类风湿关节炎铁死亡特征基因CeRNA网络构建及免疫表现

doi:10.12307/2024.321

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2561-2567.doi: 10.12307/2024.321

• 组织构建相关数据分析 Date analysis of organization construction • 上一篇下一篇

类风湿关节炎铁死亡特征基因CeRNA网络构建及免疫表现

夏天1，李炳霖1，肖发源1，郑恩泽1，陈跃平2

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000；2广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2023-03-15 接受日期:2023-05-10 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-31
通讯作者: 陈跃平，博士，主任医师，博士生导师，广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:夏天，男，1984年生，博士在读，副教授，主要从事脊柱与四肢退行性疾病的中医防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81960803)，项目负责人：陈跃平；广西中医药大学自治区级博士研究生科研创新项目(YCBXJ2021019)，项目负责人：夏天；广西中医药适宜技术开发与推广项目(GZSY22-39)，项目负责人：夏天

CeRNA interaction network and immune manifestation of ferroptosis-related signature genes in rheumatoid arthritis

Xia Tian1, Li Binglin1, Xiao Fayuan1, Zheng Enze1, Chen Yueping2

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedic Trauma and Hand Surgery, Ruikang Hospital, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-03-15 Accepted:2023-05-10 Online:2024-06-08 Published:2023-07-31
Contact: Chen Yueping, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedic Trauma and Hand Surgery, Ruikang Hospital, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Xia Tian, MD candidate, Associate professor, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960803 (to CYP); Autonomous Region-level Doctoral Research Innovation Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. YCBXJ2021019 (to XT); Guangxi Traditional Chinese Medicine Appropriate Technology Development and Promotion Project, No. GZSY22-39 (to XT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

铁死亡：一种程序性细胞死亡，表现为细胞质中线粒体的形态改变，通过芬顿反应产生过量的活性氧和增加脂氧合酶的活性，细胞失去脂质过氧化修复的能力，导致细胞膜中的活性氧化物增加，出现细胞死亡。
类风湿关节炎：是一种表现为关节畸形和活动受限的自身免疫性关节病，关节滑膜炎性病变为其主要病理表现。

背景：研究发现铁死亡相关基因在类风湿关节炎的发病机制中占据重要地位，但目前尚缺乏关于类风湿关节炎铁死亡特征基因的免疫表现及CeRNA互作网络的构建，而机器学习作为生物信息学中强大的特征基因选择算法能更精确地筛选出在类风湿关节炎发病机制中占主导地位的铁死亡特征基因。

目的：利用生物信息学与机器学习方法筛选类风湿关节炎铁死亡特征基因，并分析铁死亡特征基因与免疫浸润的相关性及铁死亡特征基因CeRNA的网络构建。
方法：从GEO数据库获取与类风湿关节炎相关的芯片，利用R语言提取铁死亡相关基因及其差异基因表达；使用机器学习方法对差异基因进行筛选，即运用LASSO回归与SVM-RFE方法进行特征基因筛选，对两者过滤后的基因进行再次交集，最终得到类风湿关节炎的特征基因，运用ROC曲线评估筛选后的疾病特征基因诊断疾病的准确性；利用CIBERSORT算法分析类风湿关节炎与正常滑膜组织的免疫浸润情况，并分析铁死亡特征基因与免疫细胞的相关性，最后构建类风湿关节炎铁死亡疾病特征基因的CeRNA网络并对疾病特征基因进行验证。

结果与结论：①得到与类风湿关节炎相关铁死亡基因150个，其中55个上调基因，95个下调基因；②GO与KEGG富集分析分别得到18个GO显著相关条目与30个KEGG条目，主要涉及金属离子稳态、有铁离子稳态与氧化应激反应等；③机器学习分析最终获得疾病特征基因GABARAPL1、SAT1；④GSEA分析发现脂肪细胞因子信号通路、药物代谢细胞色素P450、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、酪氨酸代谢主要集中在GABARAPL1高表达时，趋化因子信号通路、肠道免疫网络对IGA产生的影响主要集中在SAT1高表达时；⑤免疫浸润分析发现类风湿关节炎与9 种免疫细胞与正常组织存在明显差异，其中浆细胞、T细胞CD8、T细胞滤泡辅助器在疾病组中为高表达状态，其余为低表达。单基因与免疫细胞相关性分析发现GABARAPL1在树突状静息细胞、激活的NK细胞、巨噬细胞M1等为正相关，其中与树突状静息细胞的相关性最为显著，SAT1与T细胞CD4与γδT细胞为正相关，与NK静息细胞为负相关；⑥GSVA分析发现抗坏血酸和醛酸代谢在SAT1表现为上调的基因高表达水平时候为上调，而B细胞受体信号通路、TOLL样受体信号通路、T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等表现为下调，PPAR信号通路、烟酸盐和烟酰胺的代谢、色氨酸代谢、脂肪酸代谢、类固醇生物合成等在GABARAPL1表现为下调趋势；⑦60 种长链非编码RNA可能在导致类风湿关节炎发展过程中发挥关键作用。提示：类风湿关节炎的发生与类风湿关节炎铁死亡疾病特征基因的异常表达显著相关，特征基因通过影响相关信号通路诱导疾病的发生发展，并通过对类风湿关节炎相关长链非编码RNA介导的ceRNA网络进行分析，识别出潜在的治疗靶点及信号通路，为进一步阐明其发病机制，并为后续的实验研究提供参考依据。

https://orcid.org/0000-0003-4940-405X(夏天)；https://orcid.org/0000-0003-3860-1568(陈跃平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 类风湿关节炎, 生物信息学, 机器学习, 铁死亡, CeRNA网络构建

Abstract: BACKGROUND: Ferroptosis-related genes have been found to play an important role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. However, there is currently a lack of immune expression of ferroptosis-related signature genes in rheumatoid arthritis and the construction of competing endogenous RNA (CeRNA) interaction networks. Machine learning, as a powerful signature gene selection algorithm based on bioinformatics, can more accurately identify ferroptosis-related signature genes that dominate the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
OBJECTIVE: To screen ferroptosis-related signature genes in rheumatoid arthritis using bioinformatics and machine learning methods, and to analyze the correlation between ferroptosis-related signature genes and immune infiltration and the construction of CeRNA network of ferroptosis-related signature genes.
METHODS: Rheumatoid arthritis-related microarrays were obtained from the GEO database, and ferroptosis-related genes and their differential gene expression were extracted using R language. The differentially expressed genes were screened using machine learning methods. The LASSO regression and SVM-RFE methods were used for signature gene screening, and the genes filtered by both were re-intersected to finally obtain the signature genes in rheumatoid arthritis. Receiver operating characteristic curves were used to assess the accuracy of the screened signature genes for disease diagnosis. Immune infiltration of rheumatoid arthritis and normal synovial tissues was analyzed using the CIBERSORT algorithm, and the correlation between the signature genes and immune cells was analyzed. Finally, the CeRNA network of ferroptosis-related signature genes for rheumatoid arthritis was constructed and the disease signature genes were validated.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 150 ferroptosis-related genes in rheumatoid arthritis were obtained, including 55 up-regulated genes and 95 down-regulated genes. GO and KEGG enrichment analyses identified 18 GO significantly correlated entries and 30 KEGG entries respectively, mainly involving metal ion homeostasis, ferric ion homeostasis and oxidative stress response. Machine learning analysis finally identified disease signature genes GABARAPL1 and SAT1. GSEA analysis found that adipocytokine signaling pathway, drug metabolism cytochrome P450, fatty acid metabolism, PPAR signaling pathway, tyrosine metabolism were mainly concentrated when GABARAPL1 was highly expressed, and chemokine signaling pathway, intestinal immune network on IGA production were mainly concentrated when SAT1 was highly expressed. Immune infiltration analysis found that nine immune cells were significantly different in rheumatoid arthritis and normal synovial tissues, in which plasma cells, T-cell CD8, and T-cell follicular helper were highly expressed and the rest were lowly expressed in the disease group. Single gene and immune cell correlation analysis found that GABARAPL1 was positively correlated with dendritic resting cells, activated NK cells, and macrophage M1, with the most significant correlation with dendritic resting cells, while SAT1 was positively correlated with T cell CD4 and γδ T cells and negatively correlated with NK resting cells. GSVA analysis found that SAT1 was upregulated in ascorbic acid and aldehyde metabolism, while downregulated in B-cell receptor signaling pathway, Toll-like receptor signaling pathway, T-cell receptor signaling pathway, and natural killer cell-mediated cytotoxicity. GABARAPL1 showed a down-regulation trend in PPAR signaling pathway, metabolism of nicotinate and nicotinamide, tryptophan metabolism, fatty acid metabolism, and steroid biosynthesis. Sixty long non-code RNAs may play a key role in the development of rheumatoid arthritis. To conclude, the occurrence of rheumatoid arthritis is significantly correlated with the abnormal expression of rheumatoid arthritis-induced ferroptosis-related signature genes, and the signature genes induce disease development via relevant signaling pathways. By analyzing rheumatoid arthritis-related long non-code RNAs-mediated ceRNA networks, potential therapeutic targets and signaling pathways can be identified to further elucidate its pathogenesis and provide a reference basis for subsequent experimental studies.

Key words: rheumatoid arthritis, bioinformatics, machine learning, ferroptosis, CeRNA network construction

中图分类号:

夏天, 李炳霖, 肖发源, 郑恩泽, 陈跃平. 类风湿关节炎铁死亡特征基因CeRNA网络构建及免疫表现[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2561-2567.

Xia Tian, Li Binglin, Xiao Fayuan, Zheng Enze, Chen Yueping. CeRNA interaction network and immune manifestation of ferroptosis-related signature genes in rheumatoid arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2561-2567.

图/表（结果） 14

2.1 RA铁死亡相关基因差异从 GEO 数据库下载 GSE12021和GSE55235基因表达谱芯片，运用 perl 脚本对每个基因进行标准化处理，将处理完后的数据用R软件进行再次处理，将GSE12021和GSE55235整理后的数据进行处理、合并、矫正，通过与铁死亡相关基因的列表进行数据处理，提取铁死亡相关基因表达量，得到356 个铁死亡相关基因，设定adj.P < 0.05和|log2FC|> 2为过滤条件，筛选出具有显著差异的150 个差异基因，其中有55 个上调基因，正常组有95 个上调基因，并绘制出差异基因热图，见图1。

2.2 RA铁死亡相关差异基因的GO与KEGG富集分析通过R软件(4.1.2)对筛选出的150 个差异基因进行GO和KEGG富集分析，得到GO和KEGG的圈图。结果显示GO分析共得到条目1 707 个，对1 707个条目进行筛选，最终得到其中GO的生物过程6 个，细胞成分6 个，分子过程6 个，主要涉及细胞对外界刺激的反应、细胞对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应、dna结合转录因子结合等等，见图2。KEGG富集分析筛选后共得到30 个项目；KEGG富集分析发现与RA相关的有铁离子稳态、金属离子响应、细胞过渡金属离子稳态、细胞对氧化应激的反应等相关通路，见图3，4。

.3 机器学习方法筛选铁死亡疾病特征基因运用LASSO回归方法，通过R软件中的“glmnet”对差异基因的表达量进行过滤，取误差最小值的前16 个基因为疾病特征基因，并绘制相关可视化图形，见图5A，基因误差按高到低排名依次获得SLC1A5、GABARAPL1、SAT1、PEBP1、MAPK8、MTCH1、SLC39A7、TRIM21、CIRBP、ADAM23、MEG3、RRM2、GDF15、AHCY、AR、BEX1；然后运用SVM-RFE方法筛选疾病特征基因，通过R软件中的“e1071、kernlab、caret”包对差异基因的表达量进行过滤，通过交叉验证寻找误差最小的疾病特征基因并做可视化分析，见图5B，发现误差表达最小的点共有3 个基因。接着将两者各自获得的疾病特征基因相交，并绘制VENN图，见图6，获得GABARAPL1、SAT1共2 个疾病特征基因。然后对获得的2 个疾病特征基因进行ROC曲线绘制，发现10 个疾病特征基因的AUC值都在80%以上，最后并对检测模型进行检测发现AUC值在0.95以上，说明GABARAPL1、SAT1为疾病的特征基因，具有一定的准确性，见图7。

2.4 RA铁死亡特征基因GSEA分析通过对RA铁死亡特征基因的GSEA分析发现，当GABARAPL1处于高表达时，脂肪细胞因子信号通路、药物代谢细胞色素P450、脂肪酸代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPAR)信号通路、酪氨酸代谢是活跃的，SAT1处于高表达时，趋化因子信号通路、肠道免疫网络对IGA产生的影响、免疫缺陷是活跃的，在低表达时基底细胞癌、Hedgehog信号通路为活跃的，见图8。

2.5 RA铁死亡疾病特征基因的免疫浸润分析将矫正后的2 个芯片的基因表达量通过使用 CIBERSORT 算法进行分析，其中RA有22 个滑膜组织样本，正常组有19 个滑膜组织样本，同时筛选得到符合条件的有RA 22 个与正常组19 个之间的22 个免疫细胞的免疫浸润差异，通过与正常滑膜相比，RA滑膜中的浆细胞、T 细胞CD8、记忆静息T细胞CD4、记忆激活T细胞CD4、T细胞滤泡辅助器、激活的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞M1、活化的肥大细胞等9种免疫细胞与正常组织存在明显差异，见图9，其中浆细胞、T细胞CD8、T细胞滤泡辅助器在疾病组中为高表达状态，其余为低表达。通过比较单个疾病特征基因与免疫细胞的相关性，发现GABARAPL1在树突状静息细胞、激活的NK细胞、巨噬细胞M1等为正相关，其中与树突状静息细胞的相关性最为显著，SAT1与T细胞CD4与γδT细胞为正相关，与NK静息细胞为负相关，见图10。通过GSVA分析发现SAT1在抗坏血酸和醛酸代谢上是上调的，而SAT1在B细胞受体信号通路、自身免疫性甲状腺疾病、TOLL样受体信号通路、T细胞受体信号通路、1型糖尿病、胞浆dna传感通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、烟酸盐和烟酰胺的代谢是下调的；GABARAPL1在PPAR信号通路、泛酸与coa生物合成、药物代谢细胞色素P450、烟酸盐和烟酰胺的代谢、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、脂肪酸代谢、类固醇生物合成等是下调的，见图11。通过将疾病特征基因对验证发现，疾病组的GABARAPL1与SAT1与正常组存在显著差异，且疾病组处于低表达的状态，这与以上的研究结果内容符合，见图12。

2.6 RA铁死亡疾病特征基因CeRNA的网络构建及对疾病特征基因正确性的验证利用miRDB等数据库预测的RA铁死亡疾病特征基因相关的miRNA结果取交集，共获得44 个miRNA，再利用spongeScan数据库获得的铁死亡相关lncRNA与RA的取交集，最后得到lncRNA-miRNA-mRNA网络。将该网络导入Cytoscape软件中绘制ceRNA网络，见表2、图13。

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引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节滑膜慢性炎症为主要病理特征的一种自身免疫性疾病，它的发展与自身抗体的病理过程相关，在发病的初期可以在血清中发现类风湿因子(RF)和抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPA)的升高[1]。随着各种免疫细胞与成纤维细胞和细胞因子的相互作用，滑膜组织逐渐产生慢性炎症，并发生骨侵蚀和关节破坏，出现临床症状和损伤，进而发展为严重残疾，此外RA也具有退行性表现，如细胞死亡和骨代谢稳态损失引起的异常骨形成，可见RA的发病机制较为复杂[2-3]。
目前普遍认为RA的发病机制与遗传、表观遗传学、环境、代谢、免疫和微生物因素的相互作用有关，而随着对RA发病机制的深入研究发现铁死亡可能与其存在诸多的关系。有研究发现在RA患者的滑膜组织存在大量的铁沉积，并且RA患者的铁代谢处于失衡状态[4-5]，并且有学者认为RA患者体内大量铁沉积可能是造成关节内积累大量活性氧的原因之一[6]，而活性氧反应会导致Fe3+转换成Fe2+，这期间会产生羟基(-OH)或烷氧基自由基，导致细胞膨胀直至质膜破裂[7]；此外细胞中的活性氧还可以激活NLRP3受体蛋白，NLRP3可以刺激炎性递质的成熟，导致骨质破坏及关节炎发生[8]，这说明铁死亡与RA活性氧反应紧密相关，铁死亡可能是RA的发病机制之一，并有望成为治疗RA的新突破。
长非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)作为一种遗传暗物质，在近些的研究中已被广泛证实参与调控人体的各项生命活动，与疾病的发生发展紧密相关。并且LncRNA可作为内源竞争RNA(competing endogenous RNA，CeRNA)调节微小核糖核酸RNA(microRNA，miRNA)的表达模式和生物学特征，参与类风湿关节炎的免疫反应、炎症反应、细胞代谢等生物过程。
该文通过生物信息学方式挖掘公共数据库中RA铁死亡相关基因的表达情况，运用机器学习方法筛选出RA铁死亡疾病特征基因，分析铁死亡疾病特征基因在细胞功能通路上的具体表现，并分析疾病特征基因与免疫细胞的相关性，提取与铁死亡特征基因相关的LncRNA以及miRNA，构建CeRNA网络，从而深入探讨铁死亡相关基因LncRNA在CeRNA的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 数据来源从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载GSE12021[9]、GSE55235基因表达谱芯片[10]。GSE12021数据集包含12 例RA患者和9 例正常关节患者的滑膜组织，GSE55235数据集包括 10 例RA患者和10 例正常关节患者的滑膜组织， GSE12021、GSE55235的数据集均是基于GPL96平台完成。相关数据库及软件工具见表1。

1.2 数据处理及铁死亡差异基因的筛选运用Perl脚本对GSE12021和GSE55235两数据进行整理，通过R软件(版本4.1.2)的“SVA”包对整理后的数据进行处理合并，获取交集基因，接着运用“limma”包分别对合并后的批次信息进行常规矫正，输出矫正后的结果后，通过与铁死亡相关基因的列表进行数据处理，提取铁死亡相关基因表达量，并分析对照组与实验组之间存在的铁死亡基因表达差异，提取差异基因的表达量，以及分析基因之间的相关性，绘制基因差异热图与相关性图。
1.3 铁死亡差异表达基因的GO和KEGG富集分析为了探求差异表达基因的主要功能和途径，通过R语言中“Bioconductor”软件包对差异表达基因进行GO富集分析和 KEGG富集分析，筛选具有显著性差异的差异基因(P < 0.05)；GO富集分析包含生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF) [3]，最后通过“ggplot2”包对富集结果分别进行可视化，分别绘制GO圈图和KEGG的气泡图和柱状图。
1.4 铁死亡疾病特征基因模型筛选与特征基因筛选运用机器学习的方法在差异基因中寻找疾病的特征基因，首先运用LASSO回归方法：通过R软件中的“glmnet”对差异基因的表达量进行过滤，通过交叉验证寻找误差最小的则为疾病特征基因，然后运用SVM-RFE方法筛选疾病特征基因：通过R软件中的“e1071、kernlab、caret”包对差异基因的表达量进行过滤，通过交叉验证寻找误差最小的则为疾病特征基因，最后将两者筛选后的疾病特征基因进行相交，并绘制VENN图，筛选出最终的疾病特征基因，对筛选获得的基因进行ROC曲线检测，并运用GSEA方法分析铁死亡疾病特征基因在不同通路上的表现。
1.5 RA铁死亡疾病特征基因的免疫细胞相关性分析及基因集变异(GSVA)分析使用 R软件的4.1.2版本通过 CIBERSORT算法对以上获得联合芯片的矫正基因表达矩阵进行分析，筛选出P < 0.05的样品，利用“vioplot”软件包对筛选出的RA样品与正常样品的滑膜组织进行比较，分析每个免疫细胞在两组间的免疫浸润差异水平，P < 0.05代表两组间差异有显著性意义，并分析铁死亡疾病特征基因与免疫细胞的相关性以及运用GSVA方法分析铁死亡疾病特征基因在免疫相关通路上的表现。
1.6 RA铁死亡疾病特征基因CeRNA网络构建利用miRDB、miRanda、TargetScan等数据库挖掘关键基因在ceRNA网络中的关联信息，分析lncRNA与mRNA竞争结合的miRNA，并运用Cytoscape软件绘制关键ceRNA网络图。

讨论

RA是一种慢性、多系统的自身免疫性疾病，其特征是存在持续性滑膜炎症，通常对称地分布在关节周围，在某些病例中还出先全身症状表现。遗传、环境因素和自身免疫三个重要因素在RA的发病机制中发挥作用。
通过对下载数据的筛选处理，共筛选出具有显著差异的150 个铁死亡相关的差异基因，其中有55 个上调基因，95 个下调基因，对上述基因进行GO与KEGG富集分析，结果显示其主要富集在细胞对外界刺激的反应、细胞对活性氧的反应、细胞对氧化应激的反应、铁离子稳态、金属离子响应等。目前研究认为铁死亡是RA的发病因素之一，这主要与铁死亡参与活性氧在RA内的大量累积导致炎症有关。许多细胞外和细胞内的生命过程会产生活性氧[11]，活性氧体内水平的升高会导致蛋白质、核酸和脂类等生物分子的损伤[8]。有研究表明活性氧可以通过激活不同的信号通路对其病理生理产生重大影响，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、PI3K/Akt信号通路等[12-13]，其中MAPK信号通路负责调节促炎细胞因子的产生和下游因子，最终导致关节炎症和骨质破坏，而活性氧可以直接激活PI3K/AKT通路，加速软骨细胞的降解，从而加快细胞自噬和凋亡[13]。此外活性氧还会导致转录因子的激活，从而调节抗氧化蛋白和促炎因子的生物合成，如活性氧可激活核因子κB和Nrf2转录因子，核因子κB的升高又会提升干扰素γ、白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、β等炎性细胞因子的水平，从而引发或加重关节炎[14]。铁死亡作为一种独特的铁依赖的非凋亡细胞死亡形式，它导致细胞死亡的阶段包括减少细胞线粒体体积、增加细胞膜密度、细胞膨胀、质膜破裂等，这与其他细胞死亡模式有显著不同[15-16]。铁和脂质过氧化物反应产生的活性氧的积累是其主要特征[11]，细胞脂质过氧化代谢和细胞内铁平衡代谢是参与铁死亡过程的关键因素，并受到多个基因的调控[17]。目前有学者认为铁代谢失衡参与铁死亡脂质活性氧的积累，铁可以用过Fenton反应生成活性氧，也可以通过铁催化酶促使脂质氧化生成活性氧，还可以由含铁氧合物氧化生成活性氧，而活性氧的反应又是RA发病机制的主要原因之一[11，18-19]。由此可见铁死亡可以通过提升人体关节内活性氧水平从而引发RA。
机器学习是一门多领域交叉学科，涉及概率论、统计学、逼近论、凸分析、算法复杂度理论等多门学科，其常见算法包括决策树算法、朴素贝叶斯算法、支持向量机算法、随机森林算法和人工神经网络算法等[20]。本文运用生物信息学中强大的特征选择算法——支持向量机征消除法(SVM-RFE)和LASSO回归方法分别对芯片数据进行处理，将两种算法得出的结果进行相交，并对所得结果进行检验，绘制ROC曲线，最后用检测基因样本对所得到的结果进行检验，最终获得AUC值大于90%的2 个基因为疾病的特征基因，即GABARAPL1、SAT1。
对2 个关键基因进行GSEA分析发现GABARAPL1处于高表达时，脂肪细胞因子信号通路、药物代谢细胞色素P450、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、酪氨酸代谢是活跃的；SAT1处于高表达时，趋化因子信号通路、肠道免疫网络对IGA产生的影响、免疫缺陷是活跃的，在低表达时基底细胞癌、Hedgehog信号通路为活跃的。铁死亡的细胞过程不仅依赖于铁代谢，还取决于细胞的脂质过氧化代谢，细胞脂质过氧化代谢是一个活性氧和活性氮自由基与血浆和细胞器膜中的不饱和脂肪酸(PUFAs)反应生成脂质过氧化物的过程，主要表现为亚铁与过氧化氢反应形成羟基自由基，羟基自由基又与不饱和脂肪酸反应形成脂质过氧化物，可见不饱和脂肪酸是脂质过氧化反应的关键物质，而多不饱和脂肪酸作为脂肪酸的一种存在形式，它的产生与积累主要受到脂肪酸代谢与脂肪细胞因子的调控[7，21]。PPAR是核受体超家族的成员，作为配体诱导的转录因子，在葡萄糖和脂肪酸代谢中起关键作用[22]。有研究发现MDM2和MDMX通过改变PPARα活性，会使得细胞的抗氧化防御失效，并影响脂质组的其他变化，刺激铁死亡过程[23]。另有研究发现通过下调PPARα的表达水平会介导FABP1的表达，从而刺激人系膜细胞的铁死亡表达，这可能与PPAR与不饱和脂肪酸之间的联系有关。不饱和脂肪酸可根据甲基端到第一个双键的位置分为n-3系列与n-6系列不饱和脂肪酸，有研究发现人体必需脂肪酸LA(C18:2n-6)在PPAR诱导下，肠道微生物能够从食物和脂肪酸衍生物中合成不饱和脂肪酸的代谢物，此外通过激活PPAR可抑制核因子κB通路来介导ALA(一种必需的n-3脂肪酸)从而抑制炎症的发生[24]。而本文中所得的铁死亡特征基因GABARAPL1与上述通路的表达分析为正相关关系，可能该基因的低表达从而抑制PPAR信号通路从而刺激炎症的发生。Hedgehog信号通路参与了多种人类疾病的发病机制，包括各种类型的癌症、慢性炎症疾病和自身免疫性疾病，目前研究显示Hedgehog信号通路经多种途径参与了RA的发病及发展过程，包括通过JNK信号、MAPK/ERK、Rho/ROCK信号通路等调节RA滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭，并且有学者认为Hedgehog信号是一个可能的治疗RA的新靶点[24-28]。虽然目前尚缺乏Hedgehog与铁死亡相关的研究，但学者在研究小鼠脑部局灶性缺血的动物实验中发现刺激Hedgehog信号通路可减轻局灶性缺血/再灌注诱导的蛋白氧化、脂质过氧化和细胞凋亡的程度[29]，但具体的机制尚未清楚，这需要进一步的研究。
通过比较单个疾病特征基因与免疫细胞的相关性发现GABARAPL1在树突状静息细胞、激活的NK细胞、巨噬细胞M1等为正相关，其中与树突状静息细胞的相关性最为显著，SAT1与T细胞CD4与γδT细胞为正相关，与NK静息细胞为负相关。通过GSVA分析发现SAT1与免疫细胞相关的B细胞受体信号通路、TOLL样受体信号通路、T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等在SAT1基因低表达时呈现上调趋势。GABARAPL1与免疫细胞相关的PPAR信号通路、脂肪酸代谢、类固醇生物合成等在GABARAPL1低表达时呈现上调趋势。并且通过最后的数据验证发现SAT1与GABARAPL1在RA中处于显著的低表达水平，说明SAT1与GABARAPL1可能通过负调控上述相关信号通路刺激免疫细胞在关节内的表达水平。
最后通过构建RA铁死亡疾病特征基因的CeRNA网络，发现LncRNA最多集中在GABARAPL1最相关的miRNA为hsa-miR-1207-3p、hsa-miR-18a-3p，而SAT1为hsa-miR-515-5p、hsa-miR-361-3p等。与上述miRNA相关联的LncRNA共有60 个，包括MUC19、FAM74A1、FAM74A7、GAS8-AS1、HOXC-AS1、KCNQ1OT1、SNHG14、SPACA6P、TP73-AS1、AC011718.2等，其中凝胶形成粘蛋白(MUC19)在多个mRNA中出现共表达。目前对MUC19的研究主要集中在癌症研究，如乳腺癌、胃癌、肺癌等，有研究发现MUC19突变与非小细胞肺癌有密切联系，它主要通过参与免疫应答，刺激PD-1/PD-L1阻滞剂阻断T细胞信号重新激活CD8+ T细胞的抗肿瘤活性[30]；另有研究发现MUC19的基因上调与中耳上皮细胞炎性因子白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α有密切联系，说明LncRNAMUC19可能是通过调节炎症反应参与RA的发病[31]。有研究发现LncRNAHOXC-AS1可通过上调相关miRNA从而刺激下游FOXO6的表达，而FOXO6又是PI3K/Akt的上游刺激因子，存在通过刺激该通路引发RA的可能[13，32]。钾电压门控通道亚家族Q成员1对链1(KCNQ1OT1)是自噬相关的LncRNA，有研究发现KCNQ1OT1可能通过miR-200a/FOXO3/ATG7通路抑制I/r诱导的自噬，增加细胞活力[33]，并且KCNQ1OT1还参与了铁死亡，KCNQ1OT1的表达不同会介导miR-75p-TFRC轴来促进阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡[34]。而该文中发现作为铁死亡特征基因的miRNA hsa-miR-1207-3p与KCNQ1OT1密切相关，这有可能是通过miRNA了解其发病机制的方向之一。虽然通过对上述获得的RA铁死亡疾病特征基因、miRNA、LncRNA进行文献检索，发现尚缺乏与上述相关的类似研究，但是阐明了RA LncRNA-miRNA-铁死亡基因的互作关系，为后续研究LncRNA在RA中的作用机制提供了可靠的参考意见。
综上所述，RA的铁死亡疾病特征基因可能通过调节人体内细胞铁代谢过程以及脂质氧化反应的相关信号通路从而引起或加重疾病的发生与发展，而CeRNA的网络构建为后续研究铁死亡LncRNA与RA的作用机制提供了一定的参考，虽然运用机器学习对大数据样本进行分析处理，筛选出了RA铁死亡特征基因，具有一定的可信度，但仍存在一定的局限性，文章运用公共数据样本对数据进行分析，缺乏实验验证，需要后期的实验补充与证明。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

类风湿关节炎铁死亡特征基因CeRNA网络构建及免疫表现

CeRNA interaction network and immune manifestation of ferroptosis-related signature genes in rheumatoid arthritis

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