增生性瘢痕差异表达基因及小分子药物预测的生物信息学分析与验证

doi:10.12307/2024.332

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2166-2172.doi: 10.12307/2024.332

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增生性瘢痕差异表达基因及小分子药物预测的生物信息学分析与验证

左俊，马少林

新疆医科大学第一附属医院整形科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2023-03-21 接受日期:2023-05-25 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 马少林，硕士，主任医师，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院整形科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:左俊，男，1985年生，湖南省衡阳市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院在读博士，主治医师，主要从事整形美容外科临床与科研工作。
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金项目(81760345)，项目负责人：马少林；湖南省自然科学基金青年基金项目(2021JJ40487)，项目负责人：左俊

Bioinformatics analysis and validation of differentially expressed genes and small molecule drug prediction in proliferative scar

Zuo Jun, Ma Shaolin

Department of Plastic and Aesthetic Surgery, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-03-21 Accepted:2023-05-25 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Ma Shaolin, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zuo Jun, MD candidate, Attending physician, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (Regional Program), No. 81760345 (to MSL); Youth Program of Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 2021JJ40487 (to ZJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生物信息学：作为一门结合了生物学与计算科学的新兴学科，被用于快速、大规模地获取生物信息，揭示疾病的分子机制。
增生性瘢痕：是由胶原蛋白等细胞外基质成分过度沉积以及成纤维细胞增殖和凋亡失衡引起的一种皮肤纤维化疾病。皮肤创伤后增生性瘢痕的总体发生率为40%-70%，烧伤后的发生率甚至高达80%。

背景：增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖、表皮增厚和角质层功能不良为特征的皮肤纤维化疾病，目前其具体发病机制仍不清楚。

目的：基于生物信息学筛选增生性瘢痕相关数据集的核心(Hub)基因及重要信号通路，再用细胞实验加以验证，预测对其可能有治疗作用的小分子药物。
方法：从基因表达综合数据库搜索增生性瘢痕相关的数据集，通过R软件筛选差异表达基因，对差异表达基因进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)富集分析，使用String在线平台构建差异表达基因的蛋白质相互作用网络，然后分别利用Cytoscape软件中的Cytohubba和MCODE插件筛选出蛋白质相互作用网络中的关键基因和核心模块，进一步将上述关键基因和构成核心模块的基因求交集得到Hub基因，通过荧光定量PCR验证Hub基因mRNA在人增生性瘢痕与正常皮肤表皮干细胞中的表达差异，并利用人类蛋白图谱中组织学数据验证Hub基因编码蛋白在2种组织中表达量和分布的差异，最后用connectivity map数据库预测针对增生性瘢痕的潜在作用药物。

结果与结论：①筛选出的差异表达基因中上调基因102个、下调基因702个，基因本体论和KEGG分析结果显示，富集的信号通路及生物学过程主要涉及紧密连接、花生四烯酸代谢、细胞外基质受体交互、表皮发育和角质化等；②取交集得到8个Hub基因与调控胆固醇代谢的甲羟戊酸途径密切相关，分别是HMGCS1、DHCR7、MSMO1、FDPS、MVK、HMGCR、MVD和ACAT2；③荧光定量PCR结果显示，相比正常皮肤组，增生性瘢痕组HMGCS1、DHCR7、MSMO1、FDPS、HMGCR、MVD和ACAT2 mRNA的表达均显著下降(P < 0.05) ，而MVK mRNA的表达无明显变化(P > 0.05)；④除MVK外，其余Hub基因编码蛋白在正常皮肤组织中表达水平均高于增生性瘢痕组织(P < 0.05)；⑤评分排列前10的候选药物包括蛋白激酶A抑制剂(H-89)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(Dabigatran-Etexilate)、FLT3抑制剂(舒尼替尼)等，其中白藜芦醇和β-谷甾醇均为植物来源；⑥提示与甲羟戊酸代谢途径密切相关的Hub基因可能通过调控脂质代谢影响表皮结构与功能，这可能是增生性瘢痕的重要发病机制之一，此次研究筛选的小分子化合物可作为治疗增生性瘢痕的候选药物。

https://orcid.org/0000-0002-8962-616X (左俊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 增生性瘢痕, 生物信息学, 成纤维细胞, 表皮干细胞, 角质化, 脂质代谢, 甲羟戊酸代谢途径, 药物预测

Abstract: BACKGROUND: Hypertrophic scar is a skin fibrosis disease characterized by excessive proliferation of fibroblasts, epidermal thickening, and stratum corneum dysfunction. At present, the pathogenesis of Hypertrophic scar is still unclear.
OBJECTIVE: To screen the core (Hub) genes and important signaling pathways in hypertrophic scar-related datasets based on bioinformatics, and then verify them by cell experiments to predict small molecule drugs that may have therapeutic effects on hypertrophic scar.
METHODS: Datasets related to hypertrophic scar were searched from Gene Expression Omnibus (GEO) database, and differentially expressed genes were identified by R software analysis. Gene ontology and KEGG enrichment analyses were performed for differentially expressed genes. Protein-protein interaction network of differentially expressed genes was constructed using String online platform. Then, the key genes and core modules in the protein-protein interaction network were screened by Cytohubba and MCODE plugin-in Cytoscape software respectively, and the Hub genes were obtained by the intersection of the above key genes and the genes that formed the core module. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to verify the difference in Hub gene mRNA expression between human hypertrophic scar and normal skin epidermal stem cells. The histological data from the Human Protein Atlas were used to verify the differences in the expression and distribution of Hub gene-encoded proteins in the two kinds of human tissues. Finally, the potential drugs for hypertrophic scar were predicted by the connectivity map database.
RESULTS AND CONCLUSION: Among the identified differentially expressed genes, 102 genes were up-regulated and 702 genes were down-regulated. Gene ontology and KEGG analysis showed that the enriched signaling pathways and biological processes were mainly involved in tight junction, arachidonic acid metabolism, extracellular matrix receptor interaction, epidermal development and keratinization. Eight Hub genes were found to be closely related to the mevalonate pathway that regulates cholesterol metabolism, including HMGCS1, DHCR7, MSMO1, FDPS, MVK, HMGCR, MVD and ACAT2. Compared with the normal skin group, the mRNA expression of HMGCS1, DHCR7, MSMO1, FDPS, HMGCR, MVD and ACAT2 in the hypertrophic scar group decreased significantly (P < 0.05), while MVK mRNA expression had no significant change (P > 0.05). Except for MVK, the expression levels of other Hub gene-encoded proteins in normal skin tissue were higher than those in hypertrophic scar tissue (P < 0.05). The top 10 candidate drugs included protein kinase A inhibitor (H-89), serine protease inhibitor (Dabigatran-Etexilate), FLT3 inhibitor (sunitinib), among which resveratrol and β-sitosterol are plant extracts. To conclude, Hub genes closely related to mevalonate metabolism may affect the structure and function of the epidermis by regulating lipid metabolism, which may an important pathogenesis of hypertrophic scar. The small-molecule compounds identified in this study can be used as candidate drugs for the treatment of hypertrophic scar.

Key words: hypertrophic scar, bioinformatics, fibroblast, epidermal stem cell, keratinization, lipid metabolism, mevalonate metabolic pathway, drug prediction

中图分类号:

左俊, 马少林. 增生性瘢痕差异表达基因及小分子药物预测的生物信息学分析与验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2166-2172.

Zuo Jun, Ma Shaolin. Bioinformatics analysis and validation of differentially expressed genes and small molecule drug prediction in proliferative scar[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2166-2172.

图/表（结果） 7

2.1 差异表达基因的筛选此次研究纳入两组基因芯片，其中GSE188952数据集包括3例正常瘢痕样本，5例增生性瘢痕样本；GSE210434数据集包括3例正常瘢痕样本，3例增生性瘢痕样本。两组芯片预处理后中位数位于同一水平线，提示样本的基因表达谱数据一致性良好，可用于正常和增生性瘢痕患者差异表达基因的后续分析。GSE188952数据集共筛选出804个差异基因，其中上调基因102个，下调基因702个；GSE210434数据集共筛选出85个差异基因，其中上调基因46个，下调基因39个。进一步采用火山图(图1A，B)和热图(图1C，D)进行可视化处理。取交集后仅有2个共同DEGs(图2)，故选取DEGs数量较多的GSE188952数据集进一步分析。

2.2 DEGs的生物学功能及通路富集分析基因本体论富集分析中生物学过程结果显示，DEGs主要在表皮发育(epidermis development)、表皮细胞分化(epidermal cell differentiation)、角质形成细胞分化(keratinocyte differentiation)、角质化(keratinization)等子集中富集(图3A)；细胞组分结果显示，DEGs主要在中间丝(intermediate filament)、角蛋白纤维(keratin filament)、中间丝细胞骨架(intermediate filament cytoskeleton)和细胞桥粒(desmosome)等子集中富集(图3B)；分子功能结果显示，DEGs主要在细胞骨架的结构组成(structural constituent of cytoskeleton)、酰基转移酶活性(acyltransferase activity)、三酰甘油脂肪酶活性(Triglyceride lipase activity)和表皮的结构组成(structural constituent of skin epidermis)(图3C)。KEGG信号通路富集分析显示主要参与的信号通路有紧密连接(Tight junction)、萜类骨架生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)和细胞外基质受体交互(ECM-receptor interaction)等(图3D)。

2.3 蛋白质相互作用网络的构建与Hub基因的筛选利用Cytoscape中的Cytohubba插件找出关键基因，见图4A，节点颜色越深代表分值越高。再根据MCODE插件分析模块的重要程度，进一步筛选核心模块，包括HMGA1、MVK、ACSS、HMGCR、FASN、ACAT2、MVD、FDPS、TM7SF2、DHCR7、MSMO1、HMGCS1、AACS、SOAT1、DHCR24、SULT2B1和CH25H共17个基因(图4B)。为了进一步缩小Hub基因的范围，将Degree排名前20的关键基因与构成核心模块的基因求交集，筛选出HMGCS1、DHCR7、MSMO1、FDPS、MVK、HMGCR、MVD、ACAT2 共8 个Hub基因，均为下调基因(图4C)。

2.4 荧光定量PCR验证Hub基因mRNA的表达如图5所示，对比正常皮肤组，增生性瘢痕表皮干细胞中Hub基因HMGCS1、DHCR7、MSMO1、FDPS、HMGCR、MVD、ACAT2的mRNA的表达均显著下降(P < 0.05) ，而MVK mRNA的表达无明显变化(P > 0.05)。

2.5 Hub基因编码蛋白在正常皮肤和增生性瘢痕组织中的表达差异人类蛋白图谱数据库免疫组织化学法检测数据显示，除MVK外，其余Hub基因编码蛋白在正常皮肤组织中表达水平均高于增生性瘢痕组织(P < 0.05)。见图6。

2.6 根据Hub基因预测小分子药物由于cMAP数据库将上调基因的上传数目限定在10-150 个，此次研究将上述8 个下调的Hub基因和全部102 个上调的DEGs上传到cMAP，以原始评分0.7为界值，共筛选出47 个潜在药物，包括蛋白激酶A抑制剂(H-89)、凝血酶/丝氨酸蛋白酶抑制剂(Dabigatran- Etexilate)、FLT3抑制剂(舒尼替尼)、细胞色素P450抑制剂/SIRT激活剂(白藜芦醇)、HDAC抑制剂(JNJ-26481585)、SRC抑制剂(塞卡替尼)、TRX/TRX1抑制剂(β-谷甾醇)、CC趋化因子受体拮抗剂(RS-504393和AMD-11 070)、FGFR抑制剂(尼达尼布)、5-羟色胺受体拮抗剂(甲麦角林)、固醇去甲基酶抑制剂(酮康唑)等。去除药物列表中作用机制或靶点名称不详的化合物，评分排序前10的增生性瘢痕候选药物详见表2。

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引言

增生性瘢痕是皮肤损伤过程中典型的病理反应，可导致患者出现疼痛、瘙痒、挛缩等症状，甚至影响其身心健康。皮肤外伤后增生性瘢痕的总体发生率为40%-70%，烧伤后增生性瘢痕的发生率甚至高达80%[1]。目前增生性瘢痕的防治手段有物理治疗、激光、手术和药物治疗等，每种手段都有其优缺点[2-6]，例如：物理压迫疗法的效果取决于压力和时间，具有经验依赖性，缺乏标准化应用；糖皮质激素病灶内注射的有效率为50%-100%，复发率为9%-50%，但存在皮肤萎缩、色素减退和毛细血管扩张等不良反应[7]；单纯手术切除的复发率高达45%-100%，对于复发率高的难治性瘢痕，手术治疗常需联合糖皮质激素注射或其他无创治疗[8]；虽然国内外共识推荐使用点阵剥脱激光作为增生性瘢痕的一线治疗手段，但仍可能出现水疱形成、色素沉着或减退等不良反应[9]。近期一项针对增生性瘢痕的系统评价认为不能对手术+辅助治疗或非手术治疗进行优先推荐，需要开展更多研究来确定不同治疗方案之间是否存在复发率偏倚[10]。可见疗效确切、副反应少且复发率低的防治措施依然有限。而大多数植物药不良反应小且来源丰富，为治疗增生性瘢痕提供了新的思路和方法。近年来，随着生物信息学的发展和测序技术的应用，从转录组、蛋白组水平研究疾病的发生发展机制已成为普遍关注的热点[11]。此次研究基于基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)，运用生物信息学手段分析差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)和核心(Hub)基因，并利用体外细胞实验和人类蛋白图谱中的组织学数据加以验证，同时通过药物基因组数据库(connectivity map，cMAP)预测可调控增生性瘢痕表皮干细胞功能的小分子化合物，旨在为植物化合物治疗增生性瘢痕的进一步研究提供思路，促进发现针对增生性瘢痕临床治疗更有效的潜在药物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学分析结合细胞学实验结果验证，统计主要采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点于2022 年2-4 月在新疆医科大学第一附属医院临床研究院干细胞实验室完成。
1.3 材料组织标本取自2022 年2-4 月在新疆医科大学第一附属医院整形科就诊并接受手术的3 例患者，女1 例，男2 例。
纳入标准：经术前临床诊断及术后病理检查确诊为增生性瘢痕，无全身系统性疾病，术前未接受过任何抑制增生性瘢痕治疗。
排除标准：术前接受过增生性瘢痕的相关治疗。
术前均取得患者知情同意且通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准(批准号：20170214-71)。
1.4 方法
1.4.1 GEO芯片数据来源通过在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索“Hypertrophic scar”，限制条目类型为DataSets，种属为Homosapiens ，研究类型为Expression profiling by high throughput sequencing。可得到GSE188952和GSE210434两个芯片数据集，分别基于GPL16791 和GPL18573平台，从中选取增生性瘢痕和正常瘢痕样本进行分析。
1.4.2 数据处理及差异表达基因筛选所有数据都经过log2转换，并使用R软件(4.11版)preprocessCore包中的normalize quantiles函数进行归一化。根据归一化数据的平台注释信息，将探针转换为基因名。运行limma包筛选出正常瘢痕与增生性瘢痕之间的DEGs，绘制火山图对标准化后的数据进行可视化。以校正的P(adj.P) < 0.05及|log2FC| ≥1为标准筛选出差异基因。分别将2 个数据集的DEGs用Venn(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集，获得2个数据集共表达的差异基因。
1.4.3 DEGs的功能分析及通路富集分析 DEGs的功能和通路富集分析使用基因本体论(http://www.geneontology.org/)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG，http://www.kegg.jp)数据库。基因本体论分为生物学过程、细胞组分和分子功能。将上述共表达的DEGs输入DAVID数据库(https://david.ncif-crf.gov/)进行基因本体论生物学功能和KEGG通路富集分析，限定物种为Homosapiens，P < 0.05为差异有显著性意义，将富集程度前30 位的结果进行可视化。
1.4.4 DEGs蛋白质相互作用网络构建和Hub基因筛选将DEGs导入STRING在线软件(https://www.string-db.org) 中，参数设置：限定物种为Homosapiens，最低要求互动分数0.700，隐藏不互动的单一节点。将生成的TSV文件导人Cytoscape 3.8.0软件，利用Cytohubba插件筛选蛋白质相互作用网络中关键基因(Degree≥5)。再利用MCODE插件进一步筛选核心模块，参数设置为：最小评分阈值为6、允许偏离核心0.1、排除最大连接度5以下。然后将Degree值排名前20的关键基因与构成核心模块的基因求交集进一步筛选Hub基因。
1.4.5 实时荧光定量PCR验证 Hub基因mRNA的表达
(1)正常皮肤与增生性瘢痕表皮干细胞分离及培养：增生性瘢痕标本取自2022 年2-4 月在新疆医科大学第一附属医院整形科行瘢痕切除+取皮植皮手术的3 例患者，正常皮肤(瘢痕)组织取自患者行植皮手术时取皮修剪后的残余全厚皮片。将瘢痕组织或残余皮片经dispase酶消化后分离并收集表皮组织，继续用0.25%胰蛋白酶消化15 min，体积分数10%胎牛血清(美国Gibco公司，42F7180K)终止消化，过滤收集细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入含有表皮生长因子(10 μg/mL)和非必需氨基酸(0.1 mmol/L)的DMEM(美国Gibco公司，C1199500BT)重悬细胞，以5×108 L-1的密度在铺有Ⅳ型胶原的培养皿中培养，流式细胞术鉴定完毕后分别用于下一步实验。

(2)正常皮肤与增生性瘢痕表皮干细胞中Hub基因mRNA表达的差异：利用NCBI Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计靶点基因的特异性引物对，见表1，由广州擎科生物工程有限公司合成。使用TRIzol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司，15596-026)提取两组细胞样本总RNA，以人内源性β-actin为内参基因，用SYBR GREEN Ⅱ qPCR法进行PCR扩增(反转录试剂盒为日本TaKaRa公司，RR047A；荧光定量检测仪为美国Bio-rad，CFX96)，条件为：95 ℃，10 min预变性；随后95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，共40 次循环。每份重复样品各设3 个qPCR反应并取平均值，以阴性对照组结果为参照，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达水平[12]。

1.4.6 免疫组织化学法验证Hub基因在正常皮肤和增生性瘢痕组织中的差异表达利用人类蛋白图谱数据库(http://www.proteinatlas.org)中探究8 个Hub基因编码的蛋白在正常皮肤和增生性瘢痕组织中的表达差异，分别从蛋白相对表达水平和分布进行验证。
1.4.7 预测小分子化合物使用cMAP(https://clue.io/)分别读取基因的上调及下调组，基于对药物的连通性评分进行排序和筛选。当化合物-细胞系组合与上传基因具有高度重叠的基因表达谱，说明二者之间有相似的变化，该组合获得正连通性评分；而负连通性评分则表明该化合物引起和上传基因相反的变化，表明该化合物可能具有治疗作用[13]，以原始评分0.7为界值。
1.5 主要观察指标差异表达基因的生物信息学分析及荧光定量PCR检测Hub基因的表达。
1.6 统计学分析所有实验重复3 次，采用Graphpad Prism 9软件进行数据分析并绘制图片。计量数据以x±s表示，用独立样本t检验进行组间差异比较，P < 0.05 则代表差异有显著性意义。文章统计学方法已经新疆医科大学公共卫生学院杨涛教授审核。

讨论

正常创面愈合分为3 个相互关联的阶段：炎症期、增殖期和重塑期。炎症期自组织损伤即刻启动，形成血小板栓和纤维蛋白基质以止血，免疫系统也随炎症反应被激活开始清除坏死组织；增殖期始于血管新生，以传递成纤维细胞增殖所必须的氧气和营养物质，活化的成纤维细胞和巨噬细胞帮助纤维蛋白基质被肉芽组织取代，之后成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，产生胶原等细胞外基质，最终形成瘢痕[14]；而重塑期涉及蛋白水解酶的相互作用，主要是基质金属蛋白酶及其抑制剂，目标是降解多余的细胞外基质，并将不成熟的Ⅲ型胶原转化为成熟的Ⅰ型胶原。胶原生成和降解之间的失衡，特别是导致成纤维细胞过度增殖和分化为肌成纤维细胞的炎症递质过多，是增生性瘢痕形成的重要机制[15-16]。虽然成纤维细胞是增生性瘢痕发生发展过程中最主要的效应细胞，但增厚的表皮和功能不良的角质层近期也被证实参与构成增生性瘢痕[17]。增生性瘢痕的防治在烧伤、整形外科和康复领域是一个具有挑战性的课题[18]。随着对增生性瘢痕发病机制认识的更新和药物研究的快速进展，植物提取物在防治增生性瘢痕方面取得了突出的成就[19-21]。然而增生性瘢痕的药理学研究主要集中在有限的通路上，未深入阐明其作用机制，也未发现新的信号通路和靶点。近期多学科交叉和大数据集驱动在药理学研究中得到了广泛应用[22]。此次研究利用GEO数据库搜索DEGs，然后进行基因功能和信号通路注释，同时从DEGs的蛋白质相互作用网络中识别Hub基因并进行细胞实验验证，最后基于Hub基因确定治疗增生性瘢痕的潜在候选药物，有助于未来针对增生性瘢痕患者开展前瞻性的临床试验。
此次研究显著富集的生物学过程和通路为理解增生性瘢痕提供了更详细的分子机制。皮肤屏障由包括角质层、桥粒、胞间脂质和紧密连接等诸多成分组成，角质形成细胞分化并持续角质化形成角质层，并分泌脂质包裹在角质细胞的周围起到滋养润泽的保护效应，同时释放到表层形成脂膜[23]；而紧密连接作为相邻表皮细胞间最重要的连接方式，不仅能增强其黏附能力，还能封闭细胞间隙、控制其通透性，它对维持皮肤屏障的结构稳定和功能正常起着至关重要的作用[12]。此次研究通过 KEGG通路富集分析发现，增生性瘢痕相关基因主要在紧密连接通路中显著富集。紧密连接功能异常可导致皮肤屏障减弱，胞间信号异常传递，表皮细胞增殖分化异常，外界微生物等抗原通过屏障刺激机体免疫系统，同时紧密连接的破坏扩大细胞间隙，便于炎性和免疫细胞迁移与游走，进一步激活免疫应答，这可能是增生性瘢痕形成的重要机制之一[24]。基因本体论富集分析结果也提示，增生性瘢痕相关基因在表皮/角质形成细胞发育与分化、桥粒、细胞骨架和脂肪酶活性等表皮相关功能与结构中显著富集，可见皮肤屏障功能受损是增生性瘢痕发病的重要基础之一。
此次研究通过KEGG通路富集分析还发现增生性瘢痕相关基因在花生四烯酸代谢和细胞外基质受体交互通路中显著富集。脂质是细胞膜的重要组成部分，脂质及其内源性代谢物提供促炎和抗炎因子及次级信使可能影响增生性瘢痕中的细胞内信号转导[25]。花生四烯酸的多种代谢物，包括促炎调节剂前列腺素E2，近来发现它还具有抗炎作用，相比正常皮肤成纤维细胞，瘢痕疙瘩成纤维细胞产生前列腺素E2水平降低，而前列腺素E2能增强基质金属蛋白酶1的表达，后者负责降解细胞外基质[26]。鉴于瘢痕疙瘩与增生性瘢痕有着相似的生物学特征，可以推断脂质代谢异常也可能参与增生性瘢痕的发生与进展。
此次研究进一步发现通过筛选得到的Hub基因也与脂质代谢相关，包括HMGCS1、HMGCR、FDPS、MVK、MVD和ACAT2等，上述基因编码的蛋白都属于甲羟戊酸代谢途径的关键酶，该途径是细胞内合成胆固醇的唯一方式[27]。甲羟戊酸代谢途径可利用乙酰辅酶A为原料，经包括HMGCS1、HMGCR、FDPS在内的多基因调控，继而影响多种肿瘤细胞的增殖[28-29]。其中HMGCS1可在体外促进肿瘤细胞生长以及肿瘤在体内的肺转移，降低HMGCS1表达可以抑制肿瘤生长[30-31]。HMGCR则是甲羟戊酸代谢途径最关键的限速基因，靶向HMGCR可作为治疗肿瘤的潜在策略[32]。FDPS与肿瘤增殖、侵袭与重编程关系密切，降低其表达能影响胆固醇生成[33]。MSMO1也是催化胆固醇前体转化的代谢酶[34]。DHCR7的作用是将7-脱氢胆固醇催化生成胆固醇[35]，DHCR7可能通过协同HMGCR、MVK、MSMO1干预胆固醇稳态[36]。脂筏是富含胆固醇和鞘脂的特化质膜微域，其主要蛋白成分为caveolin-1，caveolin-1细胞通透肽(cav-1p)可抑制瘢痕疙瘩中转化生长因子β1诱导的Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白和α-平滑肌肌动蛋白mRNA和蛋白表达的上调[26]。因此在胆固醇生物合成途径中，上述酶的失调导致胆固醇(其前体)缺乏，这可能是增生性瘢痕的致病因素之一。鉴于化疗药物也被用于治疗增生性瘢痕，且有研究证实增生性瘢痕成纤维细胞同样会对维拉帕米等化疗药产生耐药性[37]，作者认为可利用甲羟戊酸代谢途径筛选有效且具应用前景的抗增生性瘢痕天然药物。
腺苷通过产生环磷酸腺苷激活其下游靶点蛋白激酶A导致成纤维细胞活化和胶原合成[38]，选择性靶向上述受体及其信号通路的药物可能阻止增生性瘢痕的进展，如蛋白激酶A抑制剂H-89。最新研究通过单细胞测序和体内外实验证实，丝氨酸蛋白酶抑制剂西格列汀和BC-11能干预细胞外基质沉积改善创面愈合后的瘢痕质量[39]，说明该类抑制剂是治疗增生性瘢痕的候选药物。JAK2/FLT3抑制剂马来酸氟诺替尼对骨髓增殖性肿瘤引发的骨髓纤维化有很好的抑制作用，但暂未见关于它在皮肤纤维化中的报道[40]。在小鼠创面模型中，植物提取物白藜芦醇可通过靶向SIRT1负向调控转化生长因子β1诱导的成纤维细胞活化，抑制瘢痕形成[41]。同为植物化合物的β-谷甾醇在体内外研究中已被证实能抑制肝、肺等多个器官的纤维化[42-43]，但对增生性瘢痕是否有治疗作用则未见报道。值得注意的是，上述两种天然化合物都可能通过调控脂质代谢影响表皮细胞功能与结构从而发挥抗增生性瘢痕的作用[44]。
cMAP数据库包含的小分子化合物大多在常见细胞系上进行了验证，生成具有潜在治疗效应的药物列表。由于增生性瘢痕的异质性和复杂性，现有治疗药物的有效性和复发率不确切，还存在皮肤萎缩、色素减退等不良反应，故近来对新型候选药物的需求逐渐增加。此次研究为增生性瘢痕候选药物的筛选和鉴定提供更快速、有效的手段。为获得高质量的数据，克服生物网络和文献挖掘结果中的数据噪点，在测序数据解释和cMAP中应用了一系列生物信息学和统计学方法[45]。解读此次研究的数据时应考虑到几个局限性，这一过程是基于测序数据进行的生物信息学分析，可为未来的实验提供框架，但不是前瞻性的临床数据。因而此次研究结果应用于临床之前，还需要进一步的实验验证和临床前试验。基于多学科交叉的深入、治疗增生性瘢痕的植物药理学精准机制研究和新型给药系统研制是未来的重点中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

增生性瘢痕差异表达基因及小分子药物预测的生物信息学分析与验证

Bioinformatics analysis and validation of differentially expressed genes and small molecule drug prediction in proliferative scar

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