CA9作为激素性股骨头坏死中软骨铁死亡特征基因的生物信息学鉴定

doi:10.12307/2024.520

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4293-4299.doi: 10.12307/2024.520

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CA9作为激素性股骨头坏死中软骨铁死亡特征基因的生物信息学鉴定

余鹏1，孟东方2，李慧英2，张向北1

1河南中医药大学骨伤学院，河南省郑州市 450002；2河南中医药大学第一附属医院骨伤科，河南省郑州市 450002

收稿日期:2023-09-18 接受日期:2023-10-28 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-26
通讯作者: 李慧英，博士，教授，主任医师，博士生导师，河南中医药大学第一附属医院骨伤科，河南省郑州市 450002
作者简介:余鹏，男，1992年生，河南省南阳市人，汉族，河南中医药大学在读博士，主要从事中医药防治骨关节及脊柱疾病的研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项(2021JDZY009，2023ZY2029)，项目负责人：李慧英；河南省中医药科学研究专项(2022JDZX123)，项目负责人：孟东方；河南中医药大学2022年度研究生科研创新类项目(2022KYCX084)，项目负责人：余鹏

Bioinformatics identification of CA9 as a signature gene for cartilage-associated ferroptosis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

Yu Peng1, Meng Dongfang2, Li Huiying2, Zhang Xiangbei1

1Osteopathy School of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China; 2Department of Orthopedics and Traumatology, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China

Received:2023-09-18 Accepted:2023-10-28 Online:2024-09-28 Published:2024-01-26
Contact: Li Huiying, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics and Traumatology, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China
About author:Yu Peng, MD candidate, Osteopathy School of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China
Supported by:
Henan Province Chinese Medicine Scientific Research Special Projects, Nos. 2021JDZY009 (to LHY), 2023ZY2029 (to LHY), and 2022JDZX123 (to MDF); 2022 Graduate Student Scientific Research and Innovation Program of Henan University of Chinese Medicine, No. 2022KYCX084 (to YP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

铁死亡：铁死亡区别于凋亡形成的细胞死亡调节模式，主要因铁离子过载和脂质过氧化导致细胞死亡。
激素性股骨头坏死：长期或者大剂量使用类固醇激素，导致股骨头周围和头内血供受损，骨吸收与骨形成的平衡被打破，软骨发生变性和形变，股骨头内结构失稳，最终出现骨坏死。

背景：激素性股骨头坏死中骨代谢的紊乱与铁死亡密切相关，同时激素性股骨头坏死的病理过程中伴随着软骨的损伤与退变。但关于铁死亡与软骨之间的关系和具体调控靶点尚不明确。

目的：运用生物信息学和机器学习方法筛选靶向软骨的铁死亡特征基因，探究铁死亡与软骨之间的关系，为研究和治疗激素性股骨头坏死提供新的思路与方法。
方法：通过GEO数据库和FerrDb数据库下载相关疾病数据集和铁死亡相关基因，采用R语言对疾病数据集进行归一化处理和差异分析，筛选出铁死亡相关差异基因。对铁死亡相关差异基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，同时根据铁死亡相关差异基因的PPI网络和机器学习方法筛选铁死亡特征基因。最后，将兔子分为正常组和模型组，正常组给予相同剂量的生理盐水模拟造模药物，模型组采用改良马血清联合注射用甲泼尼龙构建兔激素性股骨头坏死模型，造模成功后，验证不同组别间特征基因的表达，分析软骨中铁死亡的表型。

结果与结论：①通过对数据集的归一化处理和差异分析，最终获得1 315个差异表达基因，通过FerrDb数据库获取379个铁死亡相关基因。二者取交集后，最终获得19个铁死亡差异表达基因。②GO分析铁死亡相关差异基因主要涉及细胞迁移和细胞对氧化应激反应等生物过程；涉及激酶复合物、氨基酸复合体和细胞质膜等细胞组分；涉及激酶活性、受体活性和蛋白结合等分子功能。KEGG分析铁死亡相关差异基因主要在FoxO信号通路、血管内皮生长因子信号通路和FcγR介导的吞噬作用中富集。③通过PPI网络和机器学习筛选出铁死亡特征基因CA9。④特征基因的GSEA分析发现，CA9在脂肪酸代谢、O-GlcNAc糖基化修饰等生物过程中上调表达，而在神经活性配体受体相互作用方面被抑制。⑤RT-PCR和Western blot检测结果显示，与正常组对比，模型组中的ACSL4，CA9 mRNA和蛋白表达水平显著增高(P < 0.05)，SLC7A11和GPX4 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)，与数据集中特征基因的表达水平吻合。结果表明，激素性股骨头坏死的软骨与铁死亡密切相关，靶向特征基因CA9可以为研究和治疗激素性股骨头坏死提供一定的思路与方向。

https://orcid.org/0009-0005-3669-6358(余鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 软骨, 铁死亡, 生物信息学, 特征基因, 生物标志物, CA9, ACSL4, SLC7A11, GPX4

Abstract: BACKGROUND: Disturbances in bone metabolism have a significant association with ferroptosis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (SONFH). Furthermore, the pathologic process of SONFH is characterized by the presence of cartilage damage and degeneration. However, the specific regulatory targets and the relationship between ferroptosis and cartilage concerning SONFH remain unclear.
OBJECTIVE: To employ bioinformatics and machine learning techniques to identify specific genes associated with ferroptosis that target cartilage and to investigate the correlation between ferroptosis and cartilage, thereby providing novel ideas and methodologies for the study and treatment of SONFH.
METHODS: Disease datasets pertinent to the study and ferroptosis-related genes were retrieved from the GEO and FerrDb databases. Subsequently, the disease datasets were normalized and differential analysis using the R language to identify ferroptosis-related differential genes (Fe-DEGs). We conducted Gene Ontology (GO) functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) signaling pathway enrichment analysis of Fe-DEGs. Furthermore, ferroptosis-related signature genes were filtered based on the protein-protein interaction network of Fe-DEGs and machine learning methods. Finally, the rabbits were divided into normal and model groups. The normal group was given the same dose of saline to simulate the modeling drug, and the animal model of SONFH in rabbits was constructed by injection of modified horse serum combined with methylprednisolone. After successful modeling, the expression of signature gene was verified between different groups, and the phenotype of ferroptosis in cartilage was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Through the normalization and differential analysis of the dataset, a total of 1 315 differentially expressed genes were identified. Additionally, 379 ferroptosis-related genes were obtained from the FerrDb database. After intersecting both gene sets, 19 Fe-DEGs were obtained. The GO analysis revealed that Fe-DEGs were mainly involved in biological processes such as cell migration and cellular response to oxidative stress, cellular components such as kinase complexes, amino acid complexes, and cytoplasmic membranes, as well as molecular functions such as kinase activity, receptor activity, and protein binding. The KEGG analysis revealed that Fe-DEGs were mainly enriched in the FoxO signaling pathway, vascular endothelial growth factor signaling pathway, and FcγR-mediated phagocytosis. Constructing a protein-protein interaction network and using machine learning, we identified the ferroptosis-related signature gene, CA9. The gene set enrichment analysis of the signature gene CA9 revealed an upregulated expression in biological processes such as fatty acid metabolism and O-GlcNAc glycosylation modification, while being inhibited in terms of neural activity and ligand-receptor interactions. RT-PCR and western blot results showed that compared with the normal group, the expressions of ACSL4 and CA9 at mRNA and protein levels were significantly higher in the model group (P < 0.05), while the expressions of SLC7A11 and GPX4 at mRNA and protein levels were significantly lower in the model group (P < 0.05), coinciding with the expression levels of the signature genes in the dataset. These findings indicate that the cartilage of SONFH is closely related to ferroptosis, and targeting the signature gene may provide certain ideas and directions for the study and treatment of SONFH.

Key words: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, cartilage, ferroptosis, bioinformatics, signature gene, biomarker, CA9, ACSL4, SLC7A11, GPX4

中图分类号:

余鹏, 孟东方, 李慧英, 张向北. CA9作为激素性股骨头坏死中软骨铁死亡特征基因的生物信息学鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4293-4299.

Yu Peng, Meng Dongfang, Li Huiying, Zhang Xiangbei. Bioinformatics identification of CA9 as a signature gene for cartilage-associated ferroptosis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4293-4299.

图/表（结果） 11

2.1 生物信息学分析结果
2.1.1 筛选铁死亡差异表达基因从GSE74089数据集中共筛选出1 315个差异表达基因，其中808个上调表达基因，507个为下调表达基因，见图1A。从FerrDb数据库共获取379个已验证的铁死亡相关基因。二者取交集后，最终获得19个在GSE74089数据集差异表达的铁死亡基因，其中3个下调表达，16个上调表达，见图1B，C。随后对Fe-DEGs进行相关性分析，发现Fe-DEGs之间以正相关性为主，负相关性为辅，见图2。GO富集分析发现，Fe-DEGs在生物过程中主要参与细胞的迁移和细胞对氧化应激与化学应激的反应，见图3A；在细胞组分方面主要在激酶复合物、氨基酸复合体和细胞质膜方面富集；在分子功能中主要以激酶活性、受体活性和蛋白结合为主。KEGG富集分析发现，Fe-DEGs主要在FoxO信号通路、血管内皮生长因子信号通路和FcγR介导的吞噬作用中富集，涉及细胞代谢、增殖，血管新生、血管通透性及免疫炎症反应等，见图3B。

2.1.2 Fe-DEGs的蛋白互作网络通过cytoscape优化构建的Fe-DEGs蛋白互作网络，共包含14个节点，25条边，见图4A，表2。通过MCODE插件的模块化评估后，筛选出该网络中1个重要聚类功能模块，见图4B，主要涉及细胞对含氧化合物的反应功能；通过cytoHubba插件中的MCC算法，评估网络中节点的重要性与中心性，选取该网络中排名前10的为该网络的核心节点，分别为CDH1，PTGS2，EZH2，PRKCA，STK11，GJA1，KLF2，FBXW7，CA9和TGFBR1，见图4C，主要涉及血管内皮细胞迁移的调节、上皮细胞增殖的调节和细胞内蛋白转运等功能。

2.1.3 筛选铁死亡特征基因在LASSO分析中二项分布模型的偏差度(Binomial deviance)越小，则模型的拟合程度越好，通过glmnet函数分析，取二项分布模型的偏差度最小的4个基因为疾病特征基因，分别为HILPDA、H19、TGFBR1和CA9，见图5A。将蛋白互作网络中通过MCODE插件和cytoHubba插件中MCC算法各自筛选出的聚类模块基因和10个核心节点基因与LASSO分析获取的4个疾病特征基因取交集，通过Venn图进行展示，获得疾病特征基因CA9，见图5B。同时，统计了特征基因CA9在数据集中不同组别之间的表达量，并进行了统计学分析，与对照组相比，CA9的表达量在激素性股骨头坏死组明显增高(P < 0.05)，见图5C和表3，随后对特征基因进行ROC曲线分析，其AUC值为1.000，见图6A，表明筛选特征基因的准确性与可靠性。此外，基于特征基因构建预测模型，AUC值为1.000，95%CI：1.000?1.000，见图6B。说明特征基因对激素性股骨头坏死中软骨铁死亡有较高的诊断价值，有望成为激素性股骨头坏死软骨铁死亡相关的潜在生物标志物。

2.1.4 特征基因的富集分析结果对特征基因进行单基因富集分析，发现CA9总共富集到10个相关的生物学信号通路，其中在脂肪酸代谢、 O-GlcNAc糖基化修饰和剪切体等生物过程中上调表达，而在神经活性配体受体相互作用、嗅觉传导和味觉传导方面被抑制，见图7。

2.2 动物实验验证结果
2.2.1 苏木精-伊红染色观察病理切片变化正常组股骨头组织整体结构完整，有空骨陷窝存在，但数量较少且分布稀疏，骨小梁结构完好，无明显异常，与正常组对比，模型组股骨头组织中空骨陷窝明显增多且分布密集，骨细胞萎缩，明显减少，骨小梁结构出现紊乱，排列稀疏，见图8。

2.2.2 软骨中铁死亡表型和特征基因表达的验证结果实验通过检测动物模型软骨中ACSL4，SLC7A11和GPX4的表达，验证激素性股骨头坏死软骨中存在由脂质过氧化诱导的铁死亡发生。随后检测CA9的表达量，验证筛选特征基因的准确性与可靠性。通过RT-PCR和Western blot实验结果表明，动物模型中的ACSL4蛋白与mRNA表达量显著高于正常组(P < 0.05)，SLC7A11和GPX4蛋白与mRNA表达水平较正常组明显降低(P < 0.05)，表明了软骨中存在由脂质过氧化诱导的铁死亡发生；CA9蛋白与mRNA表达水平与正常组相比升高(P < 0.05)，表明实验筛选激素性股骨头坏死软骨中铁死亡特征基因的准确性和诊断价值，见图9。

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引言

股骨头坏死因各种因素导致股骨头周围动静脉血管堵塞和损伤导致股骨头内血供减少或中断，引起股骨头内结构力学改变，最终导致股骨头塌陷和髋关节炎的发生[1]。激素作为非创伤性股骨头坏死的主要诱因之一，患病率最高可达约40% [2]，且患病风险与激素服用剂量大小和时间长短呈正相关性。关于激素性股骨头坏死的发病机制存在多种学说，如脂质代谢紊乱、血管凝血障碍、细胞凋亡和自噬以及基因遗传学等[3-4]。而各种病理机制学说最终均可导致股骨头周围及头内的血供受损，缺血缺氧情况的发生使营养物质无法正常输送到受影响的骨骼附近，诱发骨坏死[5]。
目前，对于激素性股骨头坏死的研究主要集中在血管内皮细胞、成骨细胞和破骨细胞方面，针对软骨细胞的研究较少。通过构建激素干预动物和软骨细胞的股骨头坏死模型，发现激素可以促进软骨细胞的异常增殖与肥大，抑制软骨细胞生成，加速软骨细胞退化[6-7]。同时，研究表明，在国际骨微循环研究协会(association research circulation osseous，ARCO)分期Ⅱ-Ⅲ期的股骨头坏死患者中，促进软骨细胞降解和破坏的血小板反应蛋白解整合素金属肽酶7因子显著高表达，表明股骨头坏死的病理过程中伴随着软骨退变[8]。在股骨头坏死的病理过程中，由于缺血缺氧的出现，软骨的营养和代谢受到影响，导致软骨功能减退，软骨退化会使关节面的光滑度下降，增加关节的摩擦，进一步加速股骨头的塌陷与骨性关节炎的发生[9]。软骨和软骨下骨是紧密连接的，软骨下骨为软骨提供了结构支持和血液供应，血供不足，可能导致软骨下骨的结构改变和功能损伤，影响软骨的正常功能[10]。此外，激素导致软骨细胞的异常代谢紊乱，与软骨下骨坏死和骨折及软骨下皮质骨损伤密切相关[6]。因此软骨和软骨细胞在激素性股骨头坏死的病理过程中同样扮演着重要的角色。
铁死亡作为一种特定的细胞死亡形式，与细胞凋亡、自噬和坏死有着明显的区别。地塞米松通过铁死亡相关通路P53/SLC7A11/GPX4轴诱导股骨头坏死的发生[11]。研究表明，褪黑素可以降低激素性股骨头坏死中活性氧的表达，上调生长分化因子15的表达，激活SLC7A11/GSH/GPX4信号轴，抑制氧化应激反应和铁死亡的发生，从而预防和治疗激素性股骨头坏死[12]。因此，铁死亡与激素性股骨头坏死密切相关，激素诱导铁死亡可以加速股骨头坏死的发生发展[13-14]。目前，激素性股骨头坏死的铁死亡研究主要集中在骨代谢方面，软骨细胞铁死亡的研究主要集中在骨性关节炎方面，两者均取得一定的的进展，但尚未有针对股骨头坏死中软骨铁死亡的研究。
实验基于生物信息学和实验验证，筛选激素性股骨头坏死中软骨相关铁死亡差异表达基因的表达，探究股骨头坏死软骨是否与铁死亡相关，并验证铁死亡差异基因的表达，为探究其发病机制和靶向治疗激素性股骨头坏死提供一定方向与思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学分析，动物体内实验结果验证，两样本t检验。
1.2 时间及地点于2022年6月至2023年6月在河南中医药大学动物实验中心完成。
1.3 资料
1.3.1 数据来源通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以“人类、股骨头坏死、软骨”为筛选条件，进行检索，最终获取GSE74089数据集，该数据集基于GPL13497平台进行检测，共包含4个正常软骨样本和4个股骨头坏死软骨样本。通过FerrDb数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb/current/)，下载铁死亡相关的数据集，包括driver，maker和suppressor数据集，以confidence：Validated为筛选标准，筛选铁死亡相关基因，随后将3个数据集取交集，最终获取铁死亡相关基因。
1.3.2 实验动物健康三四月龄的清洁级雄性日本大耳白兔20只，体质量为2.5-3.0 kg，购买于河南省春盈生物技术有限公司，许可证号为SCXK(豫)2021-0002。动物饲养于河南中医药大学动物实验中心，清洁级环境，单笼喂养，饲料与饮用水均有动物中心提供。实验已获河南中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准号：DWLL202201007，批准时间：2022年1月。
1.4 实验方法
1.4.1 筛选铁死亡差异基因与富集分析通过R软件包“impute”中impute.knn函数和“limma”包中normalize Between Arrays函数对GSE74089数据集进行归一化处理，通过“limma”包中lmFit函数对数据集进行拟合线性模型，基于拟合线性模型，通过eBayes函数进行贝叶斯统计分析，筛选对不同样本之间的差异基因，以|logFC| > 2且P < 0.05为筛选条件，获取GSE74089数据集的差异表达基因。随后，将差异表达基因与铁死亡相关基因取交集，最终获取股骨头坏死中的铁死亡差异表达基因(ferrptosis differentially expressed genes，Fe-DEGs)。此外对Fe-DEGs进行相关性分析，运用Spearman相关性分析方法，观察它们之间的相关性。对Fe-DEGs进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析。
1.4.2 蛋白与蛋白互作网络将差异基因映射到STRNG数据库(https://string-db.org/)，筛选条件为minimum required interaction score：0.4，剔除网络中未连接的节点，构建蛋白与蛋白互作(Protein-Protein Interaction，PPI)网络。随后，下载蛋白互作网络信息，利用cytospace软件(3.10.0)将该网络进行优化。MCODE(Molecular Complex Detection)插件是根据节点周围连接数和所有节点平均连接数计算网络中每个节点评分，根据节点评分选择相关节点进行扩展，形成聚类。通过MCODE插件对PPI网络进行聚类分析，设置参数：节点度数阈值≥2，haircut≥0.2，节点score阈值≥0.2，K-core≥2，最大深度(Max. Depth)=100，筛选网络中重要的功能聚类模块；cytoHubba插件提供多种节点的中心性算法计算每个节点中心性指标，实验基于cytoHubba插件中最大集团中心性(MCC)算法评估PPI网络中节点的重要性和中心性，识别网络中关键节点。
1.4.3 铁死亡特征基因的筛选与疾病预测模型的构建最小绝对收缩和选取算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)分析方法因具有处理高维数据和模型优化的能力，被广泛应用于数据挖掘中[15]。实验通过LASSO分析方法，利用R语言中glmnet函数，创建正则化参数序列(λ值)，对于每个正则化参数值进行交叉循环验证，k=10，根据交叉验证的结果，选择交叉验证误差最小的正则化参数作为最优参数，拟合LASSO模型，筛选出疾病特征基因。随后将MCODE插件和MCC算法分别获得功能模块和关键网络节点与LASSO分析获取的特征基因取交集，获取最终的铁死亡特征基因。统计特征基因在数据集中不同组别之间的表达量并对其进行差异分析，观察其表达在不同组别之间差异是否有显著性意义。通过接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)评估筛选铁死亡特征基因的重要性，并基于特征基因构建疾病预测模型，评估特征基因对疾病的诊断价值。
1.4.4 基因集富集分析实验通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis，Single-gene GSEA)对特征基因的功能和生物学过程进行探讨。根据特征基因的表达水平的中位数，将其分为高表达组与低表达组，以KEGG信号通路基因为预设基因集，对其进行基因集富集分析，探究特征基因在数据集中的功能和生物学过程。
1.4.5 实验动物分组、造模和取材将20只日本大耳白兔随机分为正常组和模型组，每组10只。适应性观察1周，参照课题组前期研究选用的马血清联合甲泼尼龙注射的方法构建激素性股骨头坏死模型[13]。兔耳缘静脉注射马血清(10 mL/kg)，间隔3周后，再经兔耳缘静脉注射马血清(6 mL/kg)；间隔2周后，腹腔注射甲泼尼龙(45 mg/kg)，连续3 d，同时腹腔注射青霉素10万单位，连续 7 d，预防感染。造模结束后进行股骨头病理切片观察，模型成功标准为出现空骨陷窝数量增加、骨小梁稀疏及脂肪细胞堆积[14]。造模成功后，采用耳缘静脉注射戊巴比妥钠(35 mg/kg)的方法对兔进行麻醉。然后，将麻醉后的兔侧放在手术操作台上，备皮，消毒，取出双侧股骨头，将一部分股骨头保存于组织细胞固定液中，另外一部分放入液氮中暂存，随后放入-80 ℃冰箱，备用检测。
1.4.6 苏木精-伊红染色造模结束后，每组取3只兔股骨头，固定液固定24 h，随后放入脱钙液中脱钙，脱钙21 d。脱钙成功后，对标本进行脱水、石蜡包埋、切片、烘烤、进行苏木精-伊红染色，最后用中性胶固定，在光学显微镜下观察组织形态。

1.4.7 实时荧光定量RT-PCR检测各组特征基因和铁死亡相关蛋白mRNA表达选取兔部分股骨头，用无菌刀片将软骨刮下，随后切成小片，加入磁珠，放入研磨匀浆仪中进行研磨。研磨完成后，采用TRLzol法提取总RNA。根据Surescript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，反应条件为37 ℃，60 min，85 ℃，5 min。引物由华大基因合成，详见表1。使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0试剂盒进行PCR扩增，以β-actin为内参，反应条件为变性：95 ℃，10 s；退火：60 ℃，20 s；延伸：72 ℃，15 s；进行40个循环。最后，采用2-ΔΔCt法计算相关mNA表达量，通过Graphpad软件对数据行进统计分析。

1.4.8 Western Blot检测兔特征基因和铁死亡相关蛋白表达选取部分股骨头，PBS清洗后，用无菌刀片将软骨刮下，随后切成小片，加入磁珠和RIPA裂解液(包含蛋白酶抑制剂)提取总蛋白，将其放入研磨匀浆仪中进行研磨。研磨完成后，在冰上裂解30 min，随后离心10 min(4 ℃，13 000×g)，收集上清液，使用BCA法检测样品蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)胶电泳分离蛋白，将其转到PVDF膜上，封闭液室温下封闭1 h。加入一抗∶兔抗兔多克隆抗体GAPDH(1∶6 000，美国proteintech公司)，兔抗多克隆抗体CA9(1∶2 000，美国Affinity公司)，兔抗多克隆抗体ACSL4(1∶2 000，美国Affinity公司)，兔抗多克隆抗体SLC7A11(1∶5 000，美国Affinity公司)，兔抗单克隆抗体GPX4(1∶5 000，英国abcam公司)，在4 ℃下孵育过夜。加入二抗：山羊抗兔IgG (1∶5 000，美国Searcare公司)，室温孵育。采用化学发光法，对胶片条带进行显影和定影，GAPDH作为内参，利用Image J软件处理系统分析目标带的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值作为目标蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①软骨铁死亡差异表达基因筛选结果；②兔股骨头组织切片的苏木精-伊红染色观察；③特征基因在不同组别之间的表达；④激素性股骨头坏死中软骨铁死亡表型。
1.6 统计学分析数据采用x±s表示，采用R语言(4.3.1)软件进行统计学分析，两组间数据比较采用两样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。利用GraphPad Prism 9软件对软骨组织相关蛋白mRNA表达水平和蛋白水平进行作图分析。文章采用的统计学方法已通过河南中医药大学统计学专家审核。

讨论

激素性股骨头坏死因发病的隐匿性，发病机制的复杂性和病情进展的迅速性导致对该病早期诊断造成了一定困扰；同时因其预后差和致残率高的特点，该病的阶段化治疗一直是骨科领域关注的重点与难点[16-17]。软骨组织的弹性和机械强度是构成股骨头生物力学的重要组成部分[18]。类固醇激素的应用可以导致软骨厚度变薄、弹性和机械强度的降低[19-20]。同时，长期使用地塞米松会加重关节软骨中蛋白聚糖的损伤，加速软骨的变性，并导致软骨下骨骨密度的降低，增加骨折风险，容易诱发股骨头塌陷[21]。因此，研究软骨在激素性股骨头坏死的病理变化具有重要意义。此外，铁死亡的发生与细胞内铁离子的稳态和脂质过氧化密切相关[22-23]。研究表明，癌症、缺血性疾病、神经退行性病变、炎症和感染等疾病均出现了铁死亡的病理现象[24-26]，而激素性股骨头坏死属于缺血性疾病的范畴。同时，激素可以显著降低谷胱甘肽水平，导致组织和细胞对铁死亡的高敏感性[27]。因此，该病与铁死亡密切相关，通过维持铁离子的稳态和抑制脂质过氧化是预防和治疗激素性股骨头坏死新的方向与思路。这些发现为探索铁死亡在激素性股骨头坏死中软骨相关的铁死亡病理机制提供了一定的研究基础。实验通过生物信息学和机器学习分析结合动物实验验证，探索激素性股骨头坏死软骨相关铁死亡的基因表达和参与的生物过程并鉴定核心生物标志物，尝试从软骨铁死亡角度为激素性股骨头坏死的病理机制和治疗方法提供新见解。
实验通过疾病数据集和铁死亡相关数据集，筛选出19个铁死亡差异基因。相关性分析表明，铁死亡差异基因之间相互影响，以正相关性为主，存在着密切的关联。GO富集分析表明，铁死亡差异基因主要在激酶复合物、氨基酸复合体、细胞对氧化应激与化学应激的反应等方面富集。NADPH氧化酶是一种重要的激酶复合物，参与调节细胞内活性氧的产生，激活的NADPH氧化酶在细胞膜上产生超氧阴离子，进而引发脂质过氧化反应，导致膜脂质的氧化损伤，导致铁死亡的发生[28]。激活的MAPK激酶可以磷酸化脂质代谢相关酶和转录因子，增加细胞内的脂质代谢和氧化应激反应[29]。谷胱甘肽作为重要的抗氧化氨基酸复合体，参与细胞内的还原反应，保护细胞免受脂质过氧化的损伤[30]。KEGG信号通显著在FoxO信号通路、血管内皮生长因子信号通路和FcγR介导的吞噬作用途径中发挥作用。氧化应激条件下，FoxO因子激活后进入细胞核，促进抗氧化酶的表达，可以增强软骨细胞的抗氧化能力[31]。低氧环境下，血管内皮生长因子通过与其受体结合，激活内皮细胞和间质细胞，引导新血管生长进入软骨组织[32]。上述结果表明，激素性股骨头坏死中软骨相关铁死亡基因可能主要通过影响细胞抗氧化能力，调节氧化应激等方面与激素性股骨头坏死产生联系。但仍需更多的研究来探索具体调控机制，阐明软骨相关的铁死亡差异基因在激素性股骨头坏死中的生物学功能。
为了筛选与激素性股骨头坏死密切相关的铁死亡特征基因，实验通过MCODE插件、cytoHubba插件和LASSO算法交叉获得了特征基因CA9。碳酸酐酶9(carbonic anhydrase Ⅸ，CA9)属于碳酸酐酶家族中的一员，是调节细胞内外酸碱平衡的蛋白，在酸性环境中发挥重要作用[33]。股骨头坏死的发生使得股骨头局部出现缺血缺氧状态，缺氧会导致细胞无法进行充分的氧化代谢，出现糖酵解，导致乳酸的大量产生，使细胞处于酸性环境[34-35]，从而导致CA9上调表达[36]。同时，缺氧状态可以促使缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)进入细胞核，导致其异常激活，并启动下游相关缺氧因子CA9的转录[36-37]。软骨组织主要依赖周围组织滋养和氧气扩散来满足其生存和功能需求，股骨头坏死的发生使得软骨滋养受到影响，使其处于缺氧状态，引起代谢紊乱，导致软骨细胞内CA9的增高[38]。此外，缺氧会引起活性氧的过表达，导致氧化应激的发生，调节CA9的表达[39]。氧化应激状态下，活性氧与脂质分子中的不饱和脂肪酸反应，引发脂质过氧化，从而导致铁死亡的发生[40]。研究表明，沉默巨噬细胞中CA9蛋白的表达，可以增加促软骨细胞转化生长因子β的表达，抑制软骨细胞凋亡，改善软骨退变情况[41]。目前，关于激素性股骨头坏死铁死亡的研究主要集中在血清代谢物和骨组织方面[42]，并未有针对软骨组织的研究。激素不仅可以影响骨代谢的平衡，对软骨也产生了破坏作用，软骨变性与形变是激素性股骨头坏死中后期阶段重要的病理机制之一，抑制软骨变性可以延缓股骨头塌陷，抑制股骨头坏死发展。因此，探索激素性股骨头坏死中软骨退变机制，对于激素性股骨头坏死的治疗同样具有重要作用。
实验通过ROC曲线分析发现，CA9的AUC值为1.000，95%CI：1.000−1.000，表明CA9在诊断激激素性股骨头坏死软骨铁死亡方面具有较高的诊断价值。过高的AUC值，可能与当前GEO数据库中激素性股骨头坏死软骨相关的样本量较少有关。箱线图显示，股骨头坏死软骨样本中CA9的表达明显高于正常组，且具有显著性意义，推测激素性股骨头坏死的缺血缺氧状态可以导致软骨中CA9的表达增高，且与铁死亡存在相关性。因此，特征基因CA9对铁死亡的调控值得在对股骨头坏死的研究中进一步探索。通过GSEA分析发现，脂肪酸代谢、O-GlcNAc糖基化修饰和剪切体等生物过程中上调表达，而在神经活性配体受体相互作用、嗅觉传导和味觉传导方面被抑制。脂肪酸代谢紊乱会影响细胞内脂质的成分和表达失衡，引起细胞内出现脂质过氧化，从而诱发铁死亡[43]。在脂质代谢中，O-GlcNAc糖基化修饰参与调节脂质底物产生过程；在脂质过氧化损伤中发挥了防御作用[44]。研究表明，通过激活神经活性配体受体相互作用的信号通路，可以调节细胞内的铁死亡发生，减轻铁死亡[45]。
随后，通过动物实验对CA9的表达进行了验证，其表达水平显著高于正常股骨头内的软骨，与生物信息学鉴定的结果一致。
激素导致的股骨头内骨代谢紊乱及力学稳定失衡，是股骨头塌陷的重要诱因[46]。软骨的变性、变薄和力学强度的降低同样会影响股骨头稳定的力学结构，加速股骨头塌陷，在股骨头坏死的中后期阶段甚至出现软骨下骨与软骨分离的情况[47]。临床中，预防塌陷是治疗激素性股骨头坏死的首要目标，关注骨代谢失衡的同时，软骨退变也值得注意，这样才能更全面地维持股骨头的生物力学结构，防止塌陷。此外，在股骨头塌陷后未出现明显变形前，保证软骨弹性和软骨下骨与软骨紧密结合关系，同样可以延缓塌陷速度，保障髋关节结构的整体完好。激素性股骨头坏死好发于中青年人群，多累及双侧股骨头，因其发病迅速，若未及时治疗，多数患者最终不得不选择手术治疗，同时，由于关节假体使用寿命有限、感染和假体松动等问题，可能会经历数次手术[48-49]。特征基因CA9作为潜在预测激素性股骨头坏死中软骨退变的生物标志物，其高表达提示激素性股骨头坏死患者软骨退变的发生。因此，对激素性股骨头坏死的早期诊断和阶段治疗可以提供额外的证据补充和治疗手段，从而延缓股骨头坏死的进展和塌陷的发生，尽可能提高患者股骨头塌陷后关节置换手术的年龄，减轻患者负担，为诊断和治疗激素性股骨头坏死补充了新的方向与靶点。此外，由于患病的差异性和复杂性，CA9对早期激素性股骨头坏死的鉴别诊断也可能发挥一定的辅助作用。
为了验证激素性股骨头坏死软骨内是否发生了铁死亡，通过动物实验验证了铁死亡发生的相关指标。脂质过氧化是导致铁死亡发生的标志，多不饱和脂肪酸是脂质过氧化的主要目标之一[50]，ACSL4催化PUFA纳入细胞磷脂分子，引起细胞膜的不稳定，从而导致脂质过氧化的发生[51]。细胞中铁死亡发生时，ACSL4的活性和表达水平明显增高[52]。
GPX4催化谷胱甘肽参与脂质过氧化的还原反应，清除细胞的过氧化物，抑制脂质过氧化的发生[53]。此外，SLC7A11可以促进谷胱甘肽的转运，增强GPX4的表达水平，减轻铁死亡的损伤[54]。实验通过对激素性股骨头坏死软骨中ACSL4、SLC7A11和GPX4 mRNA和蛋白表达的检测发现，与正常组相比，模型组中的ACSL4 mRNA和蛋白表达量显著升高，而SLC7A11和GPX4 mRNA和蛋白的表达则明显降低，证明了激素性股骨头坏死软骨中发生了脂质过氧化，可以通过SLC7A11/GPX4轴调控铁死亡的发生。
尽管通过生物信息学和动物实验验证，筛选和鉴定出了CA9作为潜在的激素性股骨头坏死中软骨的诊断标志物，但仍有一定的局限性。首先，在GEO数据库中未找到更多关于激素性股骨头坏死的软骨数据集，使得实验纳入的样本量较少，可能会对筛选结果产生一定偏倚；其次，只进行了动物体内实验验证，未进行细胞实验和临床样本中特征基因和铁死亡表型的验证来进一步确定特征基因的诊断价值和作用机制。未来可以进行细胞实验和临床大样本的研究，解决实验结论可能存在的局限性以及深入探索激素性股骨头坏死软骨中铁死亡的调控机制。
综上所述，实验基于生物信息学和实验验证，以软骨和铁死亡为切入点，筛选和鉴定出CA9作为激素性股骨头坏死中软骨相关的铁死亡标志物，有望成为潜在诊断和治疗激素性股骨头坏死软骨退变的靶点，并验证了激素性股骨头坏死软骨中铁死亡的发生。为深入研究激素性股骨头坏死软骨相关的铁死亡作用机制和诊断提供潜在靶点和新的见解。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

CA9作为激素性股骨头坏死中软骨铁死亡特征基因的生物信息学鉴定

Bioinformatics identification of CA9 as a signature gene for cartilage-associated ferroptosis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

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