激素性股骨头坏死中m6A相关基因差异性的鉴定

doi:10.12307/2024.329

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2159-2165.doi: 10.12307/2024.329

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激素性股骨头坏死中m6A相关基因差异性的鉴定

原天祎1，刘洪江1，杨增强 1，卢兴宝 1，麦麦提依不巴吉1，周治衡1，崔泳1，2

1新疆医科大学第五临床医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆医科大学第五附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011

收稿日期:2023-04-12 接受日期:2023-05-25 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 崔泳，主任医师，副教授，硕士生导师，新疆医科大学第五临床医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；新疆医科大学第五附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:原天祎，男，1996年生，河南省焦作市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事关节外科、骨组织工程方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81960396)，项目负责人：崔泳

Identification of differences in N6-methyladenosine-related genes in steroid-induced femoral head necrosis

Yuan Tianyi1, Liu Hongjiang1, Yang Zengqiang1, Lu Xingbao1, Maimaitiyibubaji1, Zhou Zhiheng1, Cui Yong1, 2

1The Fifth Clinical Medical College of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-04-12 Accepted:2023-05-25 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Cui Yong, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, The Fifth Clinical Medical College of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Department of Orthopedics, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yuan Tianyi, Master candidate, The Fifth Clinical Medical College of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960396 (to CY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

激素性股骨头坏死：病因常由于长期大剂量应用糖皮质激素，或短期大剂量使用肾上腺皮质类固醇激素导致股骨头坏死。激素性股骨头坏死为股骨头坏死的一种类型，其发病率逐年升高，由于发病机制复杂，早期治疗不及时致残率很高，严重影响患者的生活质量。
6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)：是真核生物mRNA和长非编码RNA上最普遍的一种RNA修饰，介导了超过80%RNA上碱基的甲基化。m6A主要影响 mRNA 的可变剪接、转运、翻译和降解等，以及某些非编码RNA的表观遗传效应。一旦m6A甲基化修饰出现异常，将会引起一系列疾病。

背景：已知m6A参与了多种疾病的发生与发展，研究推测其也参与了激素性股骨头坏死的病理改变，但m6A甲基化修饰在激素性股骨头坏死中的研究比较匮乏。

目的：通过生物信息学的方法寻找m6A相关基因在激素性股骨头坏死中的差异性表达，并预测与其相关的miRNA，以进一步阐明m6A甲基化在激素性股骨头坏死中所发挥的作用和机制。
方法：从GSE123568基因表达谱中分析激素性股骨头坏死与对照组差异基因的表达，通过R语言‘limma’包进行差异基因鉴定，并对差异基因进行功能富集分析。用R语言的‘ggstatsplot’包对相关基因进行差异性分析。通过GSE74089数据集对差异基因进行交叉验证。构建mRNA-miRNA调控网络。采用共表达分析对共表达模块进行聚类并对模块基因进行富集分析。采用ssGSEA方法对激素性股骨头坏死与对照组之间免疫细胞浸润的差异进行量化分析。

结果与结论：①通过相关性分析发现13个m6A相关基因，进行PPI网络识别和受试者操作特征曲线进一步分析发现YTHDF2有望成为早期生物标志物的核心差异基因；②富集分析发现差异基因主要参与炎症反应和免疫应答，并与破骨细胞关系密切；③交叉验证分析2个数据集差异基因表达结果一致；④mRNA-miRNA调控网络分析发现YTHDF2与miRNA-27a呈负相关；⑤免疫浸润分析发现激素性股骨头坏死中免疫细胞浸润水平上升，YTHDF2与免疫细胞CD4+T细胞的浸润程度呈正相关；⑥结论：m6A相关基因YTHDF2可以作为激素性股骨头坏死潜在生物标志物，对激素性股骨头坏死的早期临床诊断和治疗具有一定的价值；验证了YTHDF2与miRNA-27a呈负相关，且与CD4+T细胞的浸润程度呈正相关，为激素性股骨头坏死的早期诊断和治疗提供新的思路，并为进一步阐明m6A在激素性股骨头坏死中发挥的作用机制提出新的见解。

http://orcid.org/0009-0007-7101-2411(原天祎)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: m6A甲基化, 激素性股骨头坏死, 生信分析, 差异基因, YTHDF2, 富集分析

Abstract: BACKGROUND: It is known that N6-methyladenosine (m6A) plays a role in the pathogenesis of various diseases and studies have suggested its involvement in the pathologic changes of steroid-induced femoral head necrosis (SNFH). However, research on m6A methylation modifications in steroid-induced femoral head necrosis is limited.
OBJECTIVE: Using bioinformatics methods to identify the differential expression of m6A-related genes in steroid-induced femoral head necrosis and to predict miRNAs associated with these genes to further elucidate the role and mechanism of m6A methylation in steroid-induced femoral head necrosis.
METHODS: Differential gene expression between steroid-induced femoral head necrosis and control groups was analyzed using GSE123568 gene expression data and identified using the “limma” package in R. Functional enrichment analysis was performed on the differentially expressed genes. Differential analysis of the related genes was carried out using the “ggstatsplot” package in R. The differential genes were cross-validated using the GSE74089 dataset. An mRNA-miRNA regulatory network was constructed, and co-expression analysis was performed on the module genes followed by enrichment analysis. Differences in immune cell infiltration between steroid-induced femoral head necrosis and control groups were quantified using the ssGSEA method.
RESULTS AND CONCLUSION: Correlation analysis revealed 13 m6A-related genes, and further analysis through the protein-protein interaction network identification and receiver operating characteristic curve analysis showed that YTHDF2 was expected to be a core differential gene as a potential early biomarker. Enrichment analysis indicated that differentially expressed genes were mainly involved in inflammation and immune response and were closely related to osteoclasts. Cross-validation analysis showed that differential gene expression results between the two datasets were consistent. mRNA-miRNA regulatory network analysis revealed that YTHDF2 was negatively correlated with miRNA-27a. Immune infiltration analysis revealed an increase in immune cell infiltration in steroid-induced femoral head necrosis, and YTHDF2 was positively correlated with the infiltration of CD4+T cells. To conclude, m6A-related gene YTHDF2 can serve as a potential biomarker of steroid-induced femoral head necrosis and is valuable for the early clinical diagnosis and treatment of steroid-induced femoral head necrosis. The negative correlation between YTHDF2 and mir-27a and the positive correlation between YTHDF2 and CD4+T cell infiltration provide new insights into the early diagnosis and treatment of steroid-induced femoral head necrosis and shed light on the mechanism of m6A in steroid-induced femoral head necrosis.

Key words: m6A methylation, steroid-induced femoral head necrosis, bioinformatics analysis, differential gene, , YTHDF2, enrichment analysis

中图分类号:

原天祎, 刘洪江, 杨增强 , 卢兴宝 , 麦麦提依不巴吉, 周治衡, 崔泳. 激素性股骨头坏死中m6A相关基因差异性的鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2159-2165.

Yuan Tianyi, Liu Hongjiang, Yang Zengqiang, Lu Xingbao, Maimaitiyibubaji, Zhou Zhiheng, Cui Yong. Identification of differences in N6-methyladenosine-related genes in steroid-induced femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2159-2165.

图/表（结果） 9

2.1 激素性股骨头坏死的差异基因对GSE123568数据库进行差异分析，以log2FC > 1 P < 0.05为标准筛选差异基因，并将差异基因进行热图和火山图进行可视化分析，见图1。通过R软件在转录组中分析提取了m6A相关调控因子METTL3，METTL14，WTAP，KIA1429，ZC3H13，FTO，ALKBH5，YTHDC2， IGF2BP2，IGF2BP3，YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，ELAVL1，CBLL1，HNRNPA2B1，FMR1及LRPPRL等。

2.2 富集分析结果对鉴定的差异基因进行富集分析发现，激素性股骨头坏死炎症反应、细胞因子受体、细胞-基质黏附等生物功能上调，见图2A[19]。KEGG富集分析结果表明差异基因主要参与了破骨细胞、磷酸蛋白酶介导的蛋白质去磷酸化[20]、炎症因子的趋化等生物功能，见图2B。通过GSVA分析前30 个通路发现，6 个信号通路上调，24 个通路下调。其中TLR通路下调明显[21]，见图3。

2.3 m6A相关调控因子在GSE123568数据集和GSE74089数据集中差异表达分析结果将m6A调控因子在GSE123568数据集中激素股骨头坏死和非激素股骨头坏死表达分析发现，其中METTL3、IGF2BP3、WTAP、CBLL1、KIA1429、HNRNPA2B1、FMR1、YTHDF2、ALKBH5、YTHDF1表达差异(P < 0.05)，YTHDF3、YTHDC2、IGF2BP2表达差异(P < 0.01)；IGF2BP3、IGF2BP2、ALKBH5在激素股骨头坏死组中为下调性表达，YTHDF3、YTHDC2、METTL3、WTAP、CBLL1、KIA1429、HNRNPA2B1、FMR1、YTHDF2、YTHDF1在激素股骨头坏死组中为上调性表达，见图4A。m6A调控因子在GSE74089数据集股骨头坏死组与对照组软骨组织中表达分析发现，YTHDF2在股骨头坏死组中为高表达，并且差异有显著性意义(P < 0.05)，图4B。将m6A调控因子在GSE123568数据集进行受试者工作特征曲线分析发现，其中YTHDF3、YTHDC2、IGF2BP3、CBLL1、KIA1429、IGF2BP2、HNRNPA2B1、YTHDF2中的受试者工作特征AUC均> 0.75，因此认为其可以作为激素性股骨头坏死的生物标志物，见图5。

2.4 相关性分析结果将激素性股骨头坏死中m6A相关差异基因进行 Spearman 相关性分析发现上述基因具有一定的相关性，其中YTHDF1和YTHDF2的正相关性最高为Cor=0.905 2，YTHDF2和IGF2BP2之间的负相关性最高为Cor=-0.786 5，见图6A。将m6A相关基因映射到蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络中以识别关键基因，链接度排名前5的基因为YTHDF1、ALKBH5、FTO、YTHDF2、LRPPRC，见图6B。

2.5 m6A相关差异基因关联的miRNA的预测结果为了鉴定激素性股骨头坏死的分子调控机制，对调控差异表达基因的miRNA进行预测，构建mRNA-miRNA调控网络通过分析发现54 个miRNA对m6A甲基化相关基因有相互作用的关系，见图7A。其中miRNA-27a与YTHDF2、IGF2BP2、IGF2BP3、WTAP成负相关，见图7B。

2.6 免疫浸润分析结果使用ssGSEA方法鉴定激素性股骨头坏死与对照组之间免疫细胞浸润的差异，激素性股骨头坏死与对照组之间的免疫细胞浸润水平不同，大多数免疫浸润细胞在激素性股骨头坏死中浸润水平较高，其中中央记忆CD4+T差异最为显著(P < 0.001)，见图8A，B。m6A调控因子与ssGSEA相关性分析发现其中YTHDF2与辅助型T细胞和中央记忆CD4+T相关性最强如图，见图9。

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引言

激素性股骨头坏死为临床上常见的一种非创伤性股骨头坏死类型，随着激素性药物的广泛应用激素性股骨头坏死的发病率逐年增加[1]。激素性股骨头坏死的发生可能与血管内凝血、脂代谢紊乱、基因多态性、细胞凋亡、细胞自噬等相关，但其确切发病机制尚不明确[2]。激素性股骨头坏死随着病情的进展若未进行有效的干预和治疗，往往导致股骨头塌陷甚至残疾，严重影响患者的生活质量[3]，因此对该疾病的预防和发病机制的研究就显得尤为重要且迫切。从表观遗传学角度和分子生物学角度来看，细胞凋亡及信号通路均参与了激素性股骨头坏死的发生[4]。已有研究证明激素性股骨头坏死相关的长非编码 RNA(lncRNA)与骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化有关[5]。ZHANG等[6]通过构建动物模型验证了miRNA-135b可以通过抑制PDCD4的表达来增强人诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞的作用，对激素性股骨头坏死产生积极的影响。miR-4523可以通过激活Nrf2信号通路沉默PGK1来保护激素性股骨头坏死患者的成骨细胞[7]。通过动物实验和相关临床试验，证实了微小RNA(microRNA，miRNA)参与了激素性股骨头坏死的发生与发展，并且有望成为激素性股骨头坏死的生物标记物和治疗靶点[8]。
N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)为RNA 腺苷酸 6 位上氮原子甲基化，是广泛存在的一种表观遗传修饰，多项研究证实这种影响RNA分子的表观遗传修饰是可逆的[9-10]。据现阶段研究证明m6A甲基化修饰过程主要由m6A转移酶调控，其中包括METTL3、METTL14、WTAP、RBM15、VIRMA、ZC3H13、METTL5、ZCCHC4和METTL16等；去甲基化主要由FTO、ALKBH5酶激化。其中m6A结合蛋白YTHDF1/2/3和YTHDC1/2，通过识别特异性结合位点来执行各种细胞功能，如RNA的稳定性、翻译和转录[9]。分析发现m6A可以与相关miRNA共同作用来决定细胞分化和细胞命运[11]。METTL3介导的m6A 甲基化修饰通过不同的途径促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，起到抑制骨质疏松疾病进展的作用[12]。有实验证明了METTL14通过调节PTPN6的m6A水平，使激素相关性股骨头坏死患者的间充质干细胞获益[13]。但目前有关m6A甲基化在激素性股骨头坏死的研究仍比较匮乏。
此次研究通过高通量数据和微阵列的方法分析鉴定激素性股骨头坏死中m6A甲基化调控因子的差异性[14]。通过分析国家生物技术信息中心基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中激素性股骨头坏死与对照组的基因表达谱以了解分子变化及生物学机制。通过受试者工作特征曲线下面积(aera under curve，AUC)将m6A调控因子在激素性股骨头坏死中进行识别，并找到与其相关的miRNA。目的是通过生物信息学分析手段寻找激素性股骨头坏死中调控m6A甲基化相关的关键基因，并通过不同数据集进行交叉验证，以进一步阐明m6A甲基化在激素性股骨头坏死中所发挥的作用和机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学分析。
1.2 时间及地点生物信息分析于2022年12月至2023年4月在新疆医科大学第五附属医院完成。
1.3 数据收集与处理从GEO数据库分别下载GSE123568数据集和GSE74089数据集，其中GSE123568数据集中包含30 例激素性股骨头坏死和10 例非激素性股骨头坏死(对照组)患者的血清样本。激素性股骨头坏血清样本中男性13 例，女性17 例；ARCO分期Ⅰ-Ⅱ期10 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期10 例；平均年龄为(23.07±3.01) 岁。非激素性股骨头坏死血清样本中男性7 例，女性3 例；平均年龄(25.02±2.87)岁。GSE74089数据集中包含 4 例股骨头坏死患者软骨样本和4 例健康对照的髋关节软骨样本。基因通过R语言‘limma’包进行分析鉴定[15]，筛选log2FC > 1，P < 0.05的基因为差异基因。根据既往对m6A研究的成果及相关文献，从TCGA数据库中提取了18 个m6A相关基因的表达矩阵[16-17]。
1.4 方法
1.4.1 差异表达分析用R语言的‘ggstatsplot’包对m6A相关调节因子在GSE123568数据集和GSE74089数据集中的差异表达进行分析。并通过‘pROC’R包绘制ROC曲线分析m6A调节因子，临床判断激素性股骨头坏死与非激素性股骨头坏死的可靠性。
1.4.2 相关性分析使用starbase，miRDB，miRTarbase数据库建立mRNA-miRNA调控网络预测靶向调控M6A调控因子的miRNA，并取交集。m6A调控分子间的相关性使用R语言‘corrplot’包进行分析，其结果*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001为有不同程度的统计学意义。
1.4.3 生物功能富集分析使用Enrichr在线富集分析工具[18]，将从GSE123568数据分析获得的差异基因进行生物学富集通路分析(GO/KEGG富集分析)(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigbd)，设置筛选的阈值为P < 0.05。用R语言‘GSVA’包进行基因集变异分析(gene set variation analysis，GSVA)，在激素性股骨头坏死和对照组中确定基因集的富集程度。
1.4.4 单样本基因富集分析(single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA) 将激素性股骨头坏死和对照组进行单样本富集基因和免疫细胞浸润相对丰度分析，用R语言‘clusterprofiler’包进行，分析参数采用默认数值；对激素股骨头坏死和非激素股骨头坏死进行富集通路差异性分析，其结果通过R语言‘GSEA’包来实现。
1.5 主要观察指标 ①激素性股骨头坏死的差异基因；②富集分析结果；③m6A相关调控因子在激素性股骨头坏死与对照组中差异表达分析结果；④相关性分析结果；⑤m6A相关差异基因关联的miRNA的预测结果；⑥免疫浸润分析结果。
1.6 统计学分析通过‘limma’包对数据集之间的差异基因进行统计学分析；使用R语言的‘ggstatsplot’对m6A调控因子在数据集中的差异性进行统计学分析；使用‘corrplot’包对m6A调控因子之间的差异性进行统计学分析。数据均通过R语言(4.2.1版本)进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经新疆医科大学第五附属医院生物统计学专家审核。

讨论

激素性股骨头坏死是临床上一种常见的难治性疾病，过度使用激素为其主要诱因。随着人们生活水平的提高、人口老龄化加剧和激素性药物的广泛使用，股骨头坏死的发病率逐年增高[22]。激素性股骨头坏死患者存在软骨下微循环、内皮功能障碍和骨修复缺陷等病理改变，随着病情的发展易进展为股骨头塌陷，而目前治疗塌陷性股骨头坏死的方法通常不令人满意[23]。而对激素性股骨头坏死的早期诊断如今主要来源于影像学对股骨头的血供进行检测以预测激素性股骨头坏死的风险，但激素性股骨头坏死早期病理变化较为轻微，易漏诊，临床确诊时往往已错过最佳治疗时间[24]。因此如何能早期发现并提早干预成为治疗激素性股骨头坏死的关键因素之一。为解决这一难题，越来越多的学者提出从表观遗传学方面对激素性股骨头坏死进行预防并为其治疗提供新的思路[25]。因此挖掘激素性股骨头坏死早期诊断的生物学标志物具有很重要的理论和实际意义。
自从Victor Ambros 及团队于1993年在秀丽隐杆线虫中发现第一个miRNA(lin4)，miRNA就成了人们在各个领域和疾病中的研究热点话题[26]。在激素性股骨头坏死疾病的研究中已经有大量实验证明多种miRNA在激素性股骨头坏死中差异性表达，并在疾病的发生发展中发挥了重要作用[5，27]。激素性股骨头坏死的发生和发展过程中通常与多种病理生理改变有关，如血管内血栓形成、异常脂质代谢、软骨细胞肥大和骨质疏松等。XU等[28]通过研究发现miRNA-145在激素性股骨头坏死患者中高表达，并通过抑制GABA型受体相关蛋白样1进一步抑制骨髓间充质干细胞增殖分化。有研究表明miR-30b-5p通过调节Runx2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13和Col10a1的表达，从而介导激素性股骨头坏死过程中软骨细胞的肥厚分化和凋亡[29]。已知m6A RNA甲基化参与了RNA的生命周期的所有阶段，包括pre-mRNA剪接、pri-miRNA加工、核输出、RNA降解和RNA翻译调节[30-31]。并且m6A甲基化已经被证实广泛参与了多种疾病的发生与发展，研究表明m6A甲基化通过调节细胞过程，如分化、增殖、炎症、自噬和凋亡，影响心血管疾病的发生与发展[32]，而激素性股骨头坏死发生发展过程中软骨下微循环障碍是其不可忽略的病理生理。在骨相关疾病中、m6A相关调控因子通过免疫调节通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路参与调节骨质疏松的发生与发展[33]。因此此次实验通过生物信息学方法进行m6A在激素性股骨头坏死中的核心基因进行挖掘，并且通过miRNA数据库进行相关miRNA的靶向预测，进一步通过调控网络识别具有差异性的核心基因和miRNA，旨在寻找激素性股骨头坏死的生物标志物和治疗靶点，并为激素性股骨头坏死的临床治疗提供新的思路。
基于GSE123568数据集和starbase，miRDB，miRTarbase数据库，将m6A调控因子进行映射并靶向预测核心基因及其相关miRNA。通过相关性P < 0.05、AUC > 0.75、核心基因构建PPI网络等方法筛选发现了YTHDF2在激素性股骨头坏死中最具有研究和讨论价值。已知YTHDF2是一个调控因子，在m6A甲基化过程中发挥特异性结合位点的作用[9]。并且YTHDF2已经被证实参与多种疾病的发生与发展，其中有研究发现YTHDF2的过表达与恶性胶质细胞瘤的预后密切相关[34]，在骨质疏松症中YTHDF2可能参与多种信号通路对骨质疏松进行调控[33]。前期研究成果证实miRNA-27a通过调节RUNX2、PPAR-γ和ApoA5的表达进一步使成脂分化减弱，成骨分化增强，从而延缓、逆转股骨头坏死的病理进程，改善坏死骨头内环境和供血[35]。而此次数据挖掘差异分析发现YTHDF2在激素性股骨头坏死中呈高表达，mRNA-miRNAt调控网络相关性结果为YTHDF2与miRNA-27a成负相关，这与之前的研究miRNA-27a能改善激素性股骨头坏死微环境的结果相互证实。
为进一步阐明差异基因的潜在分子机制，通过GO/KEGG富集分析发现激素性股骨头坏死炎症反应与免疫应答显著上调，破骨细胞活性增强。已有研究证实炎症反应在激素性股骨头坏死中发挥了重要作用，并且通过PDK1/AKT/mTOR信号通路来发挥其生物功能[2]。m6A也通过影响成骨细胞和软骨细胞的炎症表达水平，从而发挥对骨关节炎的调控作用，具体机制为 METTL3 敲低能通过 YTHDF2 阻碍炎症条件下SMAD依赖性信号传导，从而抑制成骨分化，最终导致骨关节炎疾病的进展。激素性股骨头坏死中破骨细胞活性的增强可能导致代谢重编程和骨重塑失衡[36]，并且在骨相关疾病中破骨细胞还可作为骨质疏松症的治疗靶点[37]。相关研究表明活性氧、破骨细胞的上调表达和过度激活在激素性股骨头坏死的发生发展中发挥了重要作用[38]。免疫浸润分析发现激素性股骨头坏死中免疫细胞浸润水平明显上升，并且通过相关性分析发现YTHDF2与CD4+T细胞的浸润程度关系密切。由此可知，YTHDF2在激素性股骨头坏死中可能通过炎症反应，免疫反应和破骨细胞活性等生物功能来对激素性股骨头坏死的发生发展进行调控。
为验证实验结果的准确性，将m6A调控因子映射到数据集GSE74089进行差异分析，将其结果对GSE123568数据集差异结果进行交叉验证。GSE74089数据集的标本来源于患者的软骨组织，而激素性股骨头坏死的发生发展起初病变于血管或骨质变化，中后期病变于软骨组织，因此选用该数据集作为交叉对照不但可以增加差异基因的局部特异性，而且能够识别出激素性股骨头坏死发展过程中的潜在生物标志物[39]。GSE74089数据集差异分析结果为YTHDF2在激素股骨头坏死组高表达并且与对照组之间的差异性P < 0.05，与GSE123568数据集分析的结果一致。
虽然此次研究通过不同数据集对实验结果进行交叉验证，但仍存在一定的局限性，高通量数据库中激素性股骨头坏死相关数据比较匮乏，样本量较小。并且实验只通过生物信息学分析方法来预测，因此还需要进一步验证YTHDF2是否在激素性股骨头坏死中具有差异性，并且通过抑制/过表达YTHDF2来验证其与miRNA-27a之间的关系和对激素性股骨头坏死的影响。后续将进行体外实验对其结果进一步的验证。
结论：此次实验通过生物信息学分析发现激素性股骨头坏死中炎症反应、免疫应答显著上调，破骨细胞活性上调。通过构建PPI调控网络和受试者工作特征曲线筛选出了m6A相关调控因子YTHDF2为核心差异基因，其有望成为激素性股骨头坏死早期生物标志物。mRNA-miRNA调控网络和相关性分析发现YTHDF2与miRNA-27a成负相关，与CD4+T细胞的浸润程度成正相关，证明了YTHDF2可能与miRNA-27a相互作用并参与了激素性股骨头坏死免疫细胞浸润的病理过程。该结果为激素性股骨头坏死的早期诊断和治疗提供了新的思路，并为进一步阐明m6A在激素性股骨头坏死中发挥的作用机制提出新的见解。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

激素性股骨头坏死中m6A相关基因差异性的鉴定

Identification of differences in N6-methyladenosine-related genes in steroid-induced femoral head necrosis

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