal component analysis，PCA)揭示了两种不同的铜死亡分子亚型模式，随后，对铜死亡基因分型结果进行单样本基因富集分析(single-sample gene-set enrichment analysis，ssGSEA)及免疫浸润分析，为进一步研究骨关节炎发病机制，挖掘潜在的生物标志物，为其诊断和治疗提供有效的分子靶点，也将为组织工程技术治疗骨关节炎提供新视角。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计构建疾病预测模型。
1.2 时间及地点实验于2022年3-9月在广西中医药大学第一附属医院分子实验室完成。
1.3 材料

1.3.1 数据来源基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一个用于储存基因表达谱、原始序列以及平台记录的公共基因组学数据库，使用关键词“osteoarthritis”，在NCBI GEO数据库上搜索微阵列数据集，并下载了4个骨关节炎相关数据集，共包含25个健康滑膜样本和44个骨关节炎滑膜样本，见表1。

1.3.2 纳入标准 ①通过阵列或高通量测序的mRNA表达谱；②数据集中组织样本需来自于人体滑膜；③健康组和骨关节炎组的样本量总计需60例及以上。
1.4 方法
1.4.1 数据整合与预处理将4个数据集分别使用Perl软件进行注释，将探针与平台注释信息相对应，并将探针的名称转换为基因名，予以合并4个数据集。利用R语言软件(版本 4.2.0)中 limma包将原始数据转换为表达式数据。通过R语言中的Bioconductor注释功能，把探针组的表达水平转换为基因表达水平，予给定基因的多个探针的表达值取均值。随后，将得到的包含基于4个GEO系列的基因矩阵的表达值文件进行批量归一化处理，以消除不同研究之间的系统差异，最后得到以行名为样本名、列名为基因名的基因矩阵文件以用作后续的分析。
1.4.2 提取铜死亡相关基因及差异表达分析铜死亡基因则来源于TSVETKOV团队近期的一项报道[20]。结合标准化后基因表达矩阵得到铜死亡相关基因表达矩阵文件。随后，使用R中“reshape2”和“ggpubr”软件包，分析并识别与骨关节炎相关且显著的铜死亡差异基因(differentially expressed genes，DEGs)，将表达数据转换成ggplot2输入文件，用于绘制热图与箱线图。
1.4.3 构建并选择疾病预测模型由于集成学习方法具有良好的准确性和泛化能力，近年来受到了医疗大数据研究者的关注。随机森林树模型作为集成学习方法之一，在癌症存活性预测研究中逐渐流行，其融合了bagging算法和随机特征算法的概念，是一种有效的监督学习方法，更优于其他机器学习算法和线性回归模型[21]。研究中，使用R软件中的“randomforest”软件包构建随机森林树模型，从20个铜死亡相关基因筛选出符合条件的特征基因作为自变量，将骨关节炎患者作为因变量，用于预测骨关节炎疾病的发生。支持向量机是最近广泛使用的一种机器学习技术，其基于统计学习理论中结构风险最小化原理的有监督机器学习算法，从而使分类的误差最小[22]，使用其构建支持向量机模型，绘制“残差反向累计分布图”“残差箱线图”“受试者工作特征(ROC)曲线”对模型进行综合评价。
1.4.4 构建列线图模型预测骨关节炎的患病率为预测骨关节炎的患病率，在上一步选择预测模型的基础上，利用“rms”包基于选定的候选铜死亡特征基因，构建了列线图模型。根据列线图模型中各个影响因素对结局变量的影响程度的高低(回归系数的大小)，给每个影响因素的每个取值水平进行赋分，然后再将各个评分相加得到总评分，最后通过总评分与结局事件发生概率之间的函数转换关系，从而计算出该个体结局事件的预测概率。为了验证该模型的准确性，研究还绘制了“校准曲线”“决策分析曲线(DCA)”“临床影响曲线”用于评估预测值与实际值的一致性。在结果中，为了进一步评估基于该模型的决策是否对患者有利，列线图模型中将对特征基因进行逐个评分，总值越高，骨关节炎患病率也就越高。
1.4.5 骨关节炎铜死亡特征基因的分型及免疫浸润分析集群的数量及其稳定性由使用“ConsensusClusterPlus”包的共识聚类算法提供[23]，可用于识别铜死亡基因的相关模式。首先，只保留疾病组样本，将骨关节炎患者分为几个亚组，最大亚组分类k=9，选择最优分组以研究铜死亡特征基因在骨关节炎中的作用；其后，为了量化铜死亡模式及进一步确定以上分组是否正确，研究进行了主成分分析(PCA)；再利用“GSEABase”“GSVA”包对铜死亡基因分型结果进行单样本基因组富集分析(ssGSEA)，通过得到样本中基因表达水平的排序，求和这些基因的表达水平。基于以上研究便可以得到每个样本中免疫细胞的丰度及这些显著的铜死亡特征基因与免疫细胞之间的相关性。随后，用“ggplot2”“ggalluvial”包，通过R版本4.2.0分析铜死亡分型结果、铜死亡基因分型结果和铜死亡基因高低评分之间的分流变化。
1.5 主要观察指标 ①铜死亡基因的差异分析；②模型的构建与选择；③构建列线图模型预测骨关节炎的患病率；④基因分型分析；⑤免疫浸润分析；⑥铜死亡基因模式和特征基因的鉴定；⑦铜死亡模式在骨关节炎中的作用。
1.6 统计学分析所有参数分析都基于双侧检验，Kruskal-Wallis检验用于比较组间的差异，采用线性回归分析探讨关键基因与差异表达的免疫细胞之间的相关性。t检验分析方法筛选出与骨关节炎密切相关的铜死亡特征基因，P < 0.05认为结果有统计学意义。使用R版本4.2.0进行所有统计分析。文章的统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

随着科学技术的迅猛发展，互联网技术日新月异，推动着各行各业的发展，与此同时信息量急速增长。生物信息学分析可从大数据中分析有用的潜在价值规律，得出预判性的结果，对于各个领域都有着积极的现实意义。机器学习作为实现人工智能的重要方法，无需显式编程即可处理机器的自动学习，主要内容是执行基于数据的预测，在生物信息学领域已经广泛应用，机器学习方法可对医疗大数据进行分析挖掘，寻找到疾病的相关治疗和演变知识，建立相应的预测模型，辅助医生进行决策，对于协助医疗行业提供好的医疗服务、节省患者和医疗成本都有着非常重要的意义[17]。铜死亡是近期新发现的一种细胞死亡形式，其特征是细胞内游离铜积累，蛋白质脂化导致细胞毒性应激，从而诱导细胞死亡[8]。然而目前尚未有铜死亡在骨关节炎中的相关机制研究。基于此，此次研究首次利用基因表达综合数据库探讨了骨关节炎患者铜死亡相关基因的预后作用，对骨关节炎和非骨关节炎患者样本之间进行了差异表达分析，分别建立了随机森林树、支持向量机模型以预测骨关节炎的患病情况，且基于随机森林树模型的更优性，构建了一个可以为患者制定短期诊疗方案的预测性列线图模型，决策分析曲线和临床影响曲线分析均表明，该模型具有独特的临床诊断优势。最终研究确定了3个与骨关节炎相关的铜死亡特征基因DBT、LIPT1和FDX1。
DBT调节着支链氨基酸的降解，是线粒体多酶支链α-酮酸脱氢酶复合体的转酰基酶组分[24]。DBT通过调控蛋白质脂酰化代谢的过程，导致脂酰化蛋白质聚集，继而铁硫簇蛋白表达下调，从而诱导蛋白质毒性应激并最终导致细胞铜死亡[8]。LIPT1是编码线粒体硫辛酸途径的重要基因[8]。ABDUL等[25]的研究表明，使用硫辛酸激动剂进行治疗时，硫辛酸可通过调节免疫系统减少肥胖诱导的机体炎症。另外，线粒体脂肪酸的合成与LIPT1密不可分[26]。一项研究表明，取自骨关节炎的成骨细胞在游离脂肪酸的诱导下，会分泌更多的促炎细胞因子，而相关通路的信号分子表达却未有改变，这表明游离脂肪酸参加软骨下骨损伤可能更多依赖于炎症反应和免疫系统，而非相关信号通路[27]。因此，此次研究推测LIPT1通过编码线粒体硫辛酸及脂肪酸的合成调节免疫系统减少机体炎症进而延缓骨关节炎进程。FDX1编码一种小的铁硫蛋白，参与线粒体细胞色素的减少和各种类固醇激素的合成[28]。而在TSVETKOV等[8]的研究当中，FDX1是铜死亡的关键调控因子，它可将Cu2+ 还原为更具有毒性的 Cu+，导致细胞毒性应激，从而诱导细胞铜死亡。并且它同时还是蛋白质脂酰化的上游调节因子，敲除脂酰化蛋白的关键上游调节因子FDX1或脂酰化相关酶则可以阻断铜死亡[8]。近期的一项肺癌研究显示，FDX1的敲除可改善线粒体代谢功能障碍，从而减轻机体的炎症反应[29]。综合此次研究及上所述，暗示了骨关节炎和DBT、LIPT1和 FDX1之间的密切联系。然而，目前没有从滑膜角度探讨铜死亡调节因子与骨关节炎之间关系的报道，此研究的结果将有助于加深对铜死亡在骨关节炎中作用的理解，并可能为未来的研究提供新的方向。
在骨关节炎发病过程中软骨碎片落入骨关节内，免疫细胞被激活并募集到滑膜组织产生炎症因子，可见骨关节炎患者的滑膜组织中存在炎症因子浸润，且滑膜炎的严重程度与骨关节炎症状及疾病进展密切相关[30-32]。Th1/Th2细胞是一组互相作用的效应性T细胞，其细胞比例动态失衡是骨关节炎发展的因素之一，Th1细胞主要分泌肿瘤坏死因子β、干扰素γ和白细胞介素2等炎症递质，而Th2细胞主要产生白细胞介素4，白细胞介素4可抑制Th1细胞的功能[33]。
Monasterio等[34]研究发现，Th1/Th2细胞比例失衡后产生的炎症因子通过调控RANKL/RANK信号通路，诱导破骨细胞形成从而加速关节炎症反应，导致骨关节炎患者的病情进一步加重。Th1细胞产生的白细胞介素2对破骨细胞有激活作用，进而加重软骨下骨破坏，发生骨质重建，导致新的骨赘形成[35-36]。Castrogiovanni等[37]对前交叉韧带切断(ACLT)模型大鼠进行体育锻炼治疗，通过检测滑膜分析发现，与骨关节炎模型大鼠相比，前交叉韧带切断模型大鼠的白细胞介素4水平显著上调。ROSSHIRT等[38]分析 55例终末期膝骨关节炎患者的滑膜、滑液样品发现滑液中的免疫调节细胞因子(如白细胞介素2)水平均显著升高，但白细胞介素4水平降低，大量T淋巴细胞被极化为 CD3+、CD4+和 CD8+T 细胞亚群，其中Th1细胞增加最为显著。HE等[39]发现，白细胞介素4 基因敲除的小鼠基质金属蛋白酶13水平降低从而影响软骨合成。可见白细胞介素4在骨关节炎中的具体分子机制尚不明确，存在争议。因此关于白细胞介素4在骨关节炎中的具体作用机制还有待进一步的深入研究。白细胞介素5影响Th1/Th2细胞比例失衡，并通过释放不同的细胞因子，激活相关细胞凋亡通路，造成软骨丢失、降解以及软骨下骨骨重建、滑膜炎症等，最终发展为骨关节炎[40-41]。以上研究表明，Th1/Th2细胞比例失衡可激活破骨细胞、加速炎症反应，并导致软骨基质降解，破坏软骨细胞外稳态。可见，已有少数人发现骨关节炎患者滑膜中T细胞聚集，且认识到其在骨关节炎炎症反应中的重要作用[42-43]，但是T细胞的相关作用未引起重视，并且尚无检测与骨关节炎诊断相关的T细胞中的敏感指标。因此，此次研究使用共识聚类方法基于9个重要的铜死亡调节因子确定了两种铜死亡模式(族A 和族B)，且两种分类模式均可以有效地区分为两种族群，结果表明骨关节炎患者有两种完全不同的亚型。族B与Th1/Th2 细胞比例失衡高度相关，具有更高的白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5表达水平。综上所述，虽然现有研究成果尚不能完全证明铜死亡相关基因在骨关节炎免疫调控方面的因果关系，但根据以往的研究和此次研究结果可以推测，铜死亡基因可能在骨关节炎免疫浸润方面发挥着重要作用，然而目前尚无铜死亡与免疫及炎症因子相关性研究，此次研究探讨铜死亡模式与骨关节炎及炎症因子之间的关系，预测了未来骨关节炎临床诊疗中的一些潜在方向。
结论：在这项研究中，首次建立了基于铜死亡特征基因的风险预测模型，可以较好预测骨关节炎患病的风险；此外，还首次发现骨关节炎患者可分型为两种完全不同的铜死亡分子亚型(族A 和族B)，族B与Th1/Th2 细胞比例失衡高度相关，具有更高的白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素5表达水平。研究的分析结果对于后续铜死亡在骨关节炎免疫方面的基础研究具有一定的参考价值，可在一定程度上减少实验中不必要的浪费。然而文章仍存在一定的不足：第一，尽管对原始数据进行了质量控制、均质化和标准化，消除了批间差异，但仍有可能因样本量过少从而导致结果存在一定偏倚，并且单一的滑膜组织样本缺乏广泛的代表性；第二，尽管已经筛选出骨关节炎相关的铜死亡基因，但未进行更深层的实验验证，进一步明确其在骨关节炎中的功能及作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

铜死亡调节因子在骨关节炎诊断及亚分型中的作用

Role of cuproptosis regulator in diagnosis and subtype of osteoarthritis

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