芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

doi:10.12307/2023.753

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (33): 5309-5313.doi: 10.12307/2023.753

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

谢娜1，2，马润1，王联1，2，舒远辉1，2，何萍1，2，周艳1，2，项一宁3，王豫萍1，2

1贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院，2临床检验中心，3病理科，贵州省贵阳市 550003

收稿日期:2022-10-31 接受日期:2022-12-12 出版日期:2023-11-28 发布日期:2023-03-30
通讯作者: Wang Yuping, Professor, Doctoral supervisor, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Center for Clinical Laboratories, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550003, Guizhou Province, China
作者简介:谢娜，女，1995年生，四川省巴中市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事肝纤维化的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860118，81460125)，项目负责人：王豫萍；贵州省卫健委科学技术基金(gzwkj2021-119)，项目负责人：王豫萍；贵州省教育厅创新群体项目(黔教合KY字[2021]016)，项目参与人：王豫萍

Effect of formononetin on glucose oxidase-induced oxidative stress in rat hepatic stellate cells

Xie Na1, 2, Ma Run1, Wang Lian1, 2, Shu Yuanhui1, 2, He Ping1, 2, Zhou Yan1, 2, Xiang Yining3, Wang Yuping1, 2

1School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Center for Clinical Laboratories, 3Department of Pathology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550003, Guizhou Province, China

Received:2022-10-31 Accepted:2022-12-12 Online:2023-11-28 Published:2023-03-30
Contact: 王豫萍，教授，博士研究生导师，贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550003
About author:Xie Na, Master candidate, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Center for Clinical Laboratories, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550003, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860118, No. 81460125 (to WYP); Guizhou Provincial Health Commission Science and Technology Fund, No. gzwkj2021-119 (to WYP); Guizhou Provincial Department of Education Innovation Group Project, No. Qian Jiaohe KY[2021]016 (to WYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

芒柄花素：是一种天然异黄酮化合物，广泛富含于红车轴草、黄芪、甘草等药用植物中，具有抗炎、抗氧化和免疫调节等特性，在高脂血症、糖尿病、肿瘤和心血管疾病中发挥着重要作用。
氧化应激：是有害刺激物引起细胞、组织、器官的氧化和抗氧化机制失衡，是参与肝星状细胞活化和肝脏疾病发展的关键因素。

背景：研究发现，芒柄花素具有抗氧化、抗炎和免疫调节等生物活性。然而，芒柄花素是否具有调节葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的作用尚不明确。
目的：探究芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞HSC-T6氧化应激的作用及可能的机制。
方法：实验分为对照组，模型组，芒柄花素低、中、高剂量组和姜黄素组。对照组不做任何处理，模型组用葡萄糖氧化酶处理2 h，芒柄花素组和姜黄素组先用不同浓度的芒柄花素或姜黄素处理HSC-T6细胞24 h，再用葡萄糖氧化酶处理2 h。采用CCK8法检测芒柄花素对HSC-T6细胞活力的影响；化学试剂盒检测各组细胞中超氧化物歧化酶和丙二醛水平；DCFH-DA荧光探针检测各组细胞中活性氧表达；ELISA检测各组细胞培养上清液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平；免疫细胞荧光染色观察各组细胞中Ⅰ型胶原表达；Western blot检测各组细胞中Ⅰ型胶原、NOX4和Nrf2蛋白表达。

结果与结论：①与模型组比较，芒柄花素能抑制HSC-T6细胞的活化增殖(P < 0.05)；②与对照组比较，模型组HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活性和Nrf2蛋白表达均明显减低(P < 0.05)，而丙二醛、活性氧、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、Ⅰ型胶原和NOX4蛋白表达明显增加(P < 0.05)；③与模型组比较，芒柄花素处理组和姜黄素组HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活性和Nrf2蛋白表达均明显增加(P < 0.05)，而丙二醛、活性氧、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子 α、Ⅰ型胶原和NOX4蛋白表达明显降低(P < 0.05)；④结果表明芒柄花素能通过Nrf2/NOX4信号通路抑制葡萄糖氧化酶诱导的肝星状细胞活化增殖。

https://orcid.org/0000-0002-1595-7425 (谢娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 芒柄花素, 肝星状细胞, 氧化应激, 炎症因子, NOX4, Nrf2

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that formononetin possesses potent anti-inflammatory, oxidative stress and immunomodulatory properties. However, it is still unclear whether formononetin can regulate the oxidative stress induced by glucose oxidase in rat hepatic stellate cells.
OBJECTIVE: To investigate the possible mechanism and the effect of formononetin on oxidative stress in rat hepatic stellate cells HSC-T6 induced by glucose oxidase.
METHODS: The experiment contained control group, model group, low-, medium- and high-dose formononetin groups and curcumin group. The control group was not subjected to any treatment; the model group was treated with glucose oxidase for 2 hours; the formononetin and curcumin groups were treated with different concentrations of formononetin or curcumin for 24 hours, followed by glucose oxidase for 2 hours. CCK8 assay was used to investigate the effect of formononetin on HSC-T6 cell viability. Chemical kits were used to measure the contents of superoxide dismutase and malondialdehyde in each group. DCFH-DA fluorescence staining was performed to determine reactive oxygen species expression in each group. ELISA was performed to measure interleukin 1β and tumor necrosis factor α in each group. Immunofluorescence staining was used to detect the expression of type I collagen in each group. Western blot assay was used to measure the protein level of type I collagen, NOX4 and Nrf2 in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, formononetin could inhibit the activation and proliferation of HSC-T6 cells (P < 0.05). (2) Compared with the control group, superoxide dismutase activity and Nrf2 protein expression of HSC-T6 cells in the model group were significantly down-regulated (P < 0.05), while malondialdehyde, reactive oxygen species, interleukin 1β, tumor necrosis factor α, type I collagen and NOX4 protein expression levels were significantly up-regulated (P < 0.05). (3) Compared with the model group, superoxide dismutase activity and Nrf2 protein expression of HSC-T6 cells in formononetin treatment groups and curcumin group were significantly increased (P < 0.05), while malondialdehyde, reactive oxygen species, interleukin 1β, tumor necrosis factor α, type I collagen and NOX4 protein expression levels were markedly decreased (P < 0.05). (4) The results suggested that formononetin could inhibit glucose oxidase-induced activation and proliferation of hepatic stellate cells by regulating the Nrf2/NOX4 signaling pathway.

Key words: formononetin, hepatic stellate cell, oxidative stress, inflammatory factor, NOX4, Nrf2

中图分类号:

谢娜, 马润, 王联, 舒远辉, 何萍, 周艳, 项一宁, 王豫萍. 芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5309-5313.

Xie Na, Ma Run, Wang Lian, Shu Yuanhui, He Ping, Zhou Yan, Xiang Yining, Wang Yuping. Effect of formononetin on glucose oxidase-induced oxidative stress in rat hepatic stellate cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(33): 5309-5313.

图/表（结果） 7

2.1 芒柄花素对HSC-T6细胞活力的影响为了明确芒柄花素对HSC-T6细胞活力的影响，分别用不同浓度芒柄花素(5，10，20，40，80，160，320 μmol/L)给药处理24 h，结果发现5-80 μmol/L芒柄花素对HSC-T6细胞增殖无显著影响，而160 μmol/L和320 μmol/L 芒柄花素则显著抑制HSC-T6细胞增殖(P < 0.05)，见图1A。除去高浓度芒柄花素对细胞产生毒性的影响，因此选择10，20，40 μmol/L芒柄花素做后续实验。如图1B所示，与对照组比较，葡萄糖氧化酶刺激使HSC-T6细胞活力明显增加，而给予芒柄花素和姜黄素预处理则HSC-T6细胞活力明显降低(P < 0.05)。

2.2 芒柄花素对葡萄糖氧化酶刺激HSC-T6细胞氧化应激指标的影响与对照组比较，模型组HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活力显著下降(P < 0.05)，而丙二醛水平和活性氧表达显著增加(P < 0.05)；与模型组比较，芒柄花素组和姜黄素组HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活力显著增加(P < 0.05)，丙二醛水平和活性氧表达明显降低(P < 0.05)，见表1，图2。

2.3 芒柄花素对葡萄糖氧化酶刺激HSC-T6细胞炎症因子表达的影响与对照组比较，模型组HSC-T6细胞中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平显著增加(P < 0.05)，然而经芒柄花素和姜黄素预处理可减低HSC-T6细胞中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平(P < 0.05)，见表2。

2.4 芒柄花素对葡萄糖氧化酶刺激HSC-T6细胞Ⅰ型胶原表达的影响与对照组比较，模型组HSC-T6细胞Ⅰ型胶原荧光及蛋白表达明显增强；与模型组比较，芒柄花素处理组和姜黄素组HSC-T6细胞Ⅰ型胶原荧光及蛋白表达均降低，见图3。

2.5 芒柄花素对葡萄糖氧化酶刺激HSC-T6细胞中NOX4、Nrf2蛋白表达的影响与对照组比较，模型组HSC-T6细胞中NOX4蛋白表达显著增加，Nrf2蛋白表达减少(P < 0.05)；与模型组比较，芒柄花素处理组和姜黄素组HSC-T6细胞中NOX4蛋白表达明显减少，Nrf2蛋白表达明显增加(P < 0.05)，见图4，表3。

参考文献

[1] ALTAMIRANO-BARRERA A, BARRANCO-FRAGOSO B, MÉNDEZ-SÁNCHEZ N. Management strategies for liver fibrosis. Ann Hepatol. 2017;16(1):48-56.
[2] AYDIN MM, AKÇALI KC. Liver fibrosis. Turk J Gastroenterol. 2018;29(1):14-21.
[3] LAMBRECHT J, VAN GRUNSVEN LA, TACKE F. Current and emerging pharmacotherapeutic interventions for the treatment of liver fibrosis. Expert Opin Pharmacother. 2020;21(13):1637-1650.
[4] HIGASHI T, FRIEDMAN SL, HOSHIDA Y. Hepatic stellate cells as key target in liver fibrosis. Adv Drug Deliv Rev. 2017;121:27-42.
[5] RAMOS-TOVAR E, MURIEL P. Molecular Mechanisms That Link Oxidative Stress, Inflammation, and Fibrosis in the Liver. Antioxidants (Basel). 2020;9(12):1279.
[6] WANG T, ZHOU X, KUANG G, et al. Paeoniflorin modulates oxidative stress, inflammation and hepatic stellate cells activation to alleviate CCl4-induced hepatic fibrosis by upregulation of heme oxygenase-1 in mice. J Pharm Pharmacol. 2021;73(3):338-346.
[7] 傅月朦,余登香,王淑娜,等.山豆根黄酮类成分药理作用及机制研究进展[J].中草药,2022,53(19):6234-6244.
[8] ZHANG YZ, ZHANG J, TAN L, et al. Preparation and evaluation of temperature and magnetic dual-responsive molecularly imprinted polymers for the specific enrichment of formononetin. J Sep Sci. 2018;41(15):3060-3068.
[9] MACHADO DUTRA J, ESPITIA PJP, ANDRADE BATISTA R. Formononetin: Biological effects and uses - A review. Food Chem. 2021;359:129975.
[10] FANG Y, YE J, ZHAO B, et al. Formononetin ameliorates oxaliplatin-induced peripheral neuropathy via the KEAP1-NRF2-GSTP1 axis. Redox Biol. 2020;36:101677.
[11] WANG Y, ZHAO H, LI X, et al. Formononetin alleviates hepatic steatosis by facilitating TFEB-mediated lysosome biogenesis and lipophagy. J Nutr Biochem. 2019;73:108214.
[12] ALAUDDIN, CHATURVEDI S, MALIK MY, et al. Formononetin and biochanin A protects against ritonavir induced hepatotoxicity via modulation of NfκB/pAkt signaling molecules. Life Sci. 2018;213:174-182.
[13] FARZAEI MH, ZOBEIRI M, PARVIZI F, et al. Curcumin in Liver Diseases: A Systematic Review of the Cellular Mechanisms of Oxidative Stress and Clinical Perspective. Nutrients. 2018;10(7): 855.
[14] BOUREBABA N, MARYCZ K. Hepatic stellate cells role in the course of metabolic disorders development - A molecular overview. Pharmacol Res. 2021;170:105739.
[15] CAI X, WANG J, WANG J, et al. Intercellular crosstalk of hepatic stellate cells in liver fibrosis: New insights into therapy. Pharmacol Res. 2020;155:104720.
[16] 赵杰,齐永芬,鱼艳荣.氧化应激在肝纤维化发生发展中的作用[J].临床肝胆病杂志,2019,35(9):2067-2071.
[17] LUO X, SUN D, WANG Y, et al. Cpt1a promoted ROS-induced oxidative stress and inflammation in liver injury via the Nrf2/HO-1 and NLRP3 inflammasome signaling pathway. Can J Physiol Pharmacol. 2021;99(5):468-477.
[18] TAY KC, TAN LT, CHAN CK, et al. Formononetin: A Review of Its Anticancer Potentials and Mechanisms. Front Pharmacol. 2019;10:820.
[19] 白月,王红芳,黄怀鹏.芒柄花素药理作用的研究进展[J].现代药物与临床, 2022,37(2):425-432.
[20] 李军,熊琨,龚元,等.基于信号转导通路的姜黄素抗氧化机制研究进展[J].中草药,2016,47(13):2373-2380.
[21] REZZANI R, FRANCO C, RODELLA LF. Curcumin as a Therapeutic Strategy in Liver Diseases. Nutrients. 2019;11(10):2498.
[22] 王丽,何萍,孙建超,等.蓝莓花青素对氧化应激诱导肝星状细胞活化、增殖和凋亡的影响及机制探讨[J].山东医药,2016,56(18):8-11.
[23] LUANGMONKONG T, SURIGUGA S, MUTSAERS HAM, et al. Targeting Oxidative Stress for the Treatment of Liver Fibrosis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2018;175:71-102.
[24] 吕艳杭,吴姗姗,王振常,等.中医药调控活性氧(ROS)抗肝纤维化的研究进展[J].中华中医药学刊,2021,39(6):117-121.
[25] SUN J, WU Y, LONG C, et al. Anthocyanins isolated from blueberry ameliorates CCl4 induced liver fibrosis by modulation of oxidative stress, inflammation and stellate cell activation in mice. Food Chem Toxicol. 2018;120:491-499.
[26] DE SOUZA BASSO B, HAUTE GV, ORTEGA-RIBERA M, et al. Methoxyeugenol deactivates hepatic stellate cells and attenuates liver fibrosis and inflammation through a PPAR-ɣ and NF-kB mechanism. J Ethnopharmacol. 2021;280:114433.
[27] RODRÍGUEZ MJ, SABAJ M, TOLOSA G, et al. Maresin-1 Prevents Liver Fibrosis by Targeting Nrf2 and NF-κB, Reducing Oxidative Stress and Inflammation. Cells. 2021;10(12):3406.
[28] 罗方云,黄晨恺,朱萱. NOX4相关信号通路在肝纤维化发病机制中的作用[J].医学研究生学报,2019,32(3):298-302.
[29] JIMÉNEZ-URIBE AP, GÓMEZ-SIERRA T, APARICIO-TREJO OE, et al. Backstage players of fibrosis: NOX4, mTOR, HDAC, and S1P; companions of TGF-β. Cell Signal. 2021; 87:110123.
[30] DU JJ, SUN JC, LI N, et al. β-Arrestin2 deficiency attenuates oxidative stress in mouse hepatic fibrosis through modulation of NOX4. Acta Pharmacol Sin. 2021; 42(7):1090-1100.
[31] ZHOU M, ZHAO X, LIAO L, et al. Forsythiaside A Regulates Activation of Hepatic Stellate Cells by Inhibiting NOX4-Dependent ROS. Oxid Med Cell Longev. 2022; 2022:9938392.
[32] SAJADIMAJD S, KHAZAEI M. Oxidative Stress and Cancer: The Role of Nrf2. Curr Cancer Drug Targets. 2018;18(6):538-557.
[33] 曹玲娟,龚慧,颜苗,等. Nrf2-ARE信号通路参与肝脏疾病病理机制研究进展[J].中国药理学通报,2015,31(8):1057-1061.
[34] YAMAMOTO M, KENSLER TW, MOTOHASHI H. The KEAP1-NRF2 System: a Thiol-Based Sensor-Effector Apparatus for Maintaining Redox Homeostasis. Physiol Rev. 2018; 98(3):1169-1203.

引言

肝脏是参与机体生理过程的关键枢纽。肝纤维化是各种有害因素直接或间接不断影响肝脏功能，而导致以细胞外基质堆积为特点的慢性病理过程[1-2]。持续的肝纤维化会逐渐演变成肝硬化，如不加以干预可能会引发肝癌甚至死亡。尽管发病率高、死亡率高，但临床上很少有疗法对肝纤维化有效。因此，开发用于早期预防和治疗肝纤维化的安全新型有效药物是至关重要的[3-4]。氧化应激是参与肝星状细胞激活和肝脏疾病发展的关键因素，氧化应激能引起肝星状细胞结构改变及功能障碍，分泌大量代表肝纤维化进展的平滑肌动蛋白及胶原，并迁移到坏死和炎症区域加重肝脏的病变[5-6]。因此，改善氧化应激状态、抑制肝星状细胞活化、调节细胞外基质降解及肝脏炎症能减缓甚至阻断肝纤维化进一步恶性发展。
中药因具有多成分、多功效的药理学活性，在抗肝纤维化领域得到广泛研究。芒柄花素是一种异黄酮化合物，广泛出现在黄芪、鸡血藤及苦参等多种中药草本植物中[7-8]。研究表明，芒柄花素在糖尿病、心脑血管疾病和肿瘤等临床疾病治疗中具有重要意义[9-10]。此外，芒柄花素因具有抗炎、抗氧化和免疫调节等药理特性，在非酒精性脂肪肝病、药物肝毒性以及肝胆汁淤积中发挥着重要作用[11-12]。然而，目前关于芒柄花素抗肝纤维化的相关分子机制未能明确，故该研究主要探讨芒柄花素在体外对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响及相关作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2021年5月至2022年9月在贵州医科大学医学检验学院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物芒柄花素(美国Med Chem Express公司，批号：HY-N0183)；姜黄素(美国Sigma公司，批号：C1386)；葡萄糖氧化酶(美国Sigma公司，批号：G2133)。
1.3.2 细胞大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.3.3 实验试剂胎牛血清(以色列BI公司，批号：2153442)；DMEM培养基(美国Gibco公司，批号：8122340)；CCK8试剂(美国APEXBIO公司，批号：K1018)；超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒(南京建成生物工程有限公司，批号：A001-3-2、A003-1-2)；活性氧试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：S0033S)；白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α试剂盒(上海酶联生物有限公司，批号：ml037361、ml002859)；快速高效RIPA裂解液、DAPI溶液(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：R0010、C0065)；GAPDH抗体、Nrf2抗体(美国Abcam公司，批号：ab181602、ab92946)；Ⅰ型胶原抗体(美国CST公司，批号：72026s)；NOX4抗体(武汉三鹰生物科技有限公司，批号：14347-1-AP)。
1.4 实验方法
1.4.1 CCK8法检测细胞活力将HSC-T6细胞以6×103个/100 μL接种于96孔板，水平放置培养24 h，每组设5个复孔，分别加入不同浓度芒柄花素(5，10，20，40，80，160，320 μmol/L)处理24 h，小心吸掉药物上清培养液，加入含有10% CCK8的DMEM培养基100 μL培养3 h，用酶标仪在450 nm处测定吸光度值，确定芒柄花素干预浓度。
1.4.2 细胞培养及分组 HSC-T6细胞在37 ℃、体积分数为5% CO2的环境下，用DMEM完全培养基水平放置培养。将HSC-T6细胞设为对照组、模型组、芒柄花素低剂量组
(10 μmol/L)、芒柄花素中剂量组(20 μmol/L)、芒柄花素高剂量组(40 μmol/L)和姜黄素组(15 μmol/L，阳性对照[13])。对照组不做任何处理；模型组用含100 mU/mL 葡萄糖氧化酶培养
2 h；芒柄花素各剂量组和姜黄素组分别加入10，20，40 μmol/L 芒柄花素和15 μmol/L姜黄素处理24 h，再加入100 mU/mL葡萄糖氧化酶处理2 h。
1.4.3 DCFH-DA荧光探针检测活性氧表达细胞培养处理方法见1.4.2，待各组细胞处理完成后，吸掉上清，用PBS润洗1遍，再加入2 μmol/L DCFH-DA染料1 000 μL避光培养
30 min，用DMEM基础培养基清洗3次，最后在荧光显微镜下观察各组细胞中活性氧的表达。将每组洗涤后的细胞用PBS重悬，为了避免因细胞数量对检测结果产生影响，在显微镜下计数后取100 μL细胞悬液并使用多功能酶标仪测定各组细胞活性氧的荧光强度。
1.4.4 化学试剂盒检测氧化应激指标细胞培养处理方法见1.4.2，待各组细胞处理完成后，向每组细胞中加入300 μL预冷的PBS，用超声破碎仪以超声5 s，静止10 s为1个循环，重复此步骤3次使细胞完全破碎，收集细胞悬液备用。根据超氧化物歧化酶和丙二醛检测试剂盒说明书进行实验操作，最后用酶标仪测定吸光度值，计算超氧化物歧化酶(U/mg prot)和丙二醛(nmol/mg prot)含量。
1.4.5 ELISA法检测炎症指标细胞培养处理方法见1.4.2，待各组细胞处理完成后，收集各组细胞培养上清液，在4 ℃，1 500×g/min条件下离心15 min，将底部的细胞沉积物丢弃，然后小心取上清液于EP管内保存。按照白细胞介素1β和肿瘤坏死因子 α测定试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定吸光度值，计算白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α(pg/mL)水平。
1.4.6 细胞免疫荧光检测 Ⅰ 型胶原表达细胞培养处理方法见1.4.2，待各组细胞处理完成后，从培养板中小心取出细胞爬片，用1×PBS润洗3遍，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.1% TRItonX-100作用15 min；滴加体积分数为5%山羊血清在37 ℃水浴静置孵育30 min，直接吸掉血清，勿清洗，再滴加 Ⅰ 型胶原抗体(1∶200稀释)4 ℃静置过夜，等待恢复室温，用荧光二抗孵育60 min，用DAPI溶液进行核染色持续6 min，最后在荧光显微镜下进行观察。
1.4.7 Western blot检测 Ⅰ 型胶原、NOX4、Nrf2蛋白表达细胞培养处理方法见1.4.2，待各组细胞处理完成后，吸掉上清液，用预冷1×PBS洗2次；加入快速高效细胞RIPA裂解液，在冰上进行裂解，同时每间隔3 min在漩涡混匀仪上振荡30 s，反复进行此步骤6次使细胞充分裂解，之后4 ℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清液为所提取蛋白。用蛋白上样缓冲液将所得蛋白配成质量浓度为2 μg/μL的上样品，在100 ℃金属浴中煮沸10 min，然后置于-20 ℃冰箱保存。预先配制10%的凝胶用来分离不同相对分子质量的蛋白，每组取15 μL蛋白样品先通过80 V恒压30 min，再调制电压120 V进行凝胶电泳，之后通过恒流电转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，将蛋白膜条放入Ⅰ型胶原、NOX4、Nrf2抗体中(工作浓度为1∶1 000，1∶5 000，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，再室温孵育蛋白二抗1.5 h，然后加现配的显色液覆盖膜条进行曝光，以 GAPDH 为内参，分析Ⅰ型胶原、NOX4、Nrf2蛋白表达。应用ImageJ软件分析目的条带灰度值，即目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。
1.5 主要观察指标 ①细胞活力；②氧化应激指标：超氧化物歧化酶、丙二醛、活性氧；③炎症指标：白细胞介素1β、肿瘤坏死因子 α；④促纤维化因子Ⅰ 型胶原荧光表达；⑤Ⅰ型胶原、NOX4、Nrf2蛋白表达。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据统计分析，以x±s表示。多组间的比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

正常情况下，肝星状细胞表现为非活化状态，其增殖活性低，但当直接或间接受到外界刺激时，静止的肝星状细胞形态发生改变，细胞增生频率加快，并伴随大量胶原及纤维化蛋白异常增加而导致细胞外基质失衡[14-15]。氧化应激是机体因受到各种有害影响使氧化和抗氧化严重失调，而造成的组织、器官等损伤，是许多疾病发生发展的病理基础[16]。氧化应激能够诱导肝星状细胞活化并促进细胞外基质和炎症的产生，其强弱可反映肝纤维化的损伤程度[17]。
随着对中药制剂的不断深入研究，中药在历史发展中取得了重大成就，对人类医学健康作出了巨大贡献。近年来，研究发现天然异黄酮化合物芒柄花素通过多靶点、多通路发挥抗炎、抗氧化和调节血脂代谢等生物学作用，对癌症、动脉粥样硬化、脂肪肝病等具有保护作用[18-19]。姜黄素是姜科植物中的一种化合物，研究发现姜黄素可以通过Nrf2、NOX4和NF-κB等多种信号通路抑制肝星状细胞的活化增殖，同时诱导抗炎抗氧化基因的表达，改善氧化应激和炎症反应从而发挥抗肝纤维化作用，因此，在该研究中作为阳性对照[20-21]。
为了探究芒柄花素对HSC-T6细胞的影响，该研究通过葡萄糖氧化酶制备氧化应激模型[22]。实验发现，葡萄糖氧化酶刺激使HSC-T6细胞活化增殖并产生大量的促纤维化因子Ⅰ型胶原，而芒柄花素干预能显著抑制HSC-T6细胞的活化增殖，减少细胞外基质的形成。活性氧是参与氧化还原反应重要的信号分子，当活性氧的产生大于自身抗氧化能力时，将打破机体正常的氧化还原系统，对许多生物分子和细胞器，例如蛋白质、脂质、DNA和线粒体等造成结构和功能性破坏，最终导致细胞损伤[23-24]。丙二醛是脂质过氧化的重要预测因子，超氧化物歧化酶是抗氧化防御体系中阻止自由基引起氧化应激反应的关键酶。实验发现，葡萄糖氧化酶刺激使HSC-T6细胞中超氧化物歧化酶活力减低，丙二醛和活性氧表达增加，而通过芒柄花素预处理后可显著增加超氧化物歧化酶活力，降低丙二醛和活性氧表达，提示芒柄花素能提高HSC-T6细胞抗氧化能力，从而抑制氧化应激反应。炎症是细胞或组织对有害刺激响应而发生的一系列复杂反应，是加速疾病发生发展的重要信号分子[25]。肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β是参与各种炎症反应和各种细胞活动的关键促炎递质，这些丰富的炎症因子可促进成纤维细胞和炎症细胞的释放聚集，进一步加剧肝纤维化的发展[26-27]。实验发现，芒柄花素预处理后HSC-T6细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平显著降低，提示芒柄花素可有效抑制葡萄糖氧化酶诱导HSC-T6细胞炎症因子的释放。综合以上实验结果说明芒柄花素具有抗氧化和抗炎作用，与文献报道一致[19]。
肝星状细胞活化受多种信号分子的调控，而活性氧具有调节转录因子和蛋白质信号传导的能力。多蛋白亚基组成的跨膜复合物NADPH氧化酶是活性氧的生产者之一[28]。NOX4是一种非吞噬性NOXs的同源物，主要存在于肝细胞及肝星状细胞，引起的氧化应激可通过活性氧使细胞内多种信号途径被激活[29]。研究发现，H2O2和转化生长因子β等刺激物能通过NOX4产生活性氧直接诱导肝星状细胞活化增殖[30-31]。因此，抑制NOX4产生活性氧，可能会阻止肝纤维化的形成。Nrf2是有效保护细胞免受胞内或胞外氧化活性物质攻击的重要调控因子[32]。在生理状态下，Nrf2与细胞骨架调节蛋白Keap1紧密结合存在于细胞胞浆中。然而，当细胞受到氧化物质等刺激时，Nrf2-Keap1信号转导通道遭到破坏，使Nrf2与Keap1进行水解分离。此时，活化的Nrf2进入细胞核与抗氧化反应元件结合，从而调节细胞分子信号传导并驱动抗氧化基因的表达[33-34]。实验发现，芒柄花素干预后能显著减低NOX4蛋白表达同时增加Nrf2蛋白表达，提示芒柄花素能有效减少NOX4对活性氧的产生，并激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用以维持细胞内氧化还原系统的稳定。
综上所述，芒柄花素能抑制葡萄糖氧化酶诱导的肝星状细胞活化增殖，其机制可能与调节Nrf2/NOX4蛋白表达、减少活性氧和炎症因子的释放，从而发挥抗炎、抗氧化作用有关。这些结果为芒柄花素在肝纤维化的研究提供了理论基础，后续将通过肝纤维化的动物模型进行验证和深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

芒柄花素对葡萄糖氧化酶诱导大鼠肝星状细胞氧化应激的影响

Effect of formononetin on glucose oxidase-induced oxidative stress in rat hepatic stellate cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-8.
[3]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[4]	阮凌, 王光华, 吴荣平, 晋战, 吕镇庆, 张楠, 李寿邦. 运动强度与高脂饮食模型大鼠脂代谢紊乱和氧化应激的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1149-1155.
[5]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[6]	梁家琪, 刘恒旭, 阳金鑫, 杨椅, 邓旭辉, 谭明健, 罗炯. 运动与肠道菌健康效益的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1292-1299.
[7]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.
[8]	李龙, 李光第, 石豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.
[9]	李志超, 谭国庆, 苏辉, 徐展望, 薛海鹏. 非编码RNAs作为潜在治疗靶点在脊髓损伤中的调控效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 758-764.
[10]	熊治林, 孙红, 刘淼, 庄勇. 铁死亡在椎间盘退变和骨关节炎中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5884-5890.
[11]	梁学振, 骆帝, 李嘉程, 温明韬, 张建, 许波, 李刚. 激素性股骨头坏死中的PTGS2和STAT3：潜在铁死亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5898-5904.
[12]	唐笠, 潘瑶, 朱国臣. 毛囊表皮神经嵴干细胞调节面神经损伤后局部炎症因子的表达水平[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5249-5255.
[13]	王明盛, 崔焕喜, 崔红凯, 裴观辉, 李道广, 闫海清, 张平. Ngn2调节Nrf2/HO-1对脑缺血模型大鼠脑微结构、角质细胞活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5298-5303.
[14]	陶柏楠, 王咏兰, 江露, 张宗星, 刘道忠, 万星, 黄德斌, 袁林. 柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5334-5341.
[15]	张慧宇, 于婧文, 白振军, 李亮, 穆秉桃, 张金锋, 解佳伟. 雷公藤甲素调节小胶质细胞极化反应保护损伤的神经元[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5342-5347.