胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证

doi:10.12307/2024.306

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2568-2573.doi: 10.12307/2024.306

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胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证

韩维娜1，徐晓庆1，史晋宁1，李欣儒2，蔡红艳3

1邵阳学院普爱医学院(医学部)生理学教研室，湖南省邵阳市 422000；山西医科大学，2生理学系，3基础医学院微生物与免疫教研室，山西省太原市 030000

收稿日期:2023-03-22 接受日期:2023-04-20 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-31
通讯作者: 韩维娜，邵阳学院普爱医学院(医学部)生理学教研室，湖南省邵阳市 422000
作者简介:韩维娜，女，1986年生，山西省人，汉族，2012年山西医科大学毕业，硕士，副教授，主要从事阿尔茨海默病的神经生物学研究。
基金资助:
国家自然科学基金委员会面上项目(82171428)，项目负责人：蔡红艳；湖南省自然科学基金青年项目(2020JJ5517)，项目负责人：韩维娜；湖南省教育厅科学研究项目(20C1671)；项目负责人：韩维娜

Prediction and validation of potential targets for the glucagon-like peptide-1 receptor agonist in the treatment of Alzheimer’s disease

Han Weina1, Xu Xiaoqing1, Shi Jinning1, Li Xinru2, Cai Hongyan3

1Department of Physiology, Puai School of Medicine (Health Science Center), Shaoyang University, Shaoyang 422000, Hunan Province, China; 2Department of Physiology, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

Received:2023-03-22 Accepted:2023-04-20 Online:2024-06-08 Published:2023-07-31
Contact: Han Weina, Department of Physiology, Puai School of Medicine (Health Science Center), Shaoyang University, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
About author:Han Weina, Master, Associate professor, Department of Physiology, Puai School of Medicine (Health Science Center), Shaoyang University, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82171428 (to CHY); Natural Science Foundation of Hunan Province for Young Scholars, No. 2020JJ5517 (to HWN); Scientific Research Project of Education Department of Hunan Province, No. 20C1671 (to HWN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

阿尔茨海默病：是一种起病隐匿的进行性发展的神经退行性疾病，在临床上以记忆障碍、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，缺乏明确的治疗手段。
生物信息学：是一门包括以信息科学的原理和方法对生物信息进行获取、处理、存储、传播、分析和解释等方面知识和方法的学科，通常用来预测药物治疗靶点和疾病差异基因。

背景：阿尔茨海默病的机制探究过程中揭示了生物信息学对共同靶点筛选的重要作用，能够利用其筛选结果为基础，探究药物对该疾病的治疗效果。

目的：采用生物信息学与分子生物学等方法预测胰高血糖素样肽1受体激动剂利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的作用靶点。
方法：利用DisGeNET数据库及SEA数据库获取阿尔茨海默病和利拉鲁肽作用的共同基因；利用DAVID在线数据库对共同靶点进行GO/KEGG富集分析；使用STRING数据库构建蛋白互作网络；使用CCK-8判断利拉鲁肽的最佳使用剂量；使用免疫荧光和免疫印迹技术对关键蛋白的表达情况进行分析。采用小鼠海马神经元HT22细胞系进行体外实验，细胞被随机分为3组：HT22组、HT22+Aβ组和HT22+Aβ+Lir组。HT22组不做特殊处理，HT22+Aβ组使用Aβ1-42干预HT22细胞系24 h构建Aβ损伤细胞模型，HT22+Aβ+Lir组在HT22+Aβ组的基础上添加利拉鲁肽12 h。

结果与结论：①从DisGeNET数据库筛选出阿尔茨海默病相关联的基因，共得到3 333个关联基因。再从SEA数据库中，得到利拉鲁肽的潜在作用靶点147个。最后使用R包筛选出阿尔茨海默病与利拉鲁肽共同靶点64个。②用DAVID数据库进行共同靶点的GO/KEGG分析，结果提示共同靶点主要富集在：神经活性配体-受体相互作用、肾素-血管紧张素系统、膀胱癌、内肽酶活性、肽受体活性、G蛋白偶联肽受体活性和转运囊泡等生物进程。③将已经得到的64个共同靶点蛋白导入至SRTING在线数据库进行蛋白互作网络构建，得到排名前3位的基因为基质金属蛋白酶2，9和白细胞介素1β。④采用CCK-8试剂盒检测了培养细胞的活性，确定利拉鲁肽拮抗Aβ1-42的最佳浓度为100 nmol/L。⑤在免疫印迹实验与免疫荧光实验中，较HT22组相比，在HT22+Aβ组内基质金属蛋白酶2，9和白细胞介素1β表达量明显上升(P < 0.05)；HT22+Aβ+Lir组较HT22+Aβ组相比基质金属蛋白酶2，9和白细胞介素1β的表达量显著下降(P < 0.05)。⑥结合上述生物信息学数据及在GEO数据库的差异基因二次验证结果提示，基质金属蛋白酶2，9和白细胞介素1β均可作为利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点。

https://orcid.org/0000-0002-1459-5725(韩维娜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 阿尔茨海默病, 利拉鲁肽, 胰高血糖素样肽1受体, 生物信息学, DisGeNET数据库, SEA数据库, GEO数据库, MMP9, MMP2, 白细胞介素1β

Abstract: BACKGROUND: In the process of exploring the mechanism of Alzheimer’s disease, the important role of bioinformatics for common target screening has been revealed, enabling the use of its screening results as a basis for exploring the therapeutic effects of drugs on the disease.
OBJECTIVE: To predict the targets of liraglutide, a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, in the treatment of Alzheimer’s disease by bioinformatics and molecular biology.
METHODS: DisGeNET database and SEA database were used to obtain the common genes of Alzheimer’s disease and liraglutide. GO/KEGG enrichment analysis of common targets was conducted using DAVID online database. Protein-protein interaction networks were constructed using STRING database. The optimal dosage of liraglutide was determined using cell counting kit-8 assay. Expression of key proteins was analyzed using immunofluorescence and immunoblotting techniques. The mouse hippocampal neuron HT22 cell line was used for ex vivo experiments, and the cells were randomly divided into three groups: HT22 group, HT22+Aβ group, and HT22+Aβ+Lir group. No special treatment was done in the HT22 group, while Aβ1-42 was used to intervene in the HT22 cell line for 24 hours to construct an Aβ injury cell model in the HT22+Aβ group. In additional to modeling, liraglutide was added to the HT22+Aβ+Lir group for 12 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 3 333 genes associated with Alzheimer’s disease were screened from DisGeNET database. Then 147 potential targets of liraglutide were obtained from SEA database. Finally, 64 common targets of Alzheimer’s disease and Liraglutide were determined using R packets. GO/KEGG analysis of common targets using DAVID online database suggested that common targets were mainly enriched in the following biological processes: neuroactive ligand-receptor interaction, renin-angiotensin system, bladder cancer, endopeptidase activity, peptide receptor activity, G protein-coupled peptide receptor activity, and transport vesicles. The obtained 64 common target proteins were imported into SRTING online database for protein-protein interaction network construction, and the top three genes, matrix metalloproteinases 2, 9 and interleukin 1β, were obtained. The activity of cultured cells was detected by the cell counting kit-8 kit. Liraglutide at 100 nmol/L was the optimal concentration for antagonizing Aβ1-42. In the western blot and immunofluorescence assays, the expression of matrix metalloproteinases 2, 9 and interleukin 1β was significantly increased in the HT22+Aβ group compared with the HT22 group (P < 0.05) but significantly decreased in the HT22+Aβ+Lir group compared with the HT22+Aβ group (P < 0.05). To conclude, the above bioinformatics data and secondary validation of differential genes in the GEO database suggest that both matrix metalloproteinases 2,9 and interleukin 1β could be potential targets of liraglutide in the treatment of Alzheimer’s disease.

Key words: Alzheimer’s disease, liraglutide, glucagon-like peptide-1 receptor, bioinformatics, DisGeNET database, SEA database, GEO database, MMP9, MMP2, interleukin 1β

中图分类号:

韩维娜, 徐晓庆, 史晋宁, 李欣儒, 蔡红艳. 胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2568-2573.

Han Weina, Xu Xiaoqing, Shi Jinning, Li Xinru, Cai Hongyan. Prediction and validation of potential targets for the glucagon-like peptide-1 receptor agonist in the treatment of Alzheimer’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2568-2573.

图/表（结果） 7

2.1 阿尔茨海默病与利拉鲁肽共同靶点的筛选结果实验从DisGeNET数据库筛选出阿尔茨海默病相关联的基因，共得到3 333个关联基因。从PubChem上获取利拉鲁肽的2D结构和SMLIE编码结构式，见图1A，随后将SMLIE编码结构式输入至SEA数据库中，得到147个利拉鲁肽的潜在作用靶点。随后使用R包筛选出阿尔茨海默病与利拉鲁肽共同靶点，共64个，并使用R包进行可视化，见图1B。

2.2 共同靶点的GO/KEGG分析结果实验使用DAVID数据库进行共同靶点的GO/KEGG分析后发现，共同靶点主要富集在：神经活性配体-受体相互作用、肾素-血管紧张素系统、膀胱癌、内肽酶活性、肽受体活性、G蛋白偶联肽受体活性、转运囊泡、膜筏、蛋白酶体核心复合物、β亚单位复合物、蛋白质加工、内分泌过程及胶原分解代谢过程。实验使用R包可视化展示了富集结果排名前3位的结果，见图2。

2.3 蛋白互作网络的构建及关键基因的筛选结果实验将先前得到的64个共同靶点蛋白导入至SRTING在线数据库进行蛋白互作网络构建，见图3A。最后使用Cytoscape软件中的cytoHubba插件，根据基因的链接程度筛选关键基因，连接度最高的10个基因被作为关键基因，见图3B。其中MMP9、MMP2和白细胞介素1β为排名前3位的基因，因此，此次实验围绕MMP9、MMP2和白细胞介素1β展开。

2.4 利拉鲁肽可以抑制Aβ对HT22细胞的损伤作用，且100 nmol/L为最佳浓度实验采用CCK-8试剂盒检测了培养细胞的活性，确定100 nmol/L利拉鲁肽是拮抗Aβ1-42的最佳浓度，见图4。0 nmol/L利拉鲁肽组与对照组相比细胞活性明显下降，且有显著性差异(P < 0.001)，提示Aβ有细胞毒性作用；40，80，100，150，200 nmol/L浓度的利拉鲁肽均可以拮抗Aβ的细胞毒性作用，其中100 nmol/L时细胞活性最佳，且与0 nmol/L组相比有显著性差异(P < 0.01)。由于150 nmol/L浓度的利拉鲁肽组细胞活力开始下降，因此提示100 nmol/L浓度的利拉鲁肽为拮抗Aβ1-42的最佳干预剂量。

2.5 利拉鲁肽对关键基因MMP2、MMP9和ILIβ的影响实验结果发现，HT22+Aβ组MMP2、MMP9较HT22组相比表达量显著上升(P < 0.001)；HT22+Aβ+Lir组较HT22+Aβ组相比，MMP2、MMP9和白细胞介素1β的表达量显著下降(P < 0.001)，提示利拉鲁肽可以抑制阿尔茨海默病中上调的MMP2、MMP9和白细胞介素1β，见图5。

2.6 在免疫印迹实验中，得到了与免疫荧光实验相符的结果实验发现，较HT22组相比，在HT22+Aβ组内MMP2(P < 0.01)、MMP9(P < 0.05)和白细胞介素1β(P < 0.05)表达量明显上升；HT22+Aβ+Lir组较HT22+Aβ组相比MMP2(P < 0.01)、MMP9(P < 0.05)和白细胞介素1β(P < 0.01)的表达量显著下降。同样提示利拉鲁肽可以抑制阿尔茨海默病中上调的MMP2、MMP9和白细胞介素1β的表达。以上结果与免疫荧光结果共同提示MMP2、MMP9和白细胞介素1β均可作为利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点，见图6。

2.7 基于GEO数据库的差异基因二次验证以P < 0.05，LogFC绝对值≥0.5为标准筛选到807个差异基因，其中上调基因432个，下调基因375个。MMP2、MMP9和白细胞介素1β均位于上调差异基因中，见图7。该结果证实MMP2、MMP9和白细胞介素1β在阿尔茨海默病中是上调的，与前期的实验结果相吻合。

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引言

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，在老年人群中高发，并与遗传相关。阿尔茨海默病在临床上多表现为患者认知功能障碍、记忆功能下降、执行力下降乃至生活无法自理，耗费了大量的社会及医疗资源[1]。据报道，2000-2019年死于阿尔茨海默病的患者数增加了145%以上[2]，估计到2050年，全球将有超过1.52亿阿尔茨海默病患者[3]。对于阿尔茨海默病的研究层出不穷，但是多局限于改善症状与控制疾病的进展，并不能从根源上治疗阿尔茨海默病。因此，对于阿尔茨海默病致病机制的研究迫在眉睫。
常见的胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受体激动剂有艾塞那肽、贝拉鲁肽和利拉鲁肽等。利拉鲁肽(Liraglutide)是一种常见的GLP-1受体激动剂，已于2011-04-13在中国批准用于治疗成人2型糖尿病。利拉鲁肽是以葡萄糖依赖性方式促进胰岛素的分泌，从而最大限度地减少血糖过低的危险[4-5]。利拉鲁肽还可抑制胰高血糖素的分泌，减慢胃排空的速率，重建β细胞对胰岛素的敏感性，促进产生饱腹感从而导致能量摄入的减少和体质量的减轻[6]。利拉鲁肽通过抑制细胞的凋亡和促进细胞分裂增殖，来增加β细胞的数量[7-8]。已有研究表明2型糖尿病发病机制与阿尔茨海默病相似[9-10]，病理联系可能与蛋白异常聚集、胰岛素抵抗及信号系统紊乱、炎症反应和氧化应激等因素有关[11]。利拉鲁肽能够穿过血脑屏障，作为神经营养因子对阿尔茨海默病发挥神经保护作用和抗炎作用[12]。但利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病目前尚未被广泛使用，研究者们尝试挖掘其治疗机制。生物信息学是一种将生物学与计算机科学结合的新兴学科，基于在线数据库可以有效预测药物或疾病的潜在作用靶点。该实验先从DisGeNET数据库和SEA数据库中获取阿尔茨海默病关联基因和利拉鲁肽潜在作用靶点，获取二者共同基因并进行富集分析、蛋白互作网络分析及关键基因的筛查，最终决定基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP9)和白细胞介素1β作为该试验的实验目标蛋白。文章目的在于寻找利拉鲁肽和阿尔茨海默病的共同靶点，以及在细胞实验中探究利拉鲁肽能否通过影响共同靶点相关蛋白表达，从而延缓阿尔茨海默病的发生发展。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一种锌蛋白酶家族依赖性内肽酶，与阿尔茨海默病有关，特别是MMP2和MMP9能够触发几种神经炎症和神经退行性疾病[13]。而白细胞介素1β是先天免疫应答的关键细胞因子，在病理学水平可增强Aβ斑块的沉积和tau蛋白聚集，白细胞介素1β也可激活星形胶质细胞，星形胶质细胞衍生的蛋白质(如白细胞介素6和一些补体蛋白)的释放可能有助于斑块形成[14]。相关研究发现，MMP2和MMP9在2月龄5xF阿尔茨海默病小鼠海马组织中没有明显表达差异，在6月龄小鼠海马组织中MMP2和MMP9的表达明显上调；对于白细胞介素1β而言，在2月龄小鼠脑组织中即产生上调，到4-6月龄时上调幅度达到12倍，提示MMP2、MMP9和白细胞介素1β在阿尔茨海默病模型中均显著上调并具有预测意义[15]。MMPs和白细胞介素1β在阿尔茨海默病的发生发展中均起到推动作用，若抑制它们的表达是否可以在一定程度上阻止阿尔茨海默病的产生？利拉鲁肽本质是一种肠促胰岛素，肠促胰岛素已被证明具有抗炎作用[16]，但是在阿尔茨海默病中是否起作用尚不明确。综上实验提出猜想：已知MMPs和白细胞介素1β都能够推动阿尔茨海默病的进展，而利拉鲁肽在许多研究中被推测有治疗阿尔茨海默病的可能性，那么利拉鲁肽能否通过作用于前述靶点，从而在延缓阿尔茨海默病进展中起作用？
为了证实实验前期的猜想，先使用CCK8判断利拉鲁肽的最佳给药剂量，随后使用免疫荧光技术分析MMP9、MMP2和白细胞介素1β的表达情况。实验发现100 nmol/L是利拉鲁肽的最佳给药剂量，另外证实MMP9、MMP2和白细胞介素1β均可作为利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的作用靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计基因信息学实验结合细胞学体外实验结果验证。单因素方差分析分析结合Tukey法事后检验。
1.2 时间及地点实验于2022年7月至2023年3月在邵阳学院和山西医科大学实验室完成。

1.3 资料软件及数据库信息见表1。

1.4 实验方法
1.4.1 阿尔茨海默病相关基因的获取 DisGeNET数据库是一个与人类疾病相关的基因数据库，此数据库收集了大量与人类疾病相关的变异基因。实验从DisGeNET数据库筛选出阿尔茨海默病中相关联的基因，进入网站后选择“search”，接下来选择“diseases”，输入“Alzheimer’s Disease”，选择P < 0.05的差异基因，以供后续分析。
1.4.2 利拉鲁肽药物靶点的获取 PubChem数据库是一种化学模组的数据库，由美国国家健康研究院支持，美国国家生物技术信息中心负责维护。实验从PubChem上获取利拉鲁肽的2D结构和SMLIE编码结构式，以供后续靶点预测，获取方法：进入网站后，在“SEARCH”中输入“Liraglutide”，下载对应2D结构图和“Isomeric SMILES”。SEA数据库是一种完全基于化合物结构进行预测的数据库，实验将先前在PubChem数据库中得到的SMLIE编码结构式导入SEA数据库中，以获取利拉鲁肽潜在药物靶点。分析方法：在首页选择“Datasets”，将Pubchem中的“Isomeric SMILES”结构式输入下方搜索栏，点击“Try SEA”即可得到靶点基因。
1.4.3 阿尔茨海默病与利拉鲁肽共同靶点的筛选将先前得到的阿尔茨海默病相关基因和利拉鲁肽相关靶点取交集，并使用R语言进行可视化以绘制韦恩图，阿尔茨海默病和利拉鲁肽的交集基因提示利拉鲁肽可能通过调控这些基因治疗阿尔茨海默病，后续使用一系列实验来验证利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的作用靶点。
1.4.4 共同靶点的GO/KEGG富集分析 GO富集分析包含3个模块，分为生物过程(biological process，BP)，细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)；KEGG则可以在分子通路水平研究特定的生物进程。使用DAVID在线数据库进行GO富集分析及KEGG通路分析。P < 0.05认为差异有显著性意义。随后使用R软件进行可视化。
1.4.5 共同靶点的蛋白互作网络构建及关键蛋白的筛选随后使用STRING在线数据库(https://string-db.org/)构建阿尔茨海默病与利拉鲁肽共同靶点的蛋白互作网络。随后使用Cytoscape软件(v3.9.1)中的
cytoHubba插件，根据基因的链接程度筛选关键基因(hub gene)，连接度最高的5个基因被作为关键基因。
1.4.6 细胞学体外实验验证
细胞培养、处理及分组：使用小鼠海马神经元细胞系HT22(购于武汉普诺赛生命科技有限公司，CL-0697)进行细胞实验。HT22细胞使用DMEM高糖培养基(Solarbio公司，PYG0073)在37 ℃和体积分数5%CO2的培养箱内进行培养，添加体积分数10%胎牛血清(Boster公司，PYG0001-500)和50 U/mL青链霉素混合液(Solarbio公司，P1400)共同培养；隔天换一次培养基。待细胞铺满95%培养瓶底时，使用胰蛋白酶(Solarbio公司，T1300)37 ℃消化5 min后，完全培养基终止消化。
使用Aβ1-42构建阿尔茨海默病细胞模型是一种公认的造模手段。Aβ1-42与利拉鲁肽(纯度95%)均合成并购于湖北强耀生物科技有限公司。为了构建Aβ细胞损伤模型，实验将20 μmol/L浓度的Aβ1-42与HT22细胞系共培养24 h，随后移除Aβ1-42并给予利拉鲁肽。使用100 nmol/L浓度的利拉鲁肽干预Aβ预处理的细胞，观察利拉鲁肽改善阿尔茨海默病特定蛋白表达的作用。因此实验将细胞分为3组：HT22组、HT22+Aβ组和HT22+Aβ+Lir组。其中给药组在Aβ预处理24 h后，撤去Aβ，加入利拉鲁肽培养12 h，随后进行后续实验。所有分组细胞保证同时段并行培养。
CCK-8检测：为了确定利拉鲁肽拮抗Aβ1-42的最佳浓度，实验采用CCK-8试剂盒检测了培养细胞的活性。取消化后的细胞加培养基重悬成细胞悬液，随后均匀地接种在96孔板中，保证每孔2×104细胞，使接种细胞浓度保持在80%以上。将细胞分为对照组(不加Aβ干预)、20 μmol/L Aβ1-42加入不同浓度利拉鲁肽干预组(0，40，80，100，150，200 nmol/L)。将细胞在37 ℃培养箱中培养24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液(CK04，Solarbio公司)，轻轻振荡96孔板，随后将培养板在培养箱中孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处读取吸光度。
免疫荧光分析：待HT22细胞在培养瓶内长满80%浓度后，将细胞消化下来并均匀地接种在提前放置细胞专用爬片(特制爬片，无需黏附包被处理)的6孔板中，并将6孔板放在培养箱中培养24 h，使细胞贴壁在爬片上。待给药处理完后，使用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定30 min，随后加入含体积分数1% TritonX-100的PBS室温孵育15 min，用体积分数5% BSA室温封闭1 h后，弃去封闭液，直接滴加一抗工作液(MMP9兔抗小鼠一抗，Proteintech Group Inc.，货号：10375-2-AP，稀释比例1∶100；MMP2兔抗小鼠一抗，ABclonal Technology Co.，Ltd，货号：A11144，稀释比例1∶100；白细胞介素1β兔抗小鼠一抗，Affinity Biosciences，货号：BF8021，稀释比例1∶300)，4 ℃过夜。次日加入荧光二抗(FITC Goat Anti-Rabbit IgG，AS011，ABclonal Technology Co.， Ltd.，稀释比例1∶100)，避光37 ℃孵育1 h，加入DAPI染色液(Solarbio，C0065)常温染色10 min后，使用抗淬灭试剂(Solarbio，S2100)封固，置于荧光显微镜下观察，为了控制变量以HT22组的荧光参数(曝光时间3 s，增益7.1)为标准分析其他两组细胞。并用Image J软件读取目的蛋白通道的mean值[平均荧光强度(Mean) = 该区域荧光强度总和(IntDen)/该区域面积(Area)]，对平均荧光强度进行分析来判断蛋白表达量。
免疫印迹分析：待细胞融合度达到80%-90%时，用胰酶消化并离心，弃掉上清，保留剩余细胞团块。添加蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液至沉淀中，充分吹打混匀，置于超声细胞破碎仪破碎处理后，在冰上裂解30 min。在高速离心机中13 000 r/min离心25 min，取上清。采用BCA蛋白测定法进行蛋白定量(30 μg/μL)。95 ℃煮样10 min充分变性后，加入Maker 5 μL和样品10 μL于聚丙烯酰胺凝胶上电泳。从负极到正极依次为超厚滤纸、凝胶、PVDF膜、超厚滤纸，半干转膜20 min。放在脱脂奶粉中室温封闭2 h；加入对应一抗工作液(一抗厂家与免疫荧光实验保持一致，稀释比例：MMP2为1∶1 000；MMP9为1∶1 000；白细胞介素1β为1∶1 000)4 ℃孵育过夜；次日加入对应二抗(HRP 山羊抗兔IgG，AS014，ABclonal Technology Co.，Ltd.，稀释比例1∶5 000)常温孵育1 h；室温下使用ECL发光液孵育2 min，凝胶成像系统曝光，最后使用Image J软件对条带的灰度值进行分析，所有目的蛋白灰度值均除以内参蛋白(GAPDH)进行标化处理。
1.4.7 GEO数据库数据获取及处理为了二次验证实验的结论，实验从GEO数据库中检索到阿尔茨海默病相关数据集：GSE132903，该数据集包含97例阿尔茨海默病患者和98例非痴呆对照人群，采集样本来源为脑组织中颞回。使用GECO2R在线数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)筛选上述GEO数据库内获得的阿尔茨海默病与健康人群差异基因，并使用R语言软件进行可视化。
1.5 主要观察指标首先使用CCK8试剂盒探索利拉鲁肽最佳给药剂量，接下来使用免疫荧光和免疫印迹技术观察不同分组细胞内MMP9、MMP2和白细胞介素1β的蛋白表达情况。采用免疫荧光实验通过分析蛋白平均荧光强度确定蛋白表达量，免疫印迹实验通过判断目的蛋白条带的灰度值来确定蛋白表达量。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计学处理以及绘图，数据以x±s表示，实验的组间比较均使用单因素方差分析进行分析，并使用Tukey法进行事后检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过邵阳学院生物统计学专家审核。

讨论

文章中前期的生物信息学结果发现，MMP2、MMP9和白细胞介素1β可能是利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在治疗靶点。对此结果行免疫荧光实验进行初步验证，发现MMP2、MMP9和白细胞介素1β在阿尔茨海默病中均显著上调，而给予利拉鲁肽后MMP2、MMP9和白细胞介素1β表达均下调。后续的免疫印迹实验得到了类似的结果，基于GEO数据库的二次验证，亦证实MMP2、MMP9和白细胞介素1β在阿尔茨海默病中是上调的。在现有研究中，尚未有报道利拉鲁肽通过介导MMPs和白细胞介素1β来发挥抗阿尔茨海默病作用，文章通过细胞实验的结果，证明了MMP2、MMP9及白细胞介素1β在利拉鲁肽作用下发生下调，提示MMP2、MMP9和白细胞介素1β可以作为利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的作用靶点，但是具体的机制尚不明确。
利拉鲁肽属于GLP-1受体激动剂，是一种神经营养因子，研究发现其有可能发挥神经保护作用和抗炎作用，其能通过血脑屏障，还通过神经元祖细胞增殖、改善学习、减少大脑斑块形成和炎症反应[17-18]。在动物实验中，利拉鲁肽通过降低tau蛋白的磷酸化改善阿尔茨海默病小鼠的学习记忆能力[19]，GLP-1类似物利西那肽可有效拮抗Aβ引起的神经元损伤和空间记忆障碍[20]。实验先前的研究证实利拉鲁肽既能够改善阿尔茨海默病动物模型学习记忆水平以及海马神经可塑性[21]，同时还具有促进海马区神经再生并改善抑郁症关联症状的效应[22]。
MMPs是参与细胞外基质几乎所有蛋白质成分重塑的蛋白水解酶，其不受控制或不适当的表达导致了不同的病理改变，包括炎症、肿瘤生长、癌细胞入侵和感染[23]，参与脑组织和血脑屏障的许多生理和病理过程[24]。其中MMP2和MMP9能够结合较大的底物如明胶，并具有有效切割的能力，在神经退行性疾病和神经炎症发生发展中起到重要作用[13]。MMPs还通过影响修饰结构蛋白的功能并破坏细胞因子的正常功能，引起神经系统疾病，并最终导致疾病恶化。
Aβ沉积是阿尔茨海默病的常见病理表现，BJERKE等[25]提出基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1，TIMP-1)和MMP9可以作为阿尔茨海默病的生物标志物，仅次于P-tau、T-tau、脑白质病变和Aβ沉积，提示MMPs和阿尔茨海默病之间有很密切的关系。相关研究发现在轻度认知障碍患者中，MMP9的高表达与认知障碍的产生高度相关[26]。同时LORENZL等 [27]发现阿尔茨海默病患者血清中MMP9水平升高，同时在阿尔茨海默病患者的神经纤维缠结、神经元细胞质、血管组织和淀粉样斑块中均表达上调。在动物模型中，脑室内注射Aβ后，海马组织中的MMP9表达明显上调，同时MMP9的高表达诱导了认知障碍的产生[28]。研究发现，5xF阿尔茨海默病小鼠体内MMP的过表达可能与淀粉样蛋白产生具有相关性，提示MMP可能是一种新的前淀粉样蛋白生成酶，并诱发Aβ的产生[15]。MMP基因表达的这种选择性调节可能是由于促炎细胞因子刺激MMPs所致，TIMP似乎也受到细胞因子的调节，特别是TIMP-1，其表达被白细胞介素1β显著上调。
以往研究显示，MMP2、MMP9可被Aβ激活，应用广谱的MMP抑制剂后，可以降低由于Aβ沉积导致的血管内皮细胞连接受损引起的血脑屏障通透性增加[29]，这提示MMP2、MMP9在阿尔茨海默病的病程中损伤正常的血脑屏障，血脑屏障通透性增加又可促使更多炎性因子透过血脑屏障，炎症因子沉积在神经细胞周围或进入细胞内引起各种炎性反应，并加速阿尔茨海默病的发病。以上结果提示，MMPs家族与阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发生发展具有相关性。
白细胞介素1β是一种十分常见的炎症因子，同时参与调控多种细胞功能，包括细胞增殖和分化。在阿尔茨海默病中，白细胞介素1β是小胶质细胞因Aβ沉积而产生和分泌的一种促炎因子，诱导阿尔茨海默病慢性神经炎症，最终导致神经组织受损、神经变性和功能障碍[30]。Aβ1−42寡聚体通过诱导小胶质细胞释放促炎因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α，并干扰抗炎细胞因子(如转化生长因子β1)的合成，促进阿尔茨海默病脑中的神经炎症和神经元死亡[31]。因此白细胞介素1β在阿尔茨海默病的发生发展中起到重要作用。
GLP-1受体激动剂利拉鲁肽本质是一种肠促胰岛素，它能够与GLP-1受体结合，激活PI3K/MAPK信号通路，并通过调控脑脊液中Aβ转运蛋白的活性来促进Aβ的清除[32]。肠促胰岛素具有抗炎作用，这种作用是由cAMP/PKA信号通路所介导的，相关研究发现，Teneligliptin是一种DPP-4抑制剂，能够明显抑制白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等炎症因子的表达[16]。同时另一项研究发现，利拉鲁肽可以通过上调肥胖和2型糖尿病患者体内SIRT1的表达来抑制促炎核转录因子κB通路的激活，通过上调SIRT1的表达，下调促炎因子并减轻患者体内的炎症反应来阻止疾病的发展[33-34]。相关研究发现，白细胞介素1β的进一步上调会引起由炎症所诱导的神经元和突触功能障碍，并促进Aβ斑块的累积作用，白细胞介素1活性升高还与神经纤维缠结的产生有关，并且能够诱导Tau蛋白过度磷酸化[35]。另一项研究发现白细胞介素1β的过表达会进一步诱发3xTg-阿尔茨海默病小鼠的Tau蛋白磷酸化，而抑制白细胞介素1β后，Tau蛋白水平有所改善，认知能力亦改善[36]。以上研究均证实白细胞介素1β与阿尔茨海默病的神经炎症高度相关，而利拉鲁肽可以抑制阿尔茨海默病的神经炎症。
正如前文所述，MMP2、MMP9和白细胞介素1β的高表达与阿尔茨海默病模型的神经炎症相关。实验也发现，在阿尔茨海默病细胞模型中MMP2、MMP9和白细胞介素1β的表达均显著升高，提示阿尔茨海默病的发病机制与炎症相关。实验发现，使用利拉鲁肽后MMP2、MMP9和白细胞介素1β等炎症因子的表达均显著下调，提示利拉鲁肽可以改善阿尔茨海默病的炎症反应，并且可能通过MMP2、MMP9和白细胞介素1β所介导。
综上所述，文章认为MMP2、MMP9和白细胞介素1β是利拉鲁肽治疗阿尔茨海默病的潜在治疗靶点，且可能通过减轻阿尔茨海默病神经炎症来发挥作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

胰高血糖素样肽1受体激动剂治疗阿尔茨海默病的潜在靶点预测及验证

Prediction and validation of potential targets for the glucagon-like peptide-1 receptor agonist in the treatment of Alzheimer’s disease

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