吲哚丙酸抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤

doi:10.12307/2024.713

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (31): 5010-5016.doi: 10.12307/2024.713

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

吲哚丙酸抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤

滕益霖1，席德双1，冯彦斌1，梁宇1，2，邓豪3，曾高峰4，宗少晖1

1广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530000；2广西医科大学第三附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530000；广西医科大学，3再生医学与医用生物资源开发应用省部共建协同创新中心，4公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2023-08-21 接受日期:2023-10-12 出版日期:2024-11-08 发布日期:2024-01-22
通讯作者: 宗少晖，教授，主任医师，博士生导师，广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:滕益霖，男，1997年生，广西壮族自治区钦州市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科学、骨组织工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82060399)，项目负责人：宗少晖；广西自然科学基金项目(2023GXNSFDA026050)，项目负责人：宗少晖；广西医学高层次骨干人才培养“139”计划，项目负责人：宗少晖

Indolepropionic acid inhibition of microglial cell M1 polarization for treatment of spinal cord injury

Teng Yilin1, Xi Deshuang1, Feng Yanbin1, Liang Yu1, 2, Deng Hao3, Zeng Gaofeng4, Zong Shaohui1

1Department of Spine Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Spine Surgery, Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Collaborative Innovation Center of Regenerative Medicine and Medical Bioresource Development and Application Co-constructed by the Province and Ministry, Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 4School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-08-21 Accepted:2023-10-12 Online:2024-11-08 Published:2024-01-22
Contact: Zong Shaohui, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Teng Yilin, Master candidate, Department of Spine Surgery, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82060399 (to ZSH); Guangxi Natural Science Foundation, No.2023GXNSFDA026050 (to ZSH); “139” Plan for Cultivating High-Level Backbone Talents in Guangxi Zhuang Autonomous Region (to ZSH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

M1表型小胶质细胞：可释放大量的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮等神经毒性物质，导致脊髓损伤后炎症反应的持续发展，并进一步损害脊髓组织。
吲哚丙酸：一种肠道菌群色氨酸代谢产物，被证实可减轻中枢神经系统炎症、肠道炎症环境及促进周围神经损伤后轴突再生。

背景：吲哚丙酸被证明可减轻糖尿病所致的中枢神经系统炎症，但其能否抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤，目前仍缺乏相关研究。

目的：通过细胞实验及动物实验探究吲哚丙酸抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤的机制。
方法：①体外实验：CCK8法检测BV2细胞活性并筛选最佳的吲哚丙酸使用浓度；然后将BV2细胞分为对照组、单纯给药组(50 μmol/L吲哚丙酸)、脂多糖组(100 ng/mL脂多糖)、治疗组(100 ng/mL脂多糖+50 μmol/L吲哚丙酸)，采用 Griess 法检测一氧化氮含量；实时荧光定量PCR、Western Blot检测促炎相关因子的mRNA和蛋白的表达；细胞免疫荧光染色检测诱导型一氧化氮合酶的表达；Seahorse实验检测BV2细胞糖酵解压力水平。②体内实验：将30只SD大鼠随机分成3组：假手术组、脊髓损伤组、吲哚丙酸组。采用BBB评分与斜板实验评估大鼠脊髓损伤后功能恢复情况；免疫荧光染色检测脊髓组织中小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶的表达情况；ELISA检测脊髓组织中促炎因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α蛋白表达水平。

结果与结论：①体外实验：当吲哚丙酸浓度> 50 μmol/L时明显抑制BV2细胞活性；吲哚丙酸可通过抑制核因子κB信号通路的激活，进而抑制促炎因子(白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α)及BV2细胞M1极化标志物诱导型一氧化氮合酶的mRNA及蛋白表达水平；吲哚丙酸能明显降低脂多糖诱导BV2细胞的糖酵解水平。②体内实验：脊髓损伤大鼠给予吲哚丙酸干预后，BBB评分与斜板实验角度明显增加；脊髓组织中M1极化小胶质细胞的数量显著下降及促炎因子(白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α)蛋白表达水平明显降低。③结果说明，吲哚丙酸可通过抑制小胶质细胞M1极化改善炎症微环境促进脊髓损伤后功能恢复。

https://orcid.org/0009-0005-2265-1159 (滕益霖)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 吲哚丙酸, 脊髓损伤, 小胶质细胞, M1极化, 促炎因子, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Indolepropionic acid has been shown to reduce diabetes-induced central nervous system inflammation. However, there is a lack of research on whether to inhibit microglia M1 polarization for the treatment of spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of indolepropionic acid inhibition of microglial cell M1 polarization for the treatment of spinal cord injury through cell and animal experiments.
METHODS: (1) In vitro experiments: BV2 cell viability was assessed using the CCK-8 assay to determine optimal concentrations of indolepropionic acid. Subsequently, BV2 cells were categorized into control group, administration group (50 μmol/L indolepropionic acid), lipopolysaccharide group (100 ng/mL lipopolysaccharide), and treatment group (100 ng/mL lipopolysaccharide + 50 μmol/L indolepropionic acid). Nitric oxide content was quantified using the Griess method. Real-time quantitative PCR and western blot assay were employed to measure mRNA and protein levels of pro-inflammatory factors. Cell immunofluorescence staining was conducted to assess inducible nitric oxide synthase expression. The Seahorse assay was employed to assess glycolytic stress levels in BV2 cells. (2) In vivo experiments: 30 SD rats were randomly divided into three groups: sham surgery group, spinal cord injury group, and indolepropionic acid group. Motor function recovery in rats after spinal cord injury was assessed using BBB scoring and the inclined plane test. Immunofluorescence staining of spinal cord tissue was conducted to evaluate the expression of inducible nitric oxide synthase in microglial cells. ELISA was employed to measure protein expression levels of the pro-inflammatory cytokines interleukin-1β and tumor necrosis factor-α in spinal cord tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiments: Indolepropionic acid exhibited significant suppression of BV2 cell viability when its concentration exceeded 50 μmol/L. Indolepropionic acid achieved this by inhibiting the activation of the nuclear factor κB signaling pathway, thereby suppressing the mRNA and protein expression levels of pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β and tumor necrosis factor-α), as well as the M1 polarization marker, inducible nitric oxide synthase, in BV2 cells. Additionally, indolepropionic acid notably reduced the glycolytic level in BV2 cells induced by lipopolysaccharides. (2) In vivo experiments: Following indolepropionic acid intervention in spinal cord injury rats, there was a noticeable increase in BBB scores and the inclined plane test angle. There was also a significant decrease in the number of M1-polarized microglial cells in spinal cord tissue, accompanied by a marked reduction in the protein expression levels of pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β and tumor necrosis factor-α). (3) These results conclude that indolepropionic acid promotes functional recovery after spinal cord injury by improving the inflammatory microenvironment through inhibition of microglia M1 polarization.

Key words: indolepropionic acid, spinal cord injury, microglial cell, M1 polarization, pro-inflammatory factor, signaling pathway

中图分类号:

滕益霖, 席德双, 冯彦斌, 梁宇, 邓豪, 曾高峰, 宗少晖. 吲哚丙酸抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 5010-5016.

Teng Yilin, Xi Deshuang, Feng Yanbin, Liang Yu, Deng Hao, Zeng Gaofeng, Zong Shaohui. Indolepropionic acid inhibition of microglial cell M1 polarization for treatment of spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(31): 5010-5016.

图/表（结果） 9

2.1 CCK-8检测脂多糖、吲哚丙酸对BV2细胞活性的影响结果显示，当脂多糖的质量浓度< 100 ng/mL时，对BV2的细胞活性并无显著性影响(P > 0.05)；脂多糖质量浓度> 100 ng/mL时，对BV2细胞有明显的抑制作用(P < 0.000 1)，见图1A。当吲哚丙酸浓度< 50 μmol/L时，对BV2的细胞活性并无显著性影响(P > 0.05)；吲哚丙酸浓度> 50 μmol/L时，对BV2细胞有明显且成剂量依赖性的抑制作用(P < 0.000 1)，见图1B。在不影响细胞活力的前提下，实验选取100 ng/mL作为脂多糖的使用浓度，50 μmol/L作为吲哚丙酸的使用浓度。

2.2 吲哚丙酸对脂多糖诱导的BV2细胞释放一氧化氮的影响结果表明，与对照组相比，脂多糖组BV2 细胞释放的一氧化氮量明显增多(P < 0.000 1)；与脂多糖组相比，治疗组的一氧化氮释放量明显减少(P < 0.01)，见图2。

2.3 吲哚丙酸对脂多糖诱导BV2细胞释放炎性因子mRNA水平的影响结果显示，与对照组相比，脂多糖组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶的mRNA水平明显上升(P < 0.000 1)；与脂多糖组相比，治疗组上述指标水平明显下降(P < 0.01)，见图3A-C。

2.4 吲哚丙酸对脂多糖诱导BV2细胞释放炎性因子蛋白质水平的影响结果显示，与对照组相比，脂多糖组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶、p-P65的蛋白水平明显上升(P < 0.000 1)；治疗组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶、p-P65的蛋白水平明显下降(P < 0.05)，见图4A-E。

2.5 吲哚丙酸对BV2细胞M1极化的影响结果显示，与对照组相比，脂多糖组诱导型一氧化氮合酶平均荧光强度明显上升(P < 0.000 1)；与脂多糖组相比，治疗组诱导型一氧化氮合酶平均荧光强度明显下降(P < 0.05)，见图5A，B。

2.6 吲哚丙酸对脂多糖诱导BV2细胞的糖酵解水平的影响结果显示，与对照组相比，脂多糖组糖酵解水平明显上升 (P < 0.000 1)；与脂多糖组相比，治疗组糖酵解水平明显下降(P < 0.01)，见图6A，B。

2.7 BBB评分及斜板实验结果
2.7.1 实验动物数量分析 3组大鼠共30只，实验过程无死亡，全部进入结果分析。
2.7.2 BBB评分所有SD大鼠术前BBB评分均为满分。脊髓损伤组和吲哚丙酸组大鼠术后第1天 BBB 评分均为0分，呈截瘫状态；术后第3天起，所有大鼠后肢功能开始逐步恢复；术后第5天起，吲哚丙酸组大鼠的每一个时间点的BBB评分均高于脊髓损伤组(P < 0.05)，见图7A。
2.7.3 斜板实验结果斜板实验的结果与BBB评分结果一致，与脊髓损伤组相比，吲哚丙酸组大鼠稳定保持更大的倾斜角度(P < 0.05)，见图7B。

2.8 吲哚丙酸对大鼠脊髓小胶质细胞M1极化的影响结果显示，与假手术组相比，脊髓损伤组诱导型一氧化氮合酶平均荧光强度明显上升(P < 0.001)；与脊髓损伤组相比，吲哚丙酸组诱导型一氧化氮合酶平均荧光强度水平明显下降(P < 0.05)，见图8A，B。

2.9 吲哚丙酸对大鼠脊髓组织免疫微环境的影响结果显示，与假手术组相比，脊髓损伤组的白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α蛋白表达量明显上升(P < 0.000 1)；与脊髓损伤组相比，吲哚丙酸组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α蛋白表达量水平明显下降(P < 0.05)，见图9A，B。

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引言

脊髓损伤是由于脊髓组织结构被机械性破坏，导致运动、感觉和自主神经功能障碍的中枢神经系统疾病[1]。脊髓损伤的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤[2]。原发性损伤是由各种原因直接作用于脊髓导致的机械损伤；继发性损伤是一种多因素共同作用的过程，其中包括局部血流障碍、组织缺血缺氧、神经炎症等一系列病理生理变化[3]。在脊髓损伤亚急性期，神经元机械损伤导致热休克蛋白与嘌呤代谢物等因子被大量释放，进而促使多种免疫细胞出现过度活化并释放大量促炎因子，这些复杂的炎症微环境变化导致多种信号通路被激活并正反馈调节促炎因子的释放，进而破坏损伤处周围的正常组织及细胞，导致继发性损伤区域不断朝更高的脊髓节段扩大，最终对脊髓组织造成不可逆转的损害，甚至可能会导致脊髓永久性功能丧失[4–7]。由此看来，尽早改善炎症微环境是治疗脊髓损伤的关键策略。
小胶质细胞是中枢神经系统最丰富的免疫细胞，在维持中枢神经系统免疫微环境中起重要作用[8]。脊髓损伤发生后，损伤处的微环境发生剧烈变化，导致小胶质细胞大量聚集并极化为促炎表型小胶质细胞(M1表型)[9-10]。M1表型小胶质细胞释放大量的肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮等神经毒性物质，导致炎症反应的持续发展，并进一步损害脊髓组织[11]。因此，限制小胶质细胞M1极化并抑制其释放大量免疫炎性因子是治疗脊髓损伤的关键环节[12]。
吲哚丙酸(Indolepropionic acid，IPA)是肠道革兰阳性梭菌代谢色氨酸的产物之一。研究表明，吲哚丙酸可通过减少促炎因子的表达而促进肠道上皮屏障修复[13]。不仅如此，吲哚丙酸还被证明可以促进周围神经再生和修复[14]，这意味着吲哚丙酸在神经损伤的治疗和改善炎症微环境中可能扮演着关键角色。然而，尽管吲哚丙酸在治疗脊髓损伤方面展现出巨大的潜力，但目前国内外尚未有相关的报道和研究成果。此次研究结合国内外研究现状，通过体外、体内实验探索吲哚丙酸抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤的机制，为治疗脊髓损伤提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物、细胞实验，两样本均数采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年5月至2023年8月在广西医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞株 BV2小胶质细胞株，购于上海誉驰生物科技有限公司。
1.3.2 实验动物 30只6-8周龄的雌性SD大鼠，体质量(200±20) g，生产许可证号：SCXK桂2020-0004，由广西医科大学动物实验中心提供。饲养于SPF级动物实验室，温度22-26 ℃，湿度50%-70%，采用12 h间隔光照模拟昼夜循环，适应性喂养7 d后开始实验。实验期间自由饮食。
该动物实验经广西医科大学实验动物伦理委员会批准(202305060)，动物的饲养及处理均符合国内外伦理学要求。为最大限度减少实验动物的痛苦程度及死亡率，手术过程中全程使用异氟烷进行麻醉，术后如果动物遭受的痛苦超过预期，将及时对动物实施安乐死，以减少动物痛苦时间。
1.3.3 主要实验试剂胎牛血清购自中国VivaCell；吲哚丙酸购自德国Merck公司；DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司；Seahorse XFe 24试剂盒购自美国Agilent公司；核因子κB (Nuclear factor kappa-B NF-κB，P65)、磷酸化P65(phospho-P65，p-P65)一抗购自美国CST公司；白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶一抗购自英国Abcam公司；一抗β-肌动蛋白(β-Actin)及Iba-1，二抗Alexa Fluor® 488-conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)及Cy3 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)购自中国赛维尔公司；白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α酶联免疫分析试剂盒购自中国酶联生物公司；反转录试剂盒购自中国启衡星公司；Roche FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)购自瑞士Roche公司； Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody，DyLight™ 800 4X PEG购自美国赛默飞公司；一氧化氮检测试剂盒、脂多糖、CCK-8试剂盒购自中国索莱宝公司。
1.4 实验方法
1.4.1 培养BV2及实验分组培养小胶质细胞株BV2：使用含体积分数为10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM/F-12完全培养基，培养环境为37 ℃、体积分数5%CO2，每隔2 d更换完全培养基，细胞融合度约为90%时进行传代。实验分为4组：BV2细胞不作任何处理作为对照组，单纯使用50 μmol/L吲哚丙酸干预BV2细胞作为单纯给药组，单纯使用100 ng/mL脂多糖干预BV2细胞作为脂多糖组，使用100 ng/mL脂多糖和50 μmol/L吲哚丙酸共同干预BV2细胞作为治疗组。
1.4.2 细胞增殖-毒性检测通过CCK-8测定BV2细胞活性。将BV2细胞以5×103个/孔的密度接种在96孔板上，每孔100 μL，培养24 h待细胞贴壁后，分别使用不同质量浓度的脂多糖(0，25，50，100，250，500，1 000 ng/mL)及不同浓度吲哚丙酸(0，5，10，25，50，100，200 μmol/L)干预24 h。随后每孔加入10 μL CCK-8缓冲液，放置在培养箱中避光孵育一两个小时，用酶标仪在450 nm波长处检测每个孔的吸光度。
1.4.3 一氧化氮浓度检测将BV2细胞按1×105个/孔的密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h待其贴壁后，根据BV2细胞的不同分组予以不同的药物干预24 h，随后收集各组BV2细胞上清液。取96孔板并加入50 μL标准品及样品，随后分别加入50 μL Griess ReagentⅠ和 Griess ReagentⅡ溶液，室温孵育30 min后，用酶标仪在540 nm波长处检测每个孔的吸光度。根据标准品曲线计算样品中一氧化氮浓度。

1.4.4 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR) 将BV2细胞1×105个/孔的密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h待其贴壁后，根据实验分组予以不同的药物干预24 h。用Trizol试剂提取细胞总RNA并反转录成cDNA，进行qPCR。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，反应周期为95 ℃ 10 min，40个循环(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s)，最后在72 ℃延伸90 s。用2-ΔΔCT (Livak)法检测每个基因的mRNA表达水平。各引物序列信息见表1。

1.4.5 蛋白质免疫印迹裂解BV2细胞并提取总蛋白，各组蛋白样品取30 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，220 mA恒流转膜120 min将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭120 min，4 ℃下孵育一抗过夜，所有一抗按1∶1 000稀释。使用Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody，DyLight™ 800 4X PEG避光室温孵育1 h，二抗按1∶20 000稀释，随后使用TBST漂洗条带后在曝光机上显影。检测炎症相关蛋白白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶及NF-κB信号通路关键蛋白P65、p-P65的表达，以β-Actin为内参。
1.4.6 BV2细胞免疫荧光将BV2细胞按5×104个/孔的密度接种于25 mm直径的细胞爬片，每孔2 mL，培养24 h待其贴壁。随后根据BV2细胞的不同分组予以不同的药物干预24 h。干预结束后，使用40 g/L的多聚甲醛在室温下固定细胞15 min；0.5% Triton X-100在室温进行细胞通透20 min；体积分数5%山羊血清室温封闭30 min；4 ℃下孵育一抗诱导型一氧化氮合酶 12 h以上，一抗按1∶500稀释；加入荧光二抗Cy3 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)后室温避光孵育1 h，二抗按1∶200稀释；每张细胞爬片滴入适量含DAPI的抗荧光淬灭剂封固；在荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.7 Seahorse细胞能量代谢分析将BV2细胞按5×103个/孔的密度接种于Seahorse XFe专用细胞培养板中，每孔500 μL，培养24 h待其贴壁后根据不同分组予以不同药物处理24 h。参照试剂检测盒操作指南进行实验。将原有完全培养基从细胞培养板中吸出并更换Seahorse专用检测液，每孔500 μL。在37 ℃、无CO2的细胞培养箱中孵育1 h后上机检测。
1.4.8 构建脊髓损伤动物模型通过改良Allen’s 击打法建立脊髓损伤模型。SD大鼠吸入异氟烷麻醉后，取俯卧位固定于手术台，以T10为中心点，切开皮肤3.0-4.0 cm，逐层分离肌肉及软组织，打开椎板暴露脊髓，使用质量约为10 g的克氏针于4 cm高度进行垂直击打，大鼠出现鼠尾无规则摆动、身体痉挛抽搐以及硬脊膜出现血肿提示模型建立成功，随后伤口进行缝合处理[15]。
1.4.9 动物实验分组将30只(200±20) g的SD大鼠随机分成3组，假手术组、脊髓损伤组、吲哚丙酸组。假手术组大鼠只打开椎板不击打脊髓组织。脊髓损伤组与吲哚丙酸组大鼠均进行脊髓组织击打处理。吲哚丙酸组大鼠在术后予吲哚丙酸每日灌胃1次，连续2周，吲哚丙酸灌胃剂量为20 mg/kg。

假手术组与脊髓损伤组大鼠予生理盐水灌胃。术后14 d处死大鼠取材。

1.4.10 BBB评分与斜板实验术后1，3，7 ，10，14 d使用BBB(Basso-Beattie-Bresnaha)评分及斜板实验评估大鼠脊髓损伤恢复情况。采用3人双盲法，分别观察各组大鼠的活动情况并根据BBB评分表打分，观察人员均非该实验组人员。BBB评分表0-7分反映早期后肢关节运动恢复情况，8-13分反映步态和前后肢协调运动恢复情况，14-21分反映优势爪的精细运动恢复情况，BBB评分表的分数越高代表运动功能恢复情况越好。斜板实验则是将脊髓损伤大鼠放置于斜板实验操作平台上，大鼠利用板面的摩擦力来保持自身位置不滑落，通过不断调整斜板与水平面之间的夹角，观察并记录脊髓损伤大鼠在斜面上保持5 s内不滑落的最大角度。
1.4.11 脊髓组织免疫荧光将脊髓组织切片室温下复温1 h，60 ℃ 烘片45 min，加入 0.5% TritonX-100 与 1%BSA 溶液封闭 1 h；加入一抗Iba-1、诱导型一氧化氮合酶，置于 4 ℃孵育12 h以上，一抗均按1∶500稀释；加入荧光二抗Alexa Fluor® 488-conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)和Cy3 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)后室温避光孵育 1 h，二抗均按1∶200稀释。滴入适量含DAPI的抗荧光淬灭剂后使用盖玻片封固。随后在荧光显微镜下观察并采集图像。
1.4.12 酶联免疫吸附实验从-80 ℃冰箱中取出组织匀浆，参照Elisa试剂盒说明书进行实验。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；样本孔先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL。随后用封板膜封板后于37 ℃孵育1 h。分别加入显色剂A，B各50 μL于37 ℃孵育15 min，最后每孔滴加50 μL终止溶液。用酶标仪在450 nm波长处检测每个孔的吸光度。根据标准品曲线计算样品浓度。
1.5 主要观察指标 ①脂多糖、吲哚丙酸对BV2细胞活性的影响；②吲哚丙酸对脂多糖诱导的BV2细胞释放一氧化氮的影响；③吲哚丙酸对脂多糖诱导BV2细胞释放炎性因子mRNA和蛋白水平的影响；④吲哚丙酸对BV2细胞M1极化的影响；⑤吲哚丙酸对脂多糖诱导BV2细胞的糖酵解水平的影响；⑥各组大鼠BBB评分及斜板实验结果；⑦吲哚丙酸对大鼠脊髓小胶质细胞M1极化的影响；⑧吲哚丙酸对大鼠脊髓组织免疫微环境的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0进行数据分析。对于符合正态分布的计量资料，使用x±s表示。两组间比较应用t检验(t test)，多组间比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA)，选用LSD-t检验进行组间比较，P < 0.05时表示差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

脊髓继发性损伤在脊髓损伤的发病机制中起着至关重要的作用[16-17]。脊髓继发性损伤发生在原发性损伤后的几分钟至几周内，并伴有炎症反应，其特征是小胶质细胞活化并大量极化为M1表型，释放大量的促炎因子形成炎性因子风暴，从而对脊髓损伤处的组织和细胞造成不可逆的伤害，进一步加重脊髓损伤[18-19]。因此，抑制小胶质细胞M1极化是治疗脊髓损伤的关键策略。吲哚丙酸是肠道菌群色氨酸代谢产物之一，已被证实外源性补充吲哚丙酸可减轻糖尿病所致的中枢神经系统炎症[20]。此外，吲哚丙酸还可以通过抑制PI3K/ AKT/mTOR信号通路改善肠道炎症环境[13]。因此推测吲哚丙酸的抑炎作用在亚急性期治疗脊髓损伤拥有十分可观的应用前景。此次研究通过多种实验手段探索吲哚丙酸治疗脊髓损伤的作用机制，发现吲哚丙酸可以抑制小胶质细胞M1极化及其介导的炎症反应进而改善紊乱的脊髓微环境，促进脊髓损伤运动功能恢复。
肠道菌群代谢产物是探索新型药物的重要源泉。研究表明补充肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸可以有效降低脊髓损伤大鼠促炎因子的表达水平，发挥神经保护作用并促进脊髓损伤恢复[21]。SERGER等[14]构建外周神经系统损伤模型并采取间歇性禁食干预，随后测定模型组的肠道菌群及其代谢产物后发现，吲哚丙酸在间歇性禁食干预后的含量变化最为显著，外源性补充吲哚丙酸可以促进脊髓背根节中性粒细胞的趋化，从而促进神经元轴突再生。因此，为进一步开发吲哚丙酸在治疗脊髓损伤中的潜能，给脊髓损伤大鼠外源性补充吲哚丙酸后发现其运动功能有所改善；随后使用Elisa检测大鼠脊髓组织，结果发现补充吲哚丙酸可以有效降低脊髓损伤大鼠的炎症水平。
小胶质细胞是中枢神经系统中反应最快的免疫细胞，在正常生理条件下处于M0 表型，发挥“免疫监视”作用[22-23]。当脊髓损伤发生后，神经元的机械损伤导致嘌呤代谢物和热休克蛋白等因子被释放，导致小胶质细胞被募集到脊髓损伤部位并从M0表型极化为M1表型并释放大量促炎因子[24]。M1表型小胶质细胞可高表达诱导型一氧化氮合酶，导致大量的一氧化氮被合成与释放，被释放的一氧化氮不仅作为一种信号分子，影响细胞间通信和免疫细胞的活性，还可能与氧自由基反应并产生氮自由基，导致氧化应激损伤，进一步加重神经元损伤[25]。随着不断深入认识小胶质细胞在脊髓损伤发病机制中的重要作用，越来越多研究聚焦于通过调控小胶质细胞治疗脊髓损伤[26-27]。此次体外实验发现，使用吲哚丙酸干预脂多糖诱导的BV2细胞后，可以有效抑制一氧化氮、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α及诱导型一氧化氮合酶的表达。在脊髓损伤的应激状态下，NF-κB信号通路会被激活并促使多种细胞释放大量炎性物质，破坏脊髓组织微环境[28]。因此，此次研究检测了NF-κB信号通路的关键蛋白P65的表达水平，发现各组间P65的表达水平并无明显差异，进一步检测P65的磷酸化水平发现脂多糖组p-P65表达水平显著上升，治疗组的p-P65表达水平低于脂多糖组。推测使用脂多糖或者吲哚丙酸可能对细胞中P65含量的影响比较小，但是可以显著影响P65的磷酸化。P65的磷酸化水平可调节NF-κB信号通路[29]。由此可见，脂多糖上调了NF-κB信号通路，促使BV2细胞释放大量炎症因子；使用吲哚丙酸干预后，发现p-P65的表达水平显著下降，这提示吲哚丙酸可能下调了NF-κB信号通路进而抑制炎症因子的释放。诱导型一氧化氮合酶在不同极化表型的小胶质细胞中表达水平不同，M1型小胶质细胞会大量合成诱导型一氧化氮合酶，所以诱导型一氧化氮合酶通常被视为小胶质细胞M1极化标志物之一[30]。此次实验结果表明p-P65与诱导型一氧化氮合酶之间存在一定的相关性，因此推测吲哚丙酸可能通过降低NF-κB信号通路表达进而抑制小胶质细胞进行M1极化。通过免疫荧光染色观察大鼠脊髓组织，发现脊髓损伤组的小胶质细胞在损伤组织聚集较正常大鼠明显增多，同时被诱导型一氧化氮合酶标记的小胶质细胞即M1表型小胶质细胞明显增多；脊髓损伤大鼠给予吲哚丙酸干预后，小胶质细胞聚集及M1表型小胶质细胞数量明显下降。
巨噬细胞的活化过程需要经历一系列复杂的能量代谢重编程[31]。能量代谢维持细胞内外信号传导的激活，并在免疫应答中发挥关键作用[32]。例如：2-脱氧葡萄糖可以抑制巨噬细胞糖酵解进程并改善线粒体功能，进而减少炎症因子的分泌[33]。小胶质细胞作为中枢神经系统中含量最丰富的巨噬细胞之一，自然也要历经这一复杂的过程。有研究指出，小胶质细胞可以通过调节代谢途径进行代谢重编程，进而转换其极化表型并发挥不同的功能[34-35]。M1型小胶质细胞与肿瘤细胞中的“Warburg 效应”相似，葡萄糖在氧气充足条件下也会被优先用于进行糖酵解，导致大量乳酸堆积，进而抑制三羧酸循环，影响线粒体细胞呼吸功能，进一步促进小胶质细胞极化为M1表型[36]。通过糖酵解压力测试实时检测BV2细胞外酸化速率发现，脂多糖诱导BV2细胞可以提升其基础糖酵解能力及最大糖酵解能力，这表明脂多糖处理BV2细胞后，细胞处于高度活化状态，对能量需求巨大，此时BV2细胞大量极化为M1型。采用吲哚丙酸干预后，BV2细胞的上述两种能力均有不同程度的下降，表明吲哚丙酸可以调控BV2细胞糖酵解水平，促进其进行代谢重编程，进而抑制BV2细胞M1极化。
此项研究初步阐明吲哚丙酸在脊髓损伤中对小胶质细胞M1极化的影响及作用机制。然而也存在不足之处：尚未明确吲哚丙酸是否能促使M1型小胶质细胞极化为M2型小胶质细胞。M2型小胶质细胞可以释放生长因子，重塑受损的突触[37]。进一步探究吲哚丙酸对小胶质细胞M2极化的影响可以充分发掘吲哚丙酸治疗脊髓损伤的潜在应用价值。
综上所述，研究证明了吲哚丙酸可以通过下调NF-κB信号通路抑制小胶质细胞M1极化，减轻继发性脊髓损伤，促进脊髓损伤运动功能恢复。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

吲哚丙酸抑制小胶质细胞M1极化治疗脊髓损伤

Indolepropionic acid inhibition of microglial cell M1 polarization for treatment of spinal cord injury

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