骨关节炎的氧化应激相关基因和免疫浸润分析

doi:10.12307/2025.245

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 302-311.doi: 10.12307/2025.245

• 组织工程相关大数据分析 Big data analysis in tissue engineering • 上一篇下一篇

骨关节炎的氧化应激相关基因和免疫浸润分析

吴傲1，于鹏1，滕加文2，孔鹏2，卞泗善2

1山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250000；2山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250000

收稿日期:2024-01-17 接受日期:2024-02-22 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-24
通讯作者: 卞泗善，博士，主任医师，山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250000
作者简介:吴傲，男，1999年生，安徽省宿州市人，汉族，山东中医药大学在读硕士，主要从事骨与关节疾病机制的研究。

Analysis of oxidative stress-related genes and immune infiltration in osteoarthritis

Wu Ao1, Yu Peng1, Teng Jiawen2, Kong Peng2, Bian Sishan2

1The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China; 2Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China

Received:2024-01-17 Accepted:2024-02-22 Online:2025-01-18 Published:2024-05-24
Contact: Bian Sishan, MD, Chief physician, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China
About author:Wu Ao, Master candidate, The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250000, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化应激：是指氧化和抗氧化系统失衡，生物分子如脂质和蛋白质等受到过量的活性氧和活性氮的氧化作用，造成机体过度氧化，引起细胞功能混乱和组织受损。
骨关节炎：是一种慢性疾病，会导致软骨和周围组织受损，以疼痛、僵硬和关节功能丧失为特点。

背景：目前对于骨关节炎的发病机制尚不清楚，缺乏有效控制疾病的手段，且研究多集中在免疫领域，对氧化应激领域研究较少。
目的：探索氧化应激与免疫浸润在骨关节炎中的作用，并预测相关miRNA和治疗药物。
方法：从GEO数据库中获取GSE55235数据集(10例骨关节炎样本和10例健康对照样本)和GSE55457数据集(10例骨关节炎样本和10例健康对照样本)进行合并，获取差异表达基因，并结合氧化应激基因得到差异表达氧化应激基因。对差异表达氧化应激基因进行KEGG、GO富集分析，并使用GSEA富集分析评价骨关节炎通路和生物过程。使用STRING在线平台和Cytoscape软件建立了蛋白质相互作用网络，运行Degree算法得到关键基因，从GEO数据库中获取GSE1919作为验证数据集，对关键基因进行差异分析及受试者工作特征曲线分析，得到核心基因。此外，用CIBERSORT对免疫浸润进行评估，并探索核心基因与免疫细胞的相关性，使用TargetScan对核心基因进行miRNA预测及使用DSigDB数据库对靶点药物进行预测。
结果与结论：①确定了65个差异表达氧化应激基因和5个核心基因(IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN)；②富集分析结果显示，差异表达氧化应激基因的主要聚焦点包括氧化应激、白细胞介素17、破骨细胞分化、流体剪切应力以及动脉粥样硬化等通路；③5个核心基因的受试者工作特征曲线下面积均> 0.85，说明对诊断骨关节具有良好的特异性和敏感性，且与免疫细胞密切关联；④miRNA的预测结果是
hsa-miR-3937，治疗小分子药物包括二甲双胍、离子霉素和塞来昔布等。结果表明：骨关节炎中存在氧化应激与免疫浸润，且免疫浸润参与激活氧化应激。核心基因及预测的miRNA可作为诊断骨关节炎的新型标志物，预测的小分子药物可治疗骨关节炎。
https://orcid.org/0009-0004-2571-8454(吴傲)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 氧化应激, 免疫浸润, 差异基因, 生物标志物, miRNA, 药物预测

Abstract: BACKGROUND: At present, the pathogenesis of osteoarthritis is still unclear, and there is a lack of effective means to control the disease. Research on osteoarthritis is mostly concentrated in the field of immunity, and there are few studies in the field of oxidative stress.
OBJECTIVE: To explore the roles of oxidative stress and immune infiltration in osteoarthritis and to predict related miRNAs and therapeutic agents.
METHODS: The GSE55235 dataset (10 samples of osteoarthritis and 10 healthy control samples) and the GSE55457 dataset (10 samples of osteoarthritis and 10 healthy control samples) were obtained from the GEO database for merging to obtain their differentially expressed genes that were combined with oxidative stress genes to get the differentially expressed genes of oxidative stress. The differentially expressed genes of oxidative stress were analyzed for KEGG and GO enrichment, and the osteoarthritis pathways and biological processes were evaluated using GSEA enrichment analysis. The protein-protein interaction network was constructed using the STRING online website and Cytoscape software, and the Degree algorithm was run to get the key genes. The GSE1919 dataset was obtained from the GEO database as a validation dataset, and the key genes were analyzed by variance analysis and receiver operating characteristic curve analysis to get the core genes. In addition, immune infiltration was evaluated by CIBERSORT and the correlation between core genes and immune cells was explored. miRNA prediction of core genes was performed using TargetScan and target drugs were predicted using the DSigDB database.
RESULTS AND CONCLUSION: Sixty-five differentially expressed genes and five core genes (IL1B, CXCL8, MYC, NFKBIA, JUN) associated with oxidative stress were identified. Enrichment analysis showed that differentially expressed genes associated with oxidative stress were concentrated in the pathways of oxidative stress, interleukin-17, osteoclast differentiation, fluid shear stress and atherosclerosis. The area under the receiver operating characteristic curve for the five core genes exceeded 0.85, indicating their excellent specificity and sensitivity in diagnosing bone and joint conditions, as well as their close association with immune cells. The predicted miRNA was has-miR-3937, and the therapeutic small-molecule drugs were metformin, ionomycin and celecoxib. To conclude, oxidative stress and immune infiltration exist in osteoarthritis, and immune infiltration is involved in activating oxidative stress. The core genes and predicted miRNAs can be used as novel markers for the diagnosis of osteoarthritis, and small molecule drugs are predicted to treat osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, oxidative stress, immune infiltration, differentially expressed gene, biomarker, miRNA, drug prediction

中图分类号:

吴傲, 于鹏, 滕加文, 孔鹏, 卞泗善. 骨关节炎的氧化应激相关基因和免疫浸润分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 302-311.

Wu Ao, Yu Peng, Teng Jiawen, Kong Peng, Bian Sishan. Analysis of oxidative stress-related genes and immune infiltration in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 302-311.

图/表（结果） 11

2.1 差异表达基因和差异表达氧化应激基因获取对GSE55235和GSE55457数据集进行去除批次效应处理(图2A)，成功筛选出459个差异表达基因，其中227个上调基因，232个下调基因，并用热图及火山图对差异表达基因进行可视化(图2B，C)。此外，根据Relevance score≥7，获取到了1 216个氧化应激基因，通过取交集得到65个差异表达氧化应激基因(图2D)，其中19个上调基因，46个下调基因。
2.2 富集分析结果为了确定差异表达氧化应激基因的生物学功能，进行KEGG和GO富集分析，KEGG分析发现(图3A)，差异表达氧化应激基因在信号通路方面表现出显著的富集，包括白细胞介素17、破骨细胞分化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子等信号通路；GO分析发现(图3B-D)，差异表达氧化应激基因在对氧化应激、脂多糖、细菌来源分子、皮质类固醇、糖皮质激素的反应和老化等生物学过程方面呈现富集现象。它们还在核常染色质、常染色质、细胞器外膜等细胞学组分中高度存在。此外，它们还具有细胞因子、信号受体激活剂、DNA结合转录因子等多种分子功能。为了进一步探索与差异表达氧化应激相关的生物学途径，GSEA分析发现主要富集在溶酶体的自噬、MAPK信号通路、免疫反应等途径(图4)。
2.3 蛋白互作网络构建与关键基因的确定将差异表达氧化应激基因导入STRING，过滤得到蛋白互作网络(图5A)，由60个节点和453条边组成；使用Cytoscape软件中CytoHubba插件的Degree算法得到前10名为关键基因(图5B)，包括IL6、MMP9、IL1B、PTGS2、EGR1、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN、FOS；将蛋白互作网络中的关键模块进行分析，采用MCODE插件，选取分数最高(Score=18.815)的模块(图5C)，该模块由28个节点和254条边组成，模块中心部分由IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN等组成。
2.4 核心基因的鉴定使用验证数据集GSE1919对关键基因进行差异分析及ROC曲线分析，设置P < 0.05；分析得到豆荚图(图6)及ROC曲线图(图7)；具有差异性的基因(P < 0.05)包括IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN；其中IL1B、MYC和NFKBIA的
ROC曲线下面积为1.00，说明其预测骨关节炎的准确性接近完美，CXCL8和JUN的ROC曲线下面积皆 > 0.85，说明其预测骨关节炎的准确率也非常高。综合分析得到核心基因为IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN，显示它们对骨关节炎的敏感性和差异性显著，具备诊断骨关节炎的能力。
2.5 免疫浸润分析设置P < 0.05，采用CIBERSORT对包含20例骨关节炎患者和20例健康对照样本的实验数据集进行免疫细胞组成分析，图8呈现出每个样本中22种免疫细胞的比例，通过柱状图展示。图9中的CIBERSORT分析结果显示，嗜酸性粒细胞与活化树突状细胞表现出最强的正相关性，而活化肥大细胞和静息肥大细胞则表现出最强的负相关性。同时，免疫细胞箱线图显示(图10)：健康对照样本中的活化肥大细胞、活化NK细胞和静息记忆CD4 T细胞的数量相对较高，而骨关节炎患者的静息肥大细胞、记忆B细胞、浆细胞和滤泡辅助T细胞的数量相对较高。这些免疫细胞可能与骨关节炎的发展息息相关。
2.6 核心基因与免疫细胞的相关性基于P < 0.05，探究核心基因(IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN)与免疫细胞的相关性。根据结果展示(图11)，IL1B与活化肥大细胞、中性粒细胞、静息记忆CD4 T细胞之间存在正相关，而与巨噬细胞M2、静息肥大细胞、调节性T细胞之间呈现负相关关系。CXCL8与活化肥大细胞、活化NK细胞、静息记忆CD4 T细胞、中性粒细胞之间呈现正相关关系，然而与静息肥大细胞、浆细胞之间则呈现负相关关系。同样地，MYC与活化肥大细胞、活化NK细胞、静息记忆CD4 T细胞之间存在正相关，而与巨噬细胞M2、静息肥大细胞、浆细胞之间则存在负相关。此外，NFKBIA与巨噬细

胞M1、活化肥大细胞、活化NK细胞、静息记忆CD4 T细胞之间存在正相关，然而与巨噬细胞M2、静息肥大细胞、浆细胞之间则存在负相关。进一步分析发现，JUN与静息记忆CD4 T细胞、活化NK细胞、活化肥大细胞之间存在正相关，然而与浆细胞、记忆B细胞、静息肥大细胞之间则存在负相关。
2.7 miRNA及小分子药物预测通过TargetScan数据库，对核心基因进行miRNA预测，设置P < 0.05，得到hsa-miR-3937。从DSigDB数据库中获得了约1 400种小分子药物，按照P值筛选出前10名小分子药物，依次为二甲双胍(metformin)、离子霉素(ionomycin)、塞来昔布(celecoxib)、呕吐毒素(DEOXYNIVALENOL)、吡咯烷二硫代甲酸铵(Pyrrolidine dithiocarbamate)、
吡唑蒽酮(1，9-Pyrazoloanthrone)、芸香苷(RUTIN)、香草乙酮(Acetovanillone)、
辣椒素(Capsaicin)和长春花碱
(vinblastine)，与核心基因相关性见图12，柱状图见图13，详细信息见表1。

参考文献

[1] HASEEB A, HAQQI TM. Immunopathogenesis of osteoarthritis. Clin Immunol. 2013; 146(3):185-196.
[2] MOLNAR V, MATIŠIĆ V, KODVANJ I, et al. Cytokines and Chemokines Involved in Osteoarthritis Pathogenesis. Int J Mol Sci. 2021;22(17):9208.
[3] SIDDIQ MAB, CLEGG D, JANSEN TL, et al. Emerging and New Treatment Options for Knee Osteoarthritis. Curr Rheumatol Rev. 2022;18(1):20-32.
[4] ZHU X, SANG L, WU D, et al. Effectiveness and safety of glucosamine and chondroitin for the treatment of osteoarthritis: a meta-analysis of randomized controlled trials. J Orthop Surg Res. 2018;13(1):170.
[5] MARTEL-PELLETIER J, BARR AJ, CICUTTINI FM, et al. Osteoarthritis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16072.
[6] ASTRIKE-DAVIS EM, CORYELL P, LOESER RF. Targeting cellular senescence as a novel treatment for osteoarthritis. Curr Opin Pharmacol. 2022;64:102213.
[7] FOIS AG, PALIOGIANNIS P, SOTGIA S, et al. Evaluation of oxidative stress biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis and therapeutic applications: a systematic review. Respir Res. 2018;19(1):51.
[8] DAENEN K, ANDRIES A, MEKAHLI D, et al. Oxidative stress in chronic kidney disease. Pediatr Nephrol. 2019;34(6):975-991.
[9] LIU L, LUO P, YANG M, et al. The role of oxidative stress in the development of knee osteoarthritis: A comprehensive research review. Front Mol Biosci. 2022;9:1001212.
[10] BLANCO FJ, VALDES AM, REGO-PÉREZ I. Mitochondrial DNA variation and the pathogenesis of osteoarthritis phenotypes. Nat Rev Rheumatol. 2018;14(6):327-340.
[11] RAJAGOPALAN S, MENG XP, RAMASAMY S, et al. Reactive oxygen species produced by macrophage-derived foam cells regulate the activity of vascular matrix metalloproteinases in vitro. Implications for atherosclerotic plaque stability. J Clin Invest. 1996;98(11):2572-2579.
[12] PETERSEN SV, OURY TD, OSTERGAARD L, et al. Extracellular superoxide dismutase (EC-SOD) binds to type i collagen and protects against oxidative fragmentation. J Biol Chem. 2004;279(14):13705-13710.
[13] SCOTT JL, GABRIELIDES C, DAVIDSON RK, et al.
Superoxide dismutase downregulation in osteoarthritis progression and end-stage disease. Ann Rheum Dis. 2010;69(8):1502-1510.
[14] NEDUNCHEZHIYAN U, VARUGHESE I, SUN AR, et al. Obesity, Inflammation, and Immune System in Osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:907750.
[15] LINDBLAD S, HEDFORS E. Arthroscopic and immunohistologic characterization of knee joint synovitis in osteoarthritis. Arthritis Rheum. 1987;30(10):1081-1088.
[16] SAITO I, KOSHINO T, NAKASHIMA K, et al. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis Cartilage. 2002;10(2): 156-162.
[17] LUAN T, YANG X, KUANG G, et al. Identification and Analysis of Neutrophil Extracellular Trap-Related Genes in Osteoarthritis by Bioinformatics and Experimental Verification. J Inflamm Res. 2023;16:3837-3852.
[18] DUAN ZX, LI YS, TU C, et al. Identification of a potential gene target for osteoarthritis based on bioinformatics analyses. J Orthop Surg Res. 2020;15(1):228.
[19] 徐义峰,柯诗文,李可可,等.氧化应激和免疫浸润在特发性肺纤维化中的作用及中药防治研究[J/OL].中国免疫学杂志,1-10[2024-02-16]. https://link.cnki.net/urlid/22.1126.R.20231208.1514.004
[20] LIBERZON A, BIRGER C, THORVALDSDÓTTIR H, et al. The Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst. 2015;1(6):417-425.
[21] GU X, LAI D, LIU S, et al. Hub Genes, Diagnostic Model, and Predicted Drugs Related to Iron Metabolism in Alzheimer’s Disease. Front Aging Neurosci. 2022;14:949083.
[22] KULESHOV MV, JONES MR, ROUILLARD AD, et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W90-97.
[23] AGARWAL V, BELL GW, NAM JW, et al. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 2015;4: e05005.
[24] YOO M, SHIN J, KIM J, et al. DSigDB: drug signatures database for gene set analysis. Bioinformatics. 2015;31(18):3069-3071.
[25] YUNUS MHM, NORDIN A, KAMAL H. Pathophysiological Perspective of Osteoarthritis. Medicina (Kaunas). 2020; 56(11):614.
[26] SACITHARAN PK. Ageing and Osteoarthritis. Subcell Biochem. 2019;91:123-159.
[27] HARMAN D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol. 1956;11(3):298-300.
[28] BOLDUC JA, COLLINS JA, LOESER RF. Reactive oxygen species, aging and articular cartilage homeostasis. Free Radic Biol Med. 2019;132:73-82.
[29] KIMBALL JS, JOHNSON JP, CARLSON DA. Oxidative Stress and Osteoporosis. J Bone Joint Surg Am. 2021;103(15):1451-1461.
[30] KAPOOR M, MARTEL-PELLETIER J, LAJEUNESSE D, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(1):33-42.
[31] STANNUS O, JONES G, CICUTTINI F, et al. Circulating levels of IL-6 and TNF-α are associated with knee radiographic osteoarthritis and knee cartilage loss in older adults. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18(11):1441-1447.
[32] GREENE MA, LOESER RF. Aging-related inflammation in osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(11): 1966-1971.
[33] XIAO J, ZHANG P, CAI FL, et al. IL-17 in osteoarthritis: A narrative review. Open Life Sci. 2023;18(1):20220747.
[34] ROBERT M, MIOSSEC P. IL-17 in Rheumatoid Arthritis and Precision Medicine: From Synovitis Expression to Circulating Bioactive Levels. Front Med (Lausanne). 2019;5:364.
[35] TSUKAZAKI H, KAITO T. The Role of the IL-23/IL-17 Pathway in the Pathogenesis of Spondyloarthritis. Int J Mol Sci. 2020; 21(17):6401.
[36] BLAUVELT A, CHIRICOZZI A. The Immunologic Role of IL-17 in Psoriasis and Psoriatic Arthritis Pathogenesis. Clin Rev Allergy Immunol. 2018;55(3):379-390.
[37] ZHANG X, YUAN Y, PAN Z, et al. Elevated circulating IL-17 level is associated with inflammatory arthritis and disease activity: A meta-analysis. Clin Chim Acta. 2019;496: 76-83.
[38] MIMPEN JY, BALDWIN MJ, CRIBBS AP, et al. Interleukin-17A Causes Osteoarthritis-Like Transcriptional Changes in Human Osteoarthritis-Derived Chondrocytes and Synovial Fibroblasts In Vitro. Front Immunol. 2021;12:676173.
[39] WANG K, XU J, CAI J, et al. Serum levels of resistin and interleukin-17 are associated with increased cartilage defects and bone marrow lesions in patients with knee osteoarthritis. Mod Rheumatol. 2017; 27(2):339-344.
[40] 胡光亮,马振华,徐迈,等.骨关节炎患者TNF-α、IL-17、COMP、ADAMTS-7及mRNA表达水平研究[J].中国医学前沿杂志(电子版),2018,10(12):100-103.
[41] XIN R, XU Y, LONG D, et al. Mitochonic Acid-5 Inhibits Reactive Oxygen Species Production and Improves Human Chondrocyte Survival by Upregulating SIRT3-Mediated, Parkin-dependent Mitophagy. Front Pharmacol. 2022;13:911716.
[42] BENT R, MOLL L, GRABBE S, et al. Interleukin-1 Beta-A Friend or Foe in Malignancies? Int J Mol Sci. 2018;19(8): 2155.
[43] DI FRANCESCO M, FRAGASSI A, PANNUZZO M, et al. Management of osteoarthritis: From drug molecules to nano/micromedicines. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2022; 14(3):e1780.
[44] GONG Z, WANG Y, LI L, et al. Cardamonin alleviates chondrocytes inflammation and cartilage degradation of osteoarthritis by inhibiting ferroptosis via p53 pathway. Food Chem Toxicol. 2023;174:113644.
[45] XU W, ZHANG B, XI C, et al. Ferroptosis Plays a Role in Human Chondrocyte of Osteoarthritis Induced by IL-1β In Vitro. Cartilage. 2023;14(4):455-466.
[46] LIU L, ZHANG W, LIU T, et al. The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress. Redox Biol. 2023;62:102663.
[47] RUSSO RC, GARCIA CC, TEIXEIRA MM, et al. The CXCL8/IL-8 chemokine family and its receptors in inflammatory diseases. Expert Rev Clin Immunol. 2014;10(5):593-619.
[48] BAGGIOLINI M. CXCL8 - The First Chemokine. Front Immunol. 2015;6:285.
[49] CAMBIER S, GOUWY M, PROOST P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023; 20(3):217-251.
[50] YANG P, TAN J, YUAN Z, et al. Expression profile of cytokines and chemokines in osteoarthritis patients: Proinflammatory roles for CXCL8 and CXCL11 to chondrocytes. Int Immunopharmacol. 2016;40:16-23.
[51] 杨鹏.骨关节炎患者细胞因子/趋化因子表达谱分析以及CXCL8和CXCL11对软骨细胞的调节作用[D].西安:第四军医大学,2018.
[52] GE X, SHI R, MA X. The secreted protein WNT5A regulates condylar chondrocyte proliferation, hypertrophy and migration. Arch Oral Biol. 2017;82:171-179.
[53] WU YH, LIU W, ZHANG L, et al. Effects of microRNA-24 targeting C-myc on apoptosis, proliferation, and cytokine expressions in chondrocytes of rats with osteoarthritis via MAPK signaling pathway. J Cell Biochem. 2018;119(10):7944-7958.
[54] ZOU J, LI XL, SHI ZM, et al. Effects of C-myc gene silencing on interleukin-1β-induced rat chondrocyte cell proliferation, apoptosis and cytokine expression. J Bone Miner Metab. 2018;36(3):286-296.
[55] TANG H, CHENG Z, MA W, et al. TLR10 and NFKBIA contributed to the risk of hip osteoarthritis: systematic evaluation based on Han Chinese population. Sci Rep. 2018;8(1):10243.
[56] CAI P, JIANG T, LI B, et al. Comparison of rheumatoid arthritis (RA) and osteoarthritis (OA) based on microarray profiles of human joint fibroblast-like synoviocytes. Cell Biochem Funct. 2019;37(1):31-41.
[57] LU H, HOU G, ZHANG Y, et al. c-Jun transactivates Puma gene expression to promote osteoarthritis. Mol Med Rep. 2014;9(5):1606-1612.
[58] YE Z, CHEN Y, ZHANG R, et al. c-Jun N-terminal kinase - c-Jun pathway transactivates Bim to promote osteoarthritis. Can J Physiol Pharmacol. 2014;92(2):132-139.
[59] DE LANGE-BROKAAR BJ, KLOPPENBURG M, ANDERSEN SN, et al. Characterization of synovial mast cells in knee osteoarthritis: association with clinical parameters. Osteoarthritis Cartilage. 2016;24(4):664-671.
[60] FARINELLI L, AQUILI A, MATTIOLI-BELMONTE M, et al. Synovial mast cells from knee and hip osteoarthritis: histological study and clinical correlations. J Exp Orthop. 2022;9(1):13.
[61] KULKARNI P, HARSULKAR A, MÄRTSON AG, et al. Mast Cells Differentiated in Synovial Fluid and Resident in Osteophytes Exalt the Inflammatory Pathology of Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(1):541.
[62] DOSS F, MENARD J, HAUSCHILD M, et al. Elevated IL-6 levels in the synovial fluid of osteoarthritis patients stem from plasma cells. Scand J Rheumatol. 2007;36(2): 136-139.
[63] QIAO D, GU C, WANG W, et al. Tumor-Originated Exosomal hsa-miR-3937 as a Minimally Invasive Early Biomarker for Liquid Biopsy of Colorectal Cancer. J Oncol. 2022;2022:6990955.
[64] SANCHEZ-RANGEL E, INZUCCHI SE. Metformin: clinical use in type 2 diabetes. Diabetologia. 2017;60(9):1586-1593.
[65] HE M, LU B, OPOKU M, et al. Metformin Prevents or Delays the Development and Progression of Osteoarthritis: New Insight and Mechanism of Action. Cells. 2022;11(19):3012.
[66] TERKELTAUB R, YANG B, LOTZ M, et al. Chondrocyte AMP-activated protein kinase activity suppresses matrix degradation responses to proinflammatory cytokines interleukin-1β and tumor necrosis factor α. Arthritis Rheum. 2011;63(7):1928-1937.
[67] SONG Y, WU Z, ZHAO P. The effects of metformin in the treatment of osteoarthritis: Current perspectives. Front Pharmacol. 2022;13:952560.
[68] PARK MJ, MOON SJ, BAEK JA, et al Metformin Augments Anti-Inflammatory and Chondroprotective Properties of Mesenchymal Stem Cells in Experimental Osteoarthritis. J Immunol. 2019;203(1): 127-136.
[69] WANG C, YAO Z, ZHANG Y, et al. Metformin Mitigates Cartilage Degradation by Activating AMPK/SIRT1-Mediated Autophagy in a Mouse Osteoarthritis Model. Front Pharmacol. 2020;11:1114.
[70] NA HS, KWON JY, LEE SY, et al. Metformin Attenuates Monosodium-Iodoacetate-Induced Osteoarthritis via Regulation of Pain Mediators and the Autophagy-Lysosomal Pathway. Cells. 2021;10(3):681.
[71] SCHADLER P, LOHBERGER B, STÜNDL N, et al. The Effect of Body Mass Index and Metformin on Matrix Gene Expression in Arthritic Primary Human Chondrocytes. Cartilage. 2021;13(2_suppl):1004S-1018S.
[72] BENIGNI G, DIMITROVA P, ANTONANGELI F, et al. CXCR3/CXCL10 Axis Regulates Neutrophil-NK Cell Cross-Talk Determining the Severity of Experimental Osteoarthritis. J Immunol. 2017;198(5):2115-2124.
[73] ROMERA-CÁRDENAS G, THOMAS LM, LOPEZ-COBO S, et al. Ionomycin Treatment Renders NK Cells Hyporesponsive. PLoS One. 2016;11(3):e0150998.
[74] GREGORI D, GIACOVELLI G, MINTO C, et al. Association of Pharmacological Treatments With Long-term Pain Control in Patients With Knee Osteoarthritis: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA. 2018; 320(24):2564-2579.

引言

骨关节炎是由遗传、代谢、生物化学和物理因素相互作用所引起的一种退行性关节疾病，这些因素导致关节软骨损伤，激活与关节软骨、软骨下骨和滑膜相关的炎症反应[1]。目前对骨关节炎的研究主要集中在免疫领域，其发病机制尚不完全清楚[2]，且大多数选择止痛药、抗炎药和皮质类固醇关节内注射进行治疗[3]，但是，这些药物主要是对症支持治疗，延缓病情的进展，而且服用药物期间会有一定的不良反应[4-6]。因此，迫切需要找出骨关节炎新的生物标志物和疾病修饰药物，进行早期诊断和疾病修饰治疗。
氧化应激是指氧化和抗氧化系统失衡[7]，生物分子如脂质和蛋白质等受到过量活性氧和活性氮的氧化作
用[8]，造成机体过度氧化，引起细胞功能混乱和组织受损。近年来，氧化应激与骨关节炎的关联得到越来越多学者的认同，如氧化应激显著加速软骨细胞端粒缩短和衰老，而衰老则促进骨关节炎的发生[9]，以及线粒体代谢紊乱增加活性氧的产生[10]，活性氧通过裂解胶原蛋白、聚集聚糖和激活基质金属蛋白酶直接引起软骨降解[11-12]，进而促进骨关节炎的疾病进展[13]。免疫浸润是免疫细胞(如B细胞、T细胞和巨噬细胞等)在组织内的积聚和聚集现象，越来越多的文献表明，相对于健康人的组织样本，骨关节炎患者的关节组织含有大量的T细胞和B细胞，进而破坏免疫稳定导致炎症[14-16]。
因此，该研究使用生物信息学方法对氧化应激和免疫浸润在骨关节炎中发生的作用进行探讨，找出差异表达氧化应激相关基因，通过验证得到可作为诊断骨关节炎的核心基因，并对相关miRNA和疾病修饰药物进行了预测。研究流程见图1。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学分析，外部数据集交叉验证。
1.2 时间及地点该研究于2023年8-12月在山东中医药大学完成。
1.3 方法
1.3.1 GEO数据的提取和处理通过访问基因表达综合数据库(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，获取了包含骨关节炎表达谱的数据集GSE55235、GSE55457[17]、GSE1919[18]。选取GSE55235(10例骨关节炎患者及10例健康对照样本)和GSE55457(10例骨关节炎患者及10例健康对照样本)作为实验数据集，选取GSE1919(5例骨关节炎患者及5例健康对照样本)作为验证数据集，所有指标数据均基于关节滑膜组织样本采集而来。通过运用包含有差异基因表达分析功能的R(版本4.3.2)中的“limma”包，筛选出在P < 0.05条件下|log2 fold change(log2FC)| > 1.0的基因，从而获得差异表达基因；进一步利用R中的“pheatmap”包绘制热图，以直观地展示基因表达的差异情况；同时使用“ggplot2”包绘制火山图，更加生动地表现差异表达基因的分布情况。

1.3.2 差异表达氧化应激基因获取通过从GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中下载氧化应激基因，并且设置Relevance score ≥7[19]，与差异表达基因进行交集操作，最终得到差异表达氧化应激基因(DEOSGs)。
1.3.3 富集分析对差异表达氧化应激基因进行KEGG和GO分析，使用R中的“clusterProfiler”“org.hs.eg.db”
和“pathview”包进行。此外，将基因按照logFC从高到低进行排序，通过MSigDB数据库(https://www.gsea-msigdb.org/)下载C2：KEGG和C5：GO背景基因集进行GSEA分析[20]，使用R中的“clusterProfiler”包进行分析，并使用“enrichplot”包对结果进行可视化。
1.3.4 蛋白互作网络及关键基因的确定通过访问STRING数据库(https://string-db.org/)，建立蛋白质-蛋白质相互作用网络，将差异表达氧化应激基因输入STRING，使用Cytoscape(版本 3.10.1)软件中CytoHubba插件，使用Degree排序确定Top10关键基因，使用MCODE插件确定关键蛋白模块，MCODE默认设置。
1.3.5 核心基因的确定使用验证数据集GSE1919评估关键基因的准确性，对关键基因进行差异分析；使用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析关键基因，其ROC曲线下面积值越大说明该基因预测疾病模型的准确率越高，综合分析确定核心基因。
1.3.6 免疫浸润分析对实验数据集中20个骨关节炎患者及20个健康对照样本使用CIBERSORT评估免疫浸润情况，CIBERSORT涵盖了多种生物标记物及人类免疫细胞，包括血浆、B细胞、T细胞和骨髓细胞亚群等[21]，采用Spearman法分析免疫细胞相关性。
1.3.7 核心基因与免疫细胞的相关性分析针对核心基因表达与免疫细胞之间的关联，采用R中的“ggplot2”和“dplyr”包进行分析，采用Spearman法分析核心基因与免疫细胞的相关性。
1.3.8 预测miRNA和小分子药物使用Enrichr数据库(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)中的TargetScan数据库对核心基因进行miRNA预测[22-23]，使用Enrichr数据库中的DSigDB数据库预测骨关节炎治疗药物[24]，使用Cytoscape(版本3.10.1)软件进行可视化。物种设置人类。

讨论

骨关节炎是一种在老年人中普遍存在的疾病，也是导致身体功能下降的重要原因[25]。然而，对骨关节炎的发病机制研究不足，缺乏有效控制疾病发生发展的治疗方法，而骨关节炎发展到末期，多采取关节置换手术[26]，但术后存在出血、感染、翻修等风险。
该研究通过对下载数据的处理，得到了65个差异表达氧化应激基因，其中19个上调，46个下调，对差异表达氧化应激基因进行KEGG、GO富集分析，结果显示其主要富集在白细胞介素17信号通路、破骨细胞分化、对氧化应激的反应、老化、氧化还原酶的活性等。目前研究认为氧化应激是导致骨关节炎发病的因素之一，这主要与氧化应激产生过量的活性氧有关。活性氧是指体内含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，包括过氧化物和超氧化物等，活性氧在多种细胞生理功能中发挥作用，它在正常的信号传导中扮演细胞信使的角色，调控软骨细胞的老化与凋亡、细胞外基质的合成和降解、滑膜炎症以及骨组织代谢的异常，而过量的活性氧会诱导基质降解蛋白及蛋白酶，减少了细胞外基质的合成，导致骨代谢异常，造成软骨损伤[27]。软骨细胞活性氧的水平随着年龄的增长而增加[28]，当细胞无法有效清除活性氧时，活性氧会对脂质、蛋白质和DNA结构造成破坏，发生氧化应激反应，加快细胞凋亡[29]，加剧骨关节炎。此外，活性氧可激活转录因子，调节抗氧化蛋白和促炎因子的生成，如Nrf2转录因子和核因子κB，核因子κB的升高会导致白细胞介素1、肿瘤坏死因子α等炎性因子水平升高，而骨关节炎患者的滑膜、软骨和滑液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6水平较高，这一结果证明了骨关节炎与轻度炎症之间的联系[30-32]，也证实了骨关节炎和氧化应激在免疫水平的紧密联系。
在宿主的免疫防御、组织修复以及免疫疾病的发展过程中，白细胞介素17起着重要的作用。白细胞介素17主要来源于T细胞。近年来的研究已经确定了白细胞介素17在骨关节炎进展中的重要作用[33]。白细胞介素17在类风湿性关节炎[34]、强直性脊柱炎及银屑病关节炎中研究最为广泛[35-37]。MIMPEN等[38]研究结果表明，在骨关节炎中，白细胞介素17对软骨细胞和滑膜成纤维细胞炎症反应、补体产生、缺氧反应、血管生成和糖酵解途径产生影响。此外，他们还观察到膝骨关节炎患者血清白细胞介素17表达与膝骨关节炎严重程度呈正相关[39-40]。衰老和炎症致关节软骨细胞中线粒体功能障碍，进而导致活性氧产生增加[41]，过度氧化导致过氧化物还原酶失活，软骨细胞的抗氧化能力下降[28]，使软骨的稳定性受损，引发软骨损伤并促进骨关节炎的发生发展。
该研究得到了5个核心基因IL1B、CXCL8、MYC、NFKBIA、JUN。白细胞介素1β是炎症小体激活后，经caspase-1处理的唯一细胞因子[42]，白细胞介素1β可诱导软骨细胞产生一些分解代谢酶，如基质金属蛋白酶，而基质金属蛋白酶是骨关节炎进展的关键酶之一[43]，可降解软骨主要成分Ⅱ型胶原蛋白，破坏软骨基质。此外，白细胞介素1β还会诱导炎症递质来加剧炎症反应，如环氧合酶2。综合白细胞介素1β对于软骨基质的破坏作用和促炎作用，所以目前常采用白细胞介素1β作用于软骨细胞来诱导骨关节炎模型[44-46]。CXCL8是一种属于趋化因子家族的蛋白质，其作用是通过与CXC趋化因子受体1和CXC趋化因子受体2结合，调控细胞在稳态和炎症条件下的募集和活化。趋化因子是一类控制多种组织功能的小分子蛋白质[47]，CXCL8是人类最有效的中性粒细胞吸引因子[48]，当炎症被激活时，一些细胞和组织的驻留白细胞会产生CXCL8，其在产生部位和血管之间形成浓度梯度，引导中性粒细胞到达炎症部位，以控制病原体并缓解急性炎症，之后CXCL8可能通过刺激内皮细胞增殖和迁移来修复受损组织进而促进血管生成[49]。CXCL8和CXCL11可能在加重骨关节炎疾病进展中起到促进软骨细胞凋亡和抑制软骨细胞增殖的作用，其机制可能是通过增强促炎细胞因子的表达实现的[50]。有学者研究发现，CXCL8可以提高软骨中磷酸化信号转导及转录激活因子3和磷酸化核因子κB的水平，即通过JAK-STAT和NF-κB 信号传导通路影响相关细胞因子的分泌和凋亡过程[51]，促进骨关节炎的疾病进展。MYC是一种转录因子，可通过影响破骨细胞分化[52]、激活MAPK通路促进骨关节炎的进展[53]，抑制MYC基因活性能够促进细胞增殖并阻止细胞凋亡，同时在白细胞介素1β诱导的大鼠软骨细胞中，还能有效地抑制基质金属蛋白酶13、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达[54]。NFKBIA是属于NF-κB抑制剂家族的一员，而NF-κB可引起炎性级联反应，其参与了成纤维样滑膜细胞所导致的炎症反应，从而使髋骨关节炎的风险增加[55-56]。JUN通过增加PUMA(一种促凋亡因子)和BIM(一种促凋亡蛋白)水平来刺激软骨细胞凋亡[57-58]，在骨关节炎中发挥关键性的作用。
通过CIBERSORT算法，测量了样本中免疫细胞的丰度水平。结果表明，滑膜组织中的免疫细胞主要包括巨噬细胞、肥大细胞和记忆CD4 T细胞，它们构成了免疫细胞的主要成分。骨关节炎患者的滑膜肥大细胞数量明显增加[59]，且与滑膜炎症和疾病严重程度密切相关[60]，肥大细胞数量增加可引发炎症并加重骨关节炎关节的结构损伤[61]。此外，骨关节炎患者的滑膜组织或滑液中亦有发现浆细胞，这些细胞具备分泌白细胞介素6的能力[62]。这些研究显示，针对免疫细胞的定向治疗可能成为治疗骨关节炎的一种有前景的方法。最后，该研究利用TargetScan数据库和DSigDB数据库对miRNA和治疗小分子药物进行预测。所预测的miRNA是has-miR-3937，QIAO等[63]研究表明has-miR-3937是结直肠癌检测和治疗的潜在有效标志物，并无骨关节炎相关的研究，该miRNA可能成为骨关节炎后续新的研究方向。该研究从氧化应激的角度预测了相关修饰治疗小分子药物，二甲双胍安全性较高，是2型糖尿病患者的首选治疗药物[64]。二甲双胍在AMPK依赖性和AMPK非依赖性通路中起作用，二甲双胍穿透线粒体内膜，直接抑制线粒体呼吸链复合物1[65]，AMPK活性能支持软骨稳态，在骨关节炎关节软骨细胞中发现AMPK表达降低[66]，线粒体损伤被视为与骨关节炎的病理过程有关，因此AMPK可能成为骨关节炎治疗的一个可行目标。二甲双胍对骨关节炎的主要作用被SONG等[67]提出，主要涉及到炎症、氧化应激、自噬以及疼痛水平调节，与AMPK的激活密切相关。作为细胞代谢的主要调节因子，AMPK参与多种信号通路的调节。最近几年的研究还通过动物实验、体外实验和临床试验得出了同样的结果[68-71]，证实了二甲双胍在调节炎症和保护软骨方面的作用。因此，二甲双胍可能成为骨关节炎的修饰治疗药物。在骨关节炎中，NK细胞扮演着关键的角色，是促病免疫细胞的重要成员[72]，离子霉素(ionomycin)可诱导NK细胞低反应性[73]，缓解骨关节炎。塞来昔布是一种具有选择性的非类固醇抗炎药，用于缓解骨关节炎患者的疼痛[74]。
综上所述，该研究运用生物信息学结合氧化应激和免疫浸润对骨关节炎进行分析，探究了氧化应激和免疫浸润的作用，明确了与此相关的核心基因，并对相关miRNA和治疗小分子药物进行预测，为防治骨关节炎提供了新思路。该研究集中于生物信息学分析，缺乏基础实验和临床试验验证。另外，研究中所采集到的样本数量较有限，为了提高研究的准确性，将在后续的工作中计划扩大样本规模，为治疗骨关节炎奠定更坚实的基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨关节炎的氧化应激相关基因和免疫浸润分析

Analysis of oxidative stress-related genes and immune infiltration in osteoarthritis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 11

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	马驰, 王宁, 陈拥, 魏志晗, 刘逢纪, 朴成哲. 3D打印个体化截骨导板结合定制钢板在开放楔形胫骨高位截骨中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1863-1869.
[2]	余帅, 刘家伟, 朱彬, 潘檀, 李兴龙, 孙广峰, 于海洋, 丁亚, 王宏亮. 小分子药物治疗骨关节炎的热点问题及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1913-1922.
[3]	赵济宇, 王少伟. 叉头框转录因子O1信号通路与骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1923-1930.
[4]	孙韫頔, 程露露, 万海丽, 常赢, 熊雯娟, 夏渊. 神经肌肉训练对膝骨关节炎患者疼痛和功能影响的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1945-1952.
[5]	邓柯淇, 李光第, GOSWAMI ASHUTOSH, 刘星余, 何孝勇. 基于生物信息学对骨关节炎铁超载关键基因的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1972-1980.
[6]	尹路, 蒋川锋, 陈俊杰, 易明, 王子赫, 石厚银, 汪国友, 沈骅睿. 沙苑子苷A对关节软骨细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1541-1547.
[7]	王佩光, 张小文, 麦美斯, 黎璐茜, 黄浩. 广义估计方程评估浮针法联合穴位埋线治疗不同分期膝骨关节炎的疗效[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1565-1571.
[8]	刘琳, 刘世轩, 陆馨悦, 王侃. 慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1585-1592.
[9]	王秋月, 靳攀, 蒲锐. 运动干预与细胞焦亡在骨关节炎中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1667-1675.
[10]	赵嘉诚, 任诗齐, 祝秦, 刘佳佳, 朱翔, 杨洋. 原发性骨质疏松潜在生物标志物的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1741-1750.
[11]	陈跃平, 陈锋, 彭清林, 陈荟伊, 董盼锋. 三七治疗骨关节炎机制：基于UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1751-1760.
[12]	杨治航, 孙祖延, 黄文良, 万喻, 陈仕达, 邓江. 神经生长因子促进兔骨髓间充质干细胞软骨分化并抑制肥大分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1336-1342.
[13]	张昊军, 李泓毅, 张辉, 陈浩然, 张力中, 耿杰, 侯传东, 于琦, 贺培凤, 贾金鹏, 卢学春. 间充质细胞源性骨肉瘤中关键分子标志物鉴定及药物敏感性分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1448-1456.
[14]	翁宗琴, 赵海龙. 外泌体miRNA参与肿瘤化疗耐药的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1504-1511.
[15]	贺光辉, 原杰, 柯燕琴, 丘小婷, 张晓玲. Hemin调控小鼠软骨细胞氧化应激的线粒体途径[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(6): 1183-1191.