齐墩果酸调节Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠激素性股骨头坏死

doi:10.12307/2024.556

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4373-4377.doi: 10.12307/2024.556

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齐墩果酸调节Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠激素性股骨头坏死

龚高进，黄海汛

成都医学院第二附属医院•核工业四一六医院脊柱骨科，四川省成都市 610051

收稿日期:2023-10-10 接受日期:2023-11-17 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-29
通讯作者: 黄海汛，副主任医师，成都医学院第二附属医院•核工业四一六医院脊柱骨科，四川省成都市 610051
作者简介:龚高进，男，1981年生，四川省成都市人，汉族，2006年四川大学毕业，主治医师，主要从事骨科方向的研究。

Oleanolic acid alleviates steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats by regulating Wnt/beta-catenin signaling pathway

Gong Gaojin, Huang Haixun

Department of Spine and Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College•Nuclear Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, Sichuan Province, China

Received:2023-10-10 Accepted:2023-11-17 Online:2024-09-28 Published:2024-01-29
Contact: Huang Haixun, Associate chief physician, Department of Spine and Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College•Nuclear Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, Sichuan Province, China
About author:Gong Gaojin, Attending physician, Department of Spine and Orthopaedics, the Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College • Nuclear Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

齐墩果酸：是从中药中提取的一种五环三萜类化合物，研究表明齐墩果酸具有治疗骨质疏松的作用。
Wnt/β-Catenin 信号通路：可调节干细胞的多能性，并且在发育过程中决定细胞的分化命运。这种发育性级联整合其他通路的信号，包括视黄酸、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和骨形态发生蛋白，存在于各种不同的细胞类型和组织。

背景：齐墩果酸具有促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞增殖，进而改善激素性股骨头坏死的功效，但其具体作用机制尚不完全清楚。

目的：探究齐墩果酸通过调节Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠激素性股骨头坏死的机制。
方法：将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、齐墩果酸组、齐墩果酸+sFRP1组，后3组大鼠注射醋酸泼尼松龙建立大鼠激素性股骨头坏死模型。齐墩果酸组大鼠灌胃10 mg/(kg•d)齐墩果酸并肌肉注射相应生理盐水，齐墩果酸+sFRP1组大鼠灌胃10 mg/(kg•d)的齐墩果酸并肌肉注射1 mg/(kg•d)的Wnt抑制剂sFRP1，对照组和模型组大鼠灌胃和肌肉注射等体积生理盐水，给药6周。检测各组大鼠血清Ca、P、转化生长因子β1及碱性磷酸酶水平；micro-CT检测股骨形态；苏木精-伊红染色观察股骨组织形态；TUNEL检测组织细胞凋亡率；蛋白印迹法检测Bcl-2、Bax、Wnt、β-catenin蛋白水平。

结果与结论：①与对照组相比，模型组大鼠骨小梁、股骨头严重损伤，血清Ca、P、转化生长因子β1水平、骨组织Bcl-2、Wnt、β-catenin蛋白水平显著降低，血清碱性磷酸酶水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组大鼠骨小梁稀疏程度明显改善，股骨头损害程度显著减轻，血清碱性磷酸酶水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平显著降低，血清Ca、P、转化生长因子β1水平、骨组织Bcl-2、Wnt、β-catenin蛋白水平显著升高(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组大鼠上述指标呈现相反变化(P < 0.05)。②结果说明，齐墩果酸可改善激素性股骨头坏死大鼠的骨代谢指标和骨小梁结构，减轻股骨头坏死，可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。

https://orcid.org/0009-0005-2397-9068(龚高进)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 齐墩果酸, Wnt, β-catenin, 激素性股骨头坏死, 骨代谢, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Oleanolic acid can promote osteoblast proliferation and inhibit osteoclast proliferation, thereby improving steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, but its specific mechanism of action is not yet fully understood.
OBJECTIVE: To explore the mechanism by which oleanolic acid alleviates steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway.
METHODS: Forty Sprague-Dawley rats were randomized into control group, model group, oleanolic acid group and oleanolic acid+sFRP1 group. An animal model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head was established by injecting prednisolone acetate in the latter three groups. Rats in the oleanolic acid group were gavaged with 10 mg/kg/d oleanolic acid and intramuscularly injected with the corresponding saline; rats in the oleanolic acid+sFRP1 group were gavaged with 10 mg/kg/d oleanolic acid and intramuscularly injected with 1 mg/kg/d Wnt inhibitor-sFRP1; and rats in the control and model groups were administered by gavage and intramuscularly injected with equal volumes of saline for 6 weeks. The levels of serum calcium, phosphorus, transforming growth factor-β1, and alkaline phosphatase were detected. Micro-CT was applied to detect femoral morphology. The morphology of femoral tissue was detected by hematoxylin-eosin staining. Cell apoptosis was detected by TUNEL. The levels of Bcl-2, Bax, β-catenin, and Wnt proteins were determined by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the trabeculae bone and femoral head of the model group were seriously injured, the serum levels of calcium, phosphorus, and transforming growth factor-β1 were significantly decreased, the levels of Bcl-2, Wnt, and β-catenin proteins in bone tissue were significantly reduced, and the serum alkaline phosphatase level, cell apoptosis rate, and Bax protein level were significantly increased (P < 0.05). Compared with the model group, the degree of trabecular thinning in the oleanolic acid group was significantly improved, and the degree of femoral head damage was significantly reduced, serum alkaline phosphatase level, cell apoptosis rate, and Bax protein level were significantly reduced, serum levels of calcium, phosphorus, and transforming growth factor-β1, and levels of Bcl-2, Wnt, and β-catenin proteins in bone tissue were significantly increased (P < 0.05). Compared with the oleanolic acid group, the oleanolic acid+sFRP1 group showed opposite changes in the above-mentioned indicators (P < 0.05). To conclude, oleanolic acid can improve bone metabolism indicators and trabecular structure and attenuate femoral head necrosis in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, which can be achieved by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words: oleanolic acid, Wnt, β-catenin, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, bone metabolism, signaling pathway

中图分类号:

龚高进, 黄海汛. 齐墩果酸调节Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4373-4377.

Gong Gaojin, Huang Haixun. Oleanolic acid alleviates steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats by regulating Wnt/beta-catenin signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4373-4377.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验用大鼠分为4组，实验过程无动物死亡，以每组10只进入结果分析。
2.2 齐墩果酸对各组大鼠血清Ca、P浓度的影响模型组大鼠血清Ca、血清P浓度显著低于对照组(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组大鼠血清Ca、血清P浓度显著升高(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组大鼠血清Ca、血清P浓度显著降低(P < 0.05)，见表1。

2.3 齐墩果酸对各组大鼠血清碱性磷酸酶、转化生长因子β1水平的影响与对照组相比，模型组大鼠血清碱性磷酸酶水平显著升高，转化生长因子β1水平显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组大鼠血清碱性磷酸酶水平显著降低，转化生长因子β1水平显著升高(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组大鼠血清碱性磷酸酶水平显著升高，转化生长因子β1水平显著降低(P < 0.05)，见表2。

2.4 Micro-CT和骨组织形态分析与对照组相比，模型组股骨头遭到破坏，骨空隙变大、骨量减少、骨小梁稀疏断裂；与模型组相比，齐墩果酸组股骨头损害程度显著减轻；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组股骨头破坏程度显著加重。Micro-CT定量股骨头骨小梁参数结果表明，与对照组相比，模型组骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度显著下降，骨小梁分离度显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度显著升高，骨小梁分离度显著降低(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度显著下降，骨小梁分离度显著升高(P < 0.05)，见图1，表3。

2.5 齐墩果酸对SONFH大鼠骨组织的影响对照组股骨头形态结构正常。与对照组相比，模型组骨小梁变细且稀疏，中间空隙变大，骨小梁面积百分比显著降低，空骨陷窝率显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组骨小梁稀疏程度明显改善，骨小梁面积百分比显著升高，空骨陷窝率显著降低(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组骨小梁明显变细、稀疏，中间空隙显著增大，骨小梁面积百分比显著降低，空骨陷窝率显著升高(P < 0.05)，见图2，表4。

2.6 齐墩果酸对各组大鼠股骨头组织细胞凋亡率的影响与对照组相比，模型组骨组织细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组骨组织细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组骨组织细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，见图3，表5。

2.7 齐墩果酸对各组大鼠骨组织相关蛋白表达的影响与对照组相比，模型组骨组织Bcl-2、Wnt、β-catenin蛋白水平显著降低，Bax水平显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，齐墩果酸组骨组织Bcl-2、Wnt、β-catenin蛋白水平显著升高，Bax水平显著降低(P < 0.05)；与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组骨组织Bcl-2、Wnt、β-catenin蛋白水平显著降低，Bax水平显著升高(P < 0.05)，见图4，表6。

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引言

非创伤性股骨头坏死是股骨头结构遭到破坏并塌陷的一种骨科疾病[1]。而激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis
of the femoral head，SONFH)是非创伤性股骨头坏死的一种，主要是由于长期或大剂量服用激素使血管胶原纤维和弹性纤维功能障碍进而导致股骨头内微小动脉栓塞、缺血而引起的骨头缺血性坏死[2]。SONFH具有较高的致残率，可造成患者活动功能障碍，其发病机制目前尚未研究清楚，而现有的医疗水平有限尚不能治愈SONFH，因此探究SONFH的发病机制和寻找新的药物对于治疗SONFH具有重要意义[3-4]。
齐墩果酸是从中药中提取的一种五环三萜类化合物，相关研究表明齐墩果酸具有治疗骨质疏松的作用[5]。SHU等[6]研究表明齐墩果酸可以诱导早期成骨基因碱性磷酸酶、矮小相关转录因子2(Runx2)和Ⅰ型胶原蛋白的表达，增强生长因子骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP2)介导的间充质基质细胞成骨分化。ZHAO等[7]研究表明齐墩果酸通过降低破骨细胞密度来减弱骨保护素敲除导致的小鼠骨质流失。相关研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在调控骨细胞增殖和凋亡过程中发挥重要作用[8-10]。WANG等[11]研究表明脂联素通过激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进成骨形成。YUAN等[12]研究表明新橙皮苷通过上调Wnt/β-catenin可以减小SONFH小鼠病理学改变，改善股骨头结构促进成骨分化。齐墩果酸是否可以调控Wnt/β-catenin信号通路来发挥对SONFH的治疗作用尚无相关报道，因此，此次研究就齐墩果酸通过调节Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠SONFH的机制进行探讨，以期为临床用药提供数据参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。多组间比较用单因素方差分析，组内两两比较进行SNK-q检验。
1.2 时间及地点实验于2023年3-5月在成都医学院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物五六周龄、180-200 g的健康雄性SD大鼠40只，购自上海思捷实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(沪) 2023-0004。成都医学院第二附属医院医学伦理委员会已审核并批准该研究(伦理编号：202302-019)。
1.3.2 主要药品、试剂及仪器齐墩果酸购自陕西博林生物技术有限公司；醋酸泼尼松龙购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Wnt抑制剂sFRP1购自MCE公司；血清Ca和血清P ELISA检测试剂盒购自上海化邦生物科技有限公司；碱性磷酸酶和转化生长因子子β1 ELISA检测试剂盒购自上海白益生物科技有限公司；Wnt抑制剂-sFRP1购自北京百奥莱博科技有限公司；TUNEL试剂盒购自西安百萤生物科技有限公司；骨组织蛋白提取试剂盒购自上海康郎生物科技有限公司；Bax、Bcl-2、Wnt、β-catenin一抗及二抗均购自英国Abcam公司；CX41显微镜购自上海沛升仪器设备有限公司；RM2245病理切片机购自德国Lecia公司。
1.4 实验方法

1.4.1 分组与造模随机取30只大鼠为造模组，腹腔注射醋酸泼尼松龙注射液15 mg/kg，并注射青霉素预防感染，每周注射2次，注射10周[13]，建立大鼠SONFH模型。造模成功后将大鼠分为模型组、齐墩果酸组、齐墩果酸+sFRP1组，另取10只大鼠为对照组，腹腔注射等体积生理盐水并注射青霉素。齐墩果酸组大鼠灌胃10 mg/(kg•d)的齐墩果酸并肌肉注射相应生理盐水[14]，齐墩果酸+sFRP1组大鼠灌胃10 mg/(kg•d)的齐墩果酸并肌肉注射1 mg/(kg•d)的Wnt抑制剂sFRP1[15]，对照组和模型组大鼠给予灌胃和肌肉注射等体积生理盐水，给药6周。

1.4.2 血清Ca、P、碱性磷酸酶及转化生长因子β1水平的检测治疗结束后腹主动脉取血6 mL，低温离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测相关指标。
1.4.3 micro-CT扫描各组取5只完成取血的大鼠，用0.3%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，完整取出双侧股骨，将股骨浸泡于40 g/L的多聚甲醛中固定48 h，固定结束后生理盐水清洗。以股骨头为扫描中心，通过SkyScan micro-CT设备对股骨近端进行扫描，将扫描数据通过NRecon软件进行重建，采用DataViewer软件调整三维模型的方向，进一步通过CTAn软件、DataViewer软件对感兴趣区域松质骨进行定量分析(定义股骨近端为感兴趣区域ROI)，在ROI范围内分析骨小梁相关参数，包括骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度及骨小梁分离度。
1.4.4 苏木精-伊红染色取固定股骨组织，用EDTA脱钙，骨组织完全脱钙完成后，进行脱水、包埋、沿各大冠状轴切成5 mm左右的切片，脱蜡、苏木精-伊红染色，显微镜观察形态变化。用BIOQUANT OSTEO软件对骨组织形态学进行分析，计算空骨陷窝率和骨小梁面积百分比，空骨陷窝率=空骨陷窝数/总骨陷窝数×100%。
1.4.5 TUNEL检测股骨头组织中细胞凋亡情况选取各组剩余5只完成取血的麻醉大鼠，完整取出双侧股骨，将部分骨组织置于1%zinc固定液中固定48 h，清洗，脱水，包埋，切片，烤片，二甲苯清洗，乙醇梯度清洗，放入湿盒中滴加50 mg/mL蛋白酶K，37 ℃孵育30 min，之后按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。光学显微镜下拍照观察细胞，计算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.4.6 Western blot检测相关蛋白水平取各组大鼠股骨组织1 g，于研钵中加入液氮将其研磨成粉末，加入裂解液，低温裂解，低温10 000 r/min离心10 min，取上清，测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白并转移至PVDF膜，封闭液封闭2 h，加入一抗Bax、Bcl-2、Wnt、β-catenin、β-actin稀释液(1∶1 500)4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后再添加二抗，清洗后加ECL显影。使用Image J软件对Bcl-2、Bax、Wnt、β-catenin蛋白进行定量分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠血清Ca、P、碱性磷酸酶及转化生长因子β1水平；②骨小梁参数分析；③骨组织形态观察；④骨组织细胞凋亡率；⑤骨组织Bcl-2、Bax、Wnt、β-catenin蛋白的表达。
1.6 统计学分析实验数据用SPSS 26.0软件分析；以x±s表示实验统计结果；多组间比较用单因素方差分析，采用SNK-q检验进行组内两两比较；P < 0.05表示差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经成都医学院生物统计学专家审核。

讨论

随着糖皮质激素对各种疾病治疗的广泛使用，SONFH的发病率急剧增加，约占比非创伤性股骨头坏死的60%[16-18]。
SONFH患者主要是中青年男性，调查显示每年新增病例20万人左右，该疾病不可逆转，致残率高，严重危害人民生命健康[19]。目前临床上主要通过抗炎和抑制骨吸收等药物来缓解患者病痛，尚没有有效的治疗药物[20]，因此急需开发新的药物用于治疗SONFH。此次研究通过腹腔注射醋酸泼尼松龙建立SONFH大鼠模型，结果表明模型组大鼠骨小梁、股骨头严重损伤，骨组织Bcl-2蛋白水平显著降低，骨小梁分离度、空骨陷窝率、细胞凋亡率显著升高，提示SONFH造成大鼠骨细胞凋亡和股骨微观结构破坏。转化生长因子β1是一种参与骨和软骨形成的多肽。碱性磷酸酶具有破坏钙化抑制剂、分解有机磷酸酯的作用。此次研究结果表明，模型组大鼠碱性磷酸酶水平升高，转化生长因子β1水平降低，表明SONFH造成股骨头局部缺血，导致股骨头坏死。骨代谢指标血清Ca、血清P浓度降低，表明SONFH造成股骨头坏死部位代谢紊乱。
齐墩果酸是从冬青子中提取的传统中药成分，有研究表明其具有促进成骨形成抑制骨质疏松的作用[21-23]。CAO等[24]研究表明齐墩果酸可以改善老年雌性大鼠的骨骼特性和钙平衡，调节维生素D代谢。XIE等[25]研究表明齐墩果酸通过上调miR-503表达可以抑制破骨细胞形成和骨吸收。推测齐墩果酸可修复骨组织细胞损伤，有效保护骨组织。此次研究结果表明，齐墩果酸干预后，大鼠骨小梁稀疏程度明显改善，股骨头损害程度显著减轻，股骨头组织细胞凋亡率显著降低，提示齐墩果酸通过降低骨细胞凋亡，可改善股骨微观结构和骨代谢，促进股骨头坏死部位的组织修复，与推测结果一致。
大量研究表明，Wnt/β-Catenin信号通路与SONFH的发生、发展密切相关[26-28]。CHEN等[29]研究表明激活BMP2-Wnt/β-Catenin信号通路可促进骨间充质干细胞增殖和成骨分化。SHEN等[30]研究表明激活Wnt/β-Catenin信号通路可促进骨间充质干细胞成骨分化，并防止卵巢切除术诱导的骨质流失。此次研究结果显示，模型组大鼠骨组织Wnt、β-catenin蛋白表达被抑制，齐墩果酸干预后可显著提高Wnt、β-catenin蛋白表达，激活Wnt/β-Catenin信号通路，有效改善SONFH症状。为进一步验证该结论，此次实验在齐墩果酸干预的基础上，添加Wnt/β-Catenin信号通路抑制剂sFRP1进行干预，结果表明，与齐墩果酸组相比，齐墩果酸+sFRP1组大鼠骨小梁、股骨头损伤加重、血清Ca、血清P、转化生长因子β1水平、骨组织Bcl-2、Wnt、β-catenin蛋白水平显著降低，空骨陷窝率、骨小梁分离度、血清碱性磷酸酶水平、细胞凋亡率、Bax水平显著升高；sFRP1可以逆转齐墩果酸对SONFH大鼠股骨的保护作用，结果提示墩果酸通过激活Wnt/β-Catenin信号通路实现对SONFH大鼠股骨的保护作用。
此次研究的局限性：实验初步证实齐墩果酸对糖皮质激素引起的股骨头坏死有一定治疗作用，但中药成分在动物体内作用靶点不唯一可能还存在其他作用靶点有待进一步研究；未单独使用Wnt/β-catenin信号通路激活剂，以增强Wnt/β-catenin信号通路与SONFH的直接靶向关系。
综上所述，Wnt/β-catenin信号通路在SONFH大鼠中被抑制，齐墩果酸可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路进而改善SONFH大鼠骨代谢指标和骨小梁结构，实现对SONFH大鼠骨骼的保护作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

齐墩果酸调节Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠激素性股骨头坏死

Oleanolic acid alleviates steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats by regulating Wnt/beta-catenin signaling pathway

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