人胎盘间充质干细胞调控 TGF-β1 /Smad3 信号通路抑制肺纤维化的发生

doi:10.12307/2024.712

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (31): 4970-4974.doi: 10.12307/2024.712

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人胎盘间充质干细胞调控 TGF-β1 /Smad3 信号通路抑制肺纤维化的发生

曹佳伟1，丁劭瑞1，铁华1，薛菁2，3，贾元元2，3，梁雪云3，李锋4

1宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏医学科学研究院，宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室，宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750004；4宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2023-08-10 接受日期:2023-10-12 出版日期:2024-11-08 发布日期:2024-01-22
通讯作者: 李锋，硕士，主任技师，宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:曹佳伟，女，1997年生，宁夏回族自治区固原市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事间质性肺病肺纤维化研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81860566)，项目负责人：李锋

Human placental mesenchymal stem cells inhibit occurrence of pulmonary fibrosis by regulating transforming growth factor-beta 1/Smad3 signaling pathway

Cao Jiawei1, Ding Shaorui1, Tie Hua1, Xue Jing2, 3, Jia Yuanyuan2, 3, Liang Xueyun3, Li Feng4

1Clinical Medical College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2General Hospital of Ningxia Medical University, Ningxia Academy of Medical Sciences, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Ningxia Hui Autonomous Region, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4Medical Experimental Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-08-10 Accepted:2023-10-12 Online:2024-11-08 Published:2024-01-22
Contact: Li Feng, Master, Chief technician, Medical Experimental Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Cao Jiawei, Master candidate, Clinical Medical College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81860566 (to LF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

胎盘间充质干细胞：是存在于胎盘组织中的一种多功能细胞，具有自我更新和多向分化能力。因具有免疫调节功能、组织修复作用以及低免疫原性，胎盘间充质干细胞在多种疾病治疗中展现出广阔的应用前景。
肺纤维化：是一种发生在肺间质的慢性进展性疾病，会引起肺组织的免疫炎症反应和肺泡结构损伤，主要病理特征是胶原合成和降解失衡引起细胞外基质在肺间质内过度积累，导致气体交换不良，最终引发呼吸衰竭。

背景：研究表明人胎盘间充质干细胞能有效抑制肺纤维化的发展，但其发挥作用的具体机制目前并不清楚。

目的：探究人胎盘间充质干细胞对二氧化硅诱导人胚肺成纤维细胞发生肺纤维化的治疗作用及相关机制。
方法：CCK-8法检测不同质量浓度二氧化硅干预不同时间对MRC-5细胞增殖活力的影响，结合免疫荧光染色法筛选出最佳的二氧化硅刺激质量浓度与时间用于后续实验。将MRC-5细胞分为空白组、二氧化硅组、二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组，空白组细胞不予任何处理，二氧化硅组MRC-5细胞给予100 μg/mL二氧化硅刺激48 h，二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组MRC-5细胞先给予100 μg/mL二氧化硅刺激48 h后再与人胎盘间充质干细胞共培养24 h。免疫荧光染色检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型蛋白的表达；Western blot检测各组细胞肺纤维化相关蛋白和TGF-β1/Smad 3信号通路相关蛋白表达。

结果与结论：①CCK-8结果显示，100 μg/mL 二氧化硅刺激MRC-5细胞48 h为最佳质量浓度与时间；②免疫荧光染色结果显示，与二氧化硅组相比，二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型蛋白表达明显降低；③Western blot结果显示，与二氧化硅组相比，二氧化硅+人胎盘间充质干细胞组α-平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白Ⅰ型、N-钙黏蛋白、粘连蛋白、转化生长因子β1、p-Smad3、Smad3的蛋白表达均降低，E-钙黏蛋白表达升高，差异均有显著性意义(P < 0.05)；④结果说明，人胎盘间充质干细胞能够对二氧化硅诱导的肺纤维化有显著的治疗作用；人胎盘间充质干细胞可以通过调控 TGF-β1/Smad3信号通路抑制肺纤维化的发生。

https://orcid.org/0009-0000-1631-3456 (曹佳伟)；https://orcid.org/0000-0002-7991-8011 (李锋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人胎盘间充质干细胞, 肺纤维化, MRC-5细胞, 转化生长因子β1, Smad3, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Human placental mesenchymal stem cells have been shown to be effective in inhibiting the development of pulmonary fibrosis, but the underlying mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect and related mechanism of human placental mesenchymal stem cells on silica-induced pulmonary fibrosis in human embryonic lung fibroblasts (MRC-5).
METHODS: CCK-8 assay was used to detect the effects of different mass concentrations of silica on the proliferation of MRC-5 at different time points. Immunofluorescence staining was used to screen out the best stimulating mass concentration and time of silica for subsequent experiments. MRC-5 cells were divided into blank group, silica group, and silica + human placental mesenchymal stem cell group. In the blank group, cells were not treated. In the silica group, MRC-5 cells were stimulated with 100 μg/mL silica for 48 hours. In the silica + human placental mesenchymal stem cell group, MRC-5 cells were stimulated with 100 μg/mL silica for 48 hours and then co-cultured with human placental mesenchymal stem cells for 24 hours. Immunofluorescence staining was used to detect the expression of α-smooth muscle actin and collagen type I in cells of each group. Western blot assay was used to detect the expressions of pulmonary fibrosis-related proteins and TGF-β1/Smad 3 signaling pathway-related proteins in cells of each group.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay results suggested that 100 μg/mL silica was the best mass concentration and time to stimulate MRC-5 cells for 48 hours. (2) Immunofluorescence staining results showed that the expression of α-smooth muscle actin and collagen type I in the silica + human placental mesenchymal stem cell group was significantly lower than that in the silica group. (3) Western blot assay results showed that compared with the silica group, the protein expression levels of α-smooth muscle actin, collagen type I, N-cadherin, fibronectin, transforming growth factor-β1, p-Smad3, and Smad3 in the silica + human placental mesenchymal stem cell group were decreased, and the expression of E-cadherin was increased. The difference was statistically significant (P < 0.05). (4) The results showed that human placental mesenchymal stem cells had a significant therapeutic effect on silica-induced pulmonary fibrosis. Human placental mesenchymal stem cells can inhibit the development of pulmonary fibrosis by regulating transforming growth factor-β1/Smad3 signaling pathway.

Key words: human placental mesenchymal stem cell, pulmonary fibrosis, MRC-5 cell, transforming growth factor-β1, Smad3, signaling pathway

中图分类号:

曹佳伟, 丁劭瑞, 铁华, 薛菁, 贾元元, 梁雪云, 李锋. 人胎盘间充质干细胞调控 TGF-β1 /Smad3 信号通路抑制肺纤维化的发生[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4970-4974.

Cao Jiawei, Ding Shaorui, Tie Hua, Xue Jing, Jia Yuanyuan, Liang Xueyun, Li Feng. Human placental mesenchymal stem cells inhibit occurrence of pulmonary fibrosis by regulating transforming growth factor-beta 1/Smad3 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(31): 4970-4974.

图/表（结果） 6

2.1 CCK-8法检测SiO2刺激MRC-5细胞的最适质量浓度和时间 CCK-8结果显示，5，25，50 μg/mL SiO2刺激MRC-5细胞24，48，72 h，细胞活力与对照组相比均无统计学差异。使用100 μg/mL SiO2刺激MRC-5细胞48 h后，细胞活力与对照组相比明显下降(P < 0.001)，见图1A。结合免疫荧光染色结果提示暴露于100 μg/mL SiO2 48 h时MRC-5细胞的COL-Ⅰ和α-SMA表达丰度增加，见图1B。故后续实验选择质量浓度100 μg/mL SiO2刺激48 h的MRC-5细胞用于肺纤维化细胞模型的建立。

2.2 Hp-MSCs的形态 Hp-MSCs经无血清体系培养24 h换液后，倒置显微镜下观察Hp-MSCs形态均一，贴壁生长，呈成纤维细胞样梭形细胞，具有典型的间充质干细胞形态特征，见图2。

2.3 Hp-MSCs鉴定结果流式细胞术结果显示，Hp-MSCs显著高表达CD73、CD90和CD105，不表达阴性指标(CD14、CD34、CD45 、CD19和HLA-DR)，符合间充质干细胞的特征，见表1，图3。

2.4 免疫荧光染色检测各组MRC-5细胞COL-Ⅰ与α-SMA的表达与空白组相比，SiO2组COL-Ⅰ与α-SMA的表达丰度增加，与SiO2组相比，SiO2+Hp-MSCs组COL-Ⅰ与α-SMA的表达丰度降低，见图4。

2.5 各组MRC-5细胞FN、COL-Ⅰ、N-Cadherin、α-SMA、E-Cadherin、TGF-β1、p-Smad3、Smad3蛋白表达与空白组相比，SiO2组FN、N-Cadherin与α-SMA蛋白表达均显著增高(P < 0.05)，COL-Ⅰ蛋白表达非常显著增高(P < 0.01)，E-Cadherin蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与SiO2组相比，SiO2+Hp-MSCs组FN与N-Cadherin蛋白表达均显著降低(P < 0.05)，COL-Ⅰ蛋白表达非常显著降低(P < 0.01)，α-SMA蛋白表达极显著降低(P < 0.001)，E-Cadherin蛋白表达非常显著增高(P < 0.01)。为了进一步验证Hp-MSCs抑制肺纤维化的发生与TGF-β1/Smad3信号通路相关，检测了Smad3、p-Smad3、TGF-β1在蛋白水平的表达，结果显示，与空白组相比，SiO2组TGF-β1蛋白表达明显增高(P < 0.01)，p-Smad3蛋白表达增高(P < 0.05)，与SiO2组相比，SiO2+Hp-MSCs组TGF-β1与p-Smad3蛋白表达明显降低(P < 0.01)；Smad3的蛋白表达在3组中没有明显变化，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞水平体外实验，单因素方差分析进行多组间比较。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年7月在宁夏回族自治区干细胞与再生医学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 Hp-MSCs来源于宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所胎盘干细胞库，MRC-5细胞购于普赛诺生命科技有限公司。
1.3.2 主要实验试剂 Hp-MSCs生长无血清培养基(北京银丰生物工程技术有限公司)；胎牛血清、PBS、0.25%Trypsin-EDTA (Gibco公司)；CCK-8试剂盒、抗体稀释液、MEM培养基(大连美仑公司)；SiO2粉尘(美国Sigma公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒(凯基生物技术股份有限公司)；TBST缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液(武汉赛维尔生物技术股份有限公司)；预染蛋白Marker(SMOBI公司)；兔单克隆抗体E-钙黏蛋白(E-Cadherin)(ab40772)、p-Smad3(ab52903)、Smad3(ab40854)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA) (ab124964)、胶原蛋白Ⅰ型(collagen tape Ⅰ，COL-Ⅰ) (ab138492)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) (ab215715)、兔多克隆抗体N-钙黏蛋白(N-Cadherin) (ab18203)、粘连蛋白(fibronectin，FN) (ab2413)、山羊抗兔二抗(ab6721)(美国Abcam公司)；兔单克隆抗体GAPDH(10494)(Proteintech公司)；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的CD14抗体(CD14-FITC)、CD34-FITC、CD19-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、HLA-DR-FITC、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的 CD73抗体(CD73-PE)、CD105-PE和同型对照抗体(IgG2a-FITC、IgG1-PE)(BD公司)。
1.3.3 主要实验仪器倒置显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)；高速离心机(美国Thermo公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；二氧化碳恒温培养箱(德国Eppendorf公司)。
1.4 方法
1.4.1 CCK-8法检测SiO2刺激MRC-5的细胞活力将处于对数生长期的MRC-5细胞以2×106 L-1的细胞浓度接种于96孔培养板内，每孔加入100 μL MEM培养基，培养6 h，待细胞贴壁并达到60%融合后，更换无血清培养基饥饿过夜。饥饿处理后按分组分别加入PBS和质量浓度分别为5，25，50，100，200 μg/mL的SiO2溶液，每组设5个复孔。加药后96孔培养板在细胞培养箱中继续培养，在24，48，72 h时每孔更换新鲜培养基100 μL，各孔分别加入10 μL CCK-8溶液，继续放入细胞培养箱中孵育，两三个小时后取出并用微孔板式多功能分析仪测定450 nm处的吸光度值，探索刺激MRC-5细胞的最佳SiO2质量浓度与时间。
1.4.2 Hp-MSCs的培养及鉴定 Hp-MSCs用无血清培养基培养，放于含体积分数为5%CO2、充分湿化的37 ℃恒温孵育箱中，待第3代细胞生长至90%汇合时，胰蛋白酶消化，收集细胞进行后续实验。
选取第3代正常生长的Hp-MSCs，制备单个细胞悬液，按照说明书分别加入单克隆抗体：IgG2a-FITC、IgG1-PE、CD14-FITC、CD34-FITC、CD19-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE和HLA-DR-FITC，至终体积100 μL(含1×106个细胞)于流式细胞管；室温避光静置20 min，PBS漂洗，流式细胞仪检测。
1.4.3 免疫荧光染色实验分为空白组、SiO2组和SiO2+Hp-MSCs组，空白组MRC-5细胞不予任何处理，SiO2组MRC-5细胞给予100 μg/mL SiO2刺激48 h，SiO2+Hp-MSCs组将MRC-5细胞先于Transwell小室中给予100 μg/mL SiO2刺激48 h，PBS洗涤细胞3次后将小室放置于已接种Hp-MSCs(5×104/孔)的12孔板中共培养。共培养24 h后消化收集3组MRC-5细胞，接种于提前放入细胞爬片的12孔板中，每孔细胞数为1×103个，待细胞贴壁后加入50-100 μL破膜工作液，室温孵育20 min，PBS清洗3次，每次5 min；然后室温封闭1 h后弃掉封闭液，加入按比例配好的一抗[α-SMA(1∶500)与COL-Ⅰ(1∶400)]，4 ℃冰箱孵育过夜；将细胞孔板于摇床上PBS清洗3次，每次5 min，加入适当配好比例的二抗(FITC标记山羊抗兔IgG，1∶200)，室温下避光孵育1 h；最后用DAPI进行细胞核复染后封固，在荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.4 Western blot检测相关蛋白表达实验分组同1.4.3，干预结束后，在各组细胞中加入适量的裂解液进行细胞全蛋白的提取，每组蛋白上样量为20 μg，在80 V电压下压胶30 min后调至120 V进行电泳，在0.33 A电流下转膜2 h，将PVDF膜置于快速封闭液室温下封闭15 min，按说明书将以下一抗进行稀释：α-SMA(1∶10 000)、E-cadherin(1∶50 000)、p-Smad3(1∶2 000)、Smad3(1∶ 5 000)、COL-Ⅰ(1∶5 000)、TGF-β1(1∶1 000)、N-Cadherin(1∶1 000)与FN(1∶1 000)，将PVDF膜置于上述各个抗体溶液中，4 ℃冰箱孵育过夜，次日在TBST洗脱液中将膜清洗3次，每次5 min，按照1∶6 000比例稀释二抗，将PVDF膜置于按比例稀释好的二抗溶液中，室温下孵育1 h，TBST清洗3次，避光条件下应用化学发光凝胶成像仪曝光，以GAPDH作为内参，用Image J 1.8.0软件进行灰度分析。
1.5 主要观察指标 ①SiO2刺激MRC-5细胞的最佳质量浓度和时间；②各组MRC-5细胞COL-Ⅰ与α-SMA的免疫荧光表达；③各组MRC-5细胞FN、COL-Ⅰ、N-Cadherin、α-SMA、E-Cadherin、TGF-β1、p-Smad3、Smad3蛋白表达。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，所有数据均以x±s表示，多组比较使用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过宁夏医科大学公共卫生与管理学院生物统计学专家赵瑜教授审核。

讨论

肺纤维化是一类发生在肺脏不可逆转的严重的间质性肺疾病，也是肺脏疾病终末期的一种病理表现[15-16]，其病理特征是大量促炎因子引起慢性肺泡炎，导致肺泡单位结构紊乱及纤维化的发生[17-18]。肺纤维化的发病机制目前还不是很清楚，但是可以确定的是在SiO2刺激下，肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，从而导致FN以及COL-Ⅰ的高度表达[19]。另一方面，受损的上皮细胞发生凋亡、释放炎症递质与细胞因子等，进而发生上皮间质转化也是导致肺纤维化发生的关键因素[20-21]。在肺纤维化的发展过程中，TGF-β1/Smad3信号通路起核心作用[22-24]，TGF-βⅠ型受体激活引起Smad蛋白磷酸化，进入细胞核，与相应的转录基因相结合，促进细胞外基质的沉积[25-27]。TGF-β1作为主要的促纤维化因子，促进N-Cadherin及肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达。肺纤维化尚无根治方法，目前可通过药物治疗(糖皮质激素、免疫抑制剂、抗氧化剂)、吸氧及肺移植等方法缓解症状和延长生命。已有相关研究发现传统的药物包括糖皮质激素及免疫抑制药物非但不能明显改善患者预后，而且长期使用更可能带来许多毒副作用[28]。近年来，以干细胞治疗为核心的再生医学科学技术日益发展，间充质干细胞由于具有免疫调节能力和易于分离的特点得到广泛的关注及研究，也为肺纤维化的治疗提供了新的思路[29-31]。有研究发现Hp-MSCs治疗肺纤维化模型小鼠的肺部炎症和纤维化都得到缓解，促纤维化细胞因子显著减少[32-33]。该研究发现，与空白组相比，SiO2组肺纤维化相关因子的蛋白表达水平上调，说明SiO2诱导MRC-5细胞发生纤维化反应；此外，SiO2组TGF-β1及p-Smad3蛋白水平也显著增高，提示TGF-β1上调诱发Smad3磷酸化水平增加，TGF-β1/Smad3参与肺纤维化的进程。经过Hp-MSCs干预后，肺纤维化相关因子FN、COL-Ⅰ、N-Cadherin及α-SMA的表达水平明显下调，TGF-β1、p-Smad3蛋白表达也下调，E-Cadherin蛋白表达上调，提示Hp-MSCs可能通过介导TGF-β1/Smad3信号通路减轻SiO2诱导的MRC-5细胞纤维化。
综上所述，该研究通过SiO2刺激MRC-5细胞构建体外肺纤维化模型，探讨Hp-MSCs对肺纤维化细胞的治疗作用及可能机制，结果发现Hp-MSCs可通过调控TGF-β1/Smad3信号通路抑制肺纤维化的发生，其作用机制可能是Hp-MSCs抑制TGF-β1与受体结合，进一步抑制了Smad3蛋白磷酸化水平，下游的Smad3蛋白不能够被激活，从而抑制肺纤维化发生的进程，初步揭示了Hp-MSCs通过介导TGF-β1/Smad3信号通路减轻SiO2诱导MRC-5细胞发生纤维化的作用机制。Hp-MSCs在肺纤维化中发挥作用的确切分子机制还需进一步的细胞功能学实验进行验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人胎盘间充质干细胞调控 TGF-β1 /Smad3 信号通路抑制肺纤维化的发生

Human placental mesenchymal stem cells inhibit occurrence of pulmonary fibrosis by regulating transforming growth factor-beta 1/Smad3 signaling pathway

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