慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析

doi:10.12307/2025.351

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (8): 1585-1592.doi: 10.12307/2025.351

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慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析

刘琳，刘世轩，陆馨悦，王侃

南京体育学院运动健康学院，江苏省南京市 210014

收稿日期:2024-03-20 接受日期:2024-05-09 出版日期:2025-03-18 发布日期:2024-07-05
通讯作者: 王侃，博士，讲师，南京体育学院运动健康学院，江苏省南京市 210014
作者简介:刘琳，男，1989年生，河北省沧州市人，汉族，2018年上海体育大学毕业，博士，讲师，主要从事肌筋膜触发点的基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(32000829)，项目负责人：刘琳；江苏省高校“青蓝工程”项目，项目负责人：刘琳

Metabolomic analysis of urine in a rat model of chronic myofascial trigger points

Liu Lin, Liu Shixuan, Lu Xinyue, Wang Kan

School of Sport and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China

Received:2024-03-20 Accepted:2024-05-09 Online:2025-03-18 Published:2024-07-05
Contact: Wang Kan, MD, Lecturer, School of Sport and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China
About author:School of Sport and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China Liu Lin, MD, Lecturer, School of Sport and Health, Nanjing Sport Institute, Nanjing 210014, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 32000829 (to LL); Jiangsu Province University “Blue Engineering” Project (to LL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肌筋膜触发点：是骨骼肌内运动终板处挛缩形成的一堆高敏感疼痛位点，具有牵涉痛、自发性放电和干扰筋膜结构紊乱等多种特有的病理学特征。在临床上，患者体内形成的肌筋膜触发点不仅可诱发多种急慢性疼痛，也会潜在性地影响患者神经系统、循环系统和内脏系统，以致于形成带状疱疹后遗痛、静脉曲张、便秘等。
代谢组学：是一种利用色谱-质谱联用技术，结合相应数据库对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的检测方法，具有高通量、广覆盖的特点。通过代谢组学技术，可以筛选出对照组和处理组中差异代谢物，再利用进一步的代谢通路分析筛选出可用于临床疾病早筛、诊断、预后的生物标志物，为相关疾病的快速检测提供参考依据。

背景：慢性肌筋膜触发点通过非靶向代谢组学技术可识别差异性代谢物变化，有助于从内源性小分子代谢物层面理解并进一步探究慢性肌筋膜触发点的病理生理过程和发病机制。
目的：以慢性肌筋膜触发点模型大鼠为研究对象，基于尿液代谢组学寻找潜在生物标志物及相关代谢通路。
方法：将16只SD大鼠随机分为造模组和正常组，造模组大鼠采用钝性打击结合离心运动(跑台坡度为-16°，跑速为16 m/min，训练时间为90 min/次)方式建立慢性肌筋膜触发点动物模型，每周1次，连续干预8周，休息4周；正常组大鼠不做干预。12周造模结束后，采用代谢笼法收集大鼠造模后24 h尿液，利用液相色谱-质谱联用非靶向代谢组学技术对尿样进行代谢图谱检测，筛选出共同差异代谢物，并进行生物信息学分析。
结果与结论：①与正常组相比，造模组有32个差异代谢标志物，其中上调21个、下调11个；依据变量权重值> 3，共14个差异代谢物被认定为潜在生物标志物；②京都基因与基因组百科全书富集分析表明，慢性肌筋膜触发点的形成与初级胆汁酸生物合成、花生四烯酸代谢通路密切相关。
https://orcid.org/0000-0001-7314-4425(刘琳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肌筋膜触发点, 大鼠, 尿液, 代谢组学, 生物信息学, 生物标志物, 差异代谢物, 代谢笼法, 运动损伤

Abstract: BACKGROUND: Chronic myofascial trigger points can identify differential metabolite changes through non targeted metabolomics techniques, helping to understand and further explore the pathophysiological processes and pathogenesis of chronic myofascial trigger points from the perspective of endogenous small molecule metabolites.
OBJECTIVE: To investigate potential biomarkers and related metabolic pathways based on urine metabolomics in the rat model of chronic myofascial trigger points.
METHODS: Sixteen Sprague-Dawley rats were randomly divided into a model group and a normal group. The model group was used to establish a chronic myofascial trigger point animal model by combining blunt hitting with centrifugal exercise (treadmill slope: -16°, running speed: 16 m/min, training time: 90 minutes each), once a week for 8 continuous weeks, with 4 weeks off. After 12 weeks of modeling, the metabolic cage method was used to collect urine from rats at 24 hours after modeling. Liquid chromatography-mass spectrometry non-targeted metabolomics technology was used to detect metabolic profiles in the urine samples, screen common differential metabolites, and conduct bioinformatics analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, there were 32 differential metabolic markers in the model group, of which 21 were upregulated and 11 were downregulated. A total of 14 differential metabolites were identified as potential biomarkers based on the value of variable important in projection greater than 3. The enrichment analysis of the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes indicated that the formation of chronic myofascial trigger points is closely related to metabolic pathways such as primary bile acid biosynthesis and arachidonic acid metabolism.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: myofascial trigger point, rat, urine, metabolomics, bioinformatics, biomarker, differential metabolite, metabolic cage method, sports injuries

中图分类号:

刘琳, 刘世轩, 陆馨悦, 王侃. 慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1585-1592.

Liu Lin, Liu Shixuan, Lu Xinyue, Wang Kan. Metabolomic analysis of urine in a rat model of chronic myofascial trigger points [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(8): 1585-1592.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验入组12只大鼠，在造模及实验过程中无死亡及脱失，全部进入结果分析。
2.2 针极肌电图分析经过12周造模，肌筋膜触发点造模组大鼠可以在腓肠肌中段打击位置处触摸到一个较大的挛缩结节，采用针极肌电图可在大鼠静息状态下观察到图1所示的高频高幅自发性放电情况，但正常对照大鼠组静息状态下针极肌电图无变化，提示造模成功。

2.3 质控样本质谱总离子图(TIC)对比将质量控制样本正、负离子检测模式下的质谱总离子流图分别进行谱图叠加比较，见图2和图3，结果表明各色谱峰的保留时间和响应强度大致吻合，表明实验因仪器误差导致的变异不大，数据可靠。
2.4 主成分分析(PCA)图与正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) 图4主成分分析表明，肌筋膜触发点造模干预对大鼠尿液代谢物的分离趋势不明显，显示组间对大鼠

的影响比较有限(图4A，B)，但肌筋膜触发点造模干预组大鼠尿液代谢物与正常对照组大鼠尿液代谢物比较的正交偏最小二乘判别分析图的分离趋势明显(图4C，D)。
2.5 潜在生物标志物的筛选根据正交偏最小二乘法判别分析模型得到的变量权重值 (variable importance in projection，VIP) 结合t检验以及差异倍数 (FC) 分析，此次实验以 VIP > 1.5 且 P < 0.01 为标准，筛选差异代谢物。其中，FC > 1.2 且 P < 0.01 的物质为该比较组所有上调差异代谢物，FC < 0.8且 P < 0.01 的物质为该比较组所有下调差异代谢物。正常组与造模组筛选差异代谢标志物数共32个，其中上调21个、下调11个，见图5和表1。表1列举了VIP > 3 的非常显著性差异代谢物。
2.6 代谢通路分析将已鉴定的代谢物导入在线数据库MetaboAnalyst 4.0及KEGG数据库进行代谢通路富集分析。研究表明，肌筋膜触发点造模对机体初级胆汁酸生物合成、花生四烯酸代谢2条通路产生显著性影响(P < 0.05)，见图6和表2。经过KEGG通路的差异种属分析表明，两条代谢通路均属于新陈代谢种属，见表2。

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引言

肌筋膜触发点是骨骼肌内运动终板处挛缩形成的高敏感疼痛位点，具有牵涉痛、自发性放电和干扰筋膜结构紊乱等多种特有的病理学特征[1-2]。在临床上，患者体内形成的肌筋膜触发点不仅可诱发多种急慢性疼痛，也会潜在性地影响患者神经系统、循环系统和内脏系统，以致于形成带状疱疹后遗痛、静脉曲张、便秘等[1，3-6]。因此，患者体内是否存在肌筋膜触发点可能是判定其是否存在疼痛或其他功能障碍的一项简便措施。
当前，对于肌筋膜触发点的临床诊断主要依托于医生的经验触诊和针刺诱发骨骼肌局部抽搐反应等，这种诊断需要医生根据患者的主观疼痛症状或疑难杂症的详细描述，借助于肌筋膜触发点的四大诊断思路(牵涉痛思路、筋膜力学思路、神经思路和血管思路)逐一判别患者体内骨骼肌处的肌筋膜触发点位置并加以治疗[7-10]。尽管这种触诊方法很准确，但需要医生具备扎实严谨的肌筋膜触发点理论知识和丰富的触诊经验，因此往往无法得到广泛性应用。基于此，对于肌筋膜触发点的检查迫切需要一项更加便捷化的新兴手段(如血检或尿检等)，以促使更多临床医生可以快速了解患者体内是否存在肌筋膜触发点。
代谢组学是一种利用色谱-质谱联用技术，结合相应数据库对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与疾病生理病理变化相对关系的检测方法，具有高通量、广覆盖的特点[11-12]。通过代谢组学技术，可以筛选出对照组和造模组中差异代谢物，再利用进一步的代谢通路分析筛选出可用于临床疾病早筛、诊断、预后的生物标志物，为相关疾病的快速检测提供参考依据[13]。近年来，代谢组学技术已逐步应用于骨骼肌损伤机制和肌痛的研究。夏雨等[14]研究表明一次大负荷运动后，氨基酸代谢、生物降解代谢及脂质代谢途径可能共同调控了骨骼肌的生物过程变化。HADREVI等[15-16]对斜方肌肌痛患者进行代谢组学研究表明，L-亮氨酸和脂肪酸代谢物在肌肉间质中的丰度较高，增加了肌肉疼痛的程度。
慢性肌筋膜触发点作为一种常见的肌骨系统疾病，其生物标志物一直以来未有明确定论，此次研究拟基于慢性肌筋膜触发点大鼠模型，依托液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)非靶向代谢组学技术对大鼠尿液进行代谢组学分析，寻找潜在生物标志物及相关代谢通路，从内源性小分子代谢物层面探究慢性肌筋膜触发点的发病机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点动物实验于2022年11月至2023年2月在南京体育学院动物房进行；样本检测委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.3 材料 SPF级雄性SD大鼠12只，体质量(220±20) g，由杭州医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0002，实验动物合格证编号：20230206Aazz0100000877。饲养条件：温度20-25 ℃，相对湿度40%-70%。实验方案经南京体育学院动物实验伦理委员会批准，审批号GZRDW-2020-02。实验过程遵循国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下手术，并最大限度减少其痛苦和死亡。
1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及造模大鼠在实验室适应3 d后采用随机数字法被分为对照组和造模组，每组6只。对造模组大鼠腓肠肌中段进行钝性打击结合离心运动方式建立肌筋膜触发点模型，每周第1天用2%戊巴比妥钠15-40 mg/kg腹腔内注射麻醉大鼠后，仰卧位固定，以质量为1 200 g的打击器从20 cm高度处自由落下，打击大鼠左下肢的腓肠肌中段1次，造成骨骼肌钝挫伤，第2天要求大鼠以16 m/min的速度在-16°动物跑台上离心运动90 min；对照组大鼠正常饲养。大鼠每周进行同样造模，维持8周，其后4周与对照组大鼠一样进行休息[17-18]。造模12周结束之后，通过对大鼠腓肠肌按压检查，寻找膨大紧张带，利用针电极诱导出局部抽搐反应，在静息条件下记录该处肌筋膜触发点肌电图，以> 30 s且反复出现的高频高幅不规则自发肌电图记录为自发肌电图阳性[17-18]。对照组记录与造模组相对应处的骨骼肌。

1.4.2 取样及样本处理采用代谢笼法，单只收集大鼠造模后24 h新鲜尿液。收集后立即4 ℃下1 000×g 离心15 min，将尿液离心去除细胞核杂质后，取上清液。再15 000×g，于 4 ℃下离心10 min后，吸取中层澄清的尿液，用1.5 mL离心管分装，精确量取每管1 mL，-80 ℃冷冻样品用以供LC-MS非靶向代谢组学分析。
1.4.3 LC-MS 检测采用赛默飞公司超高效液相色谱串联傅里叶变换质谱UHPLC -Q Exactive HF-X 系统进行LC-MS 分析。
色谱条件：色谱柱为 ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 µm；Waters，Milford，USA)；流动相A为体积分数95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流动相B为体积分数47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含 0.1%甲酸)，进样量为3 μL，柱温为40 ℃。
质谱条件：样品经电喷雾电离，分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号。具体参数：扫描范围70-1 050 m/z；鞘气流速50 arb；辅助气流速13 arb；加热温度425 ℃；毛细管温度325 ℃；喷雾电压+3 500 V/-3 500 V；S-Lens 电压50；碰撞能；分辨率60 000 Full MS，7 500 MS。
1.4.4 质控质控样本由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个质控的体积与样本相同，用与分析样本相同的方法处理和检测，在仪器分析的过程中，每5-15个分析样本中插入一个质控样本，以考察整个检测过程的稳定性。
1.5 主要观察指标 ①大鼠尿样中差异性内源代谢物的筛选；②大鼠尿液潜在生物标志物的检索及鉴定；③代谢通路分析。
1.6 统计学分析原始数据导入代谢组学处理软件ProgenesisQI(WatersCorporation，Milford，USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等，最终得到含保留时间、质荷比和峰强度等信息的数据矩阵。其后采用该软件进行特征峰搜库鉴定，将MS和MS/MS质谱信息与代谢数据库进行匹配，MS质量误差设置为< 10 ppm (< 10-6)，同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物。主要数据库为 http://www.hmdb.ca/等主流公共数据库以及自建的数据库。采用Graphpad 9.0软件，通过t检验分析代谢物组间差异。当满足差异倍数(fold change，FC) > 1.2且t检验分析结果P < 0.01时，提示该代谢物有统计学意义，计量资料以x±s表示。通过 MetaboAnalyst 4.0 (http://www.metaboanalyst.ca/)、KEGG(http://www. kegg.jp)和HMDB (http://www.hmdb.ca)分析相关代谢通路，分析结果P < 0.05时，提示该代谢通路有统计学意义。该文章统计学方法已经通过南京体育学院生物统计学专家审核。

讨论

3.1 既往研究及存在不足肌筋膜触发点的发病机制一直是国内外肌痛领域的研究重点，目前在电生理学和组织形态学方面已取得显著进展，然而对于肌筋膜触发点在代谢物层面的研究开展尚且有限。细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等都是受代谢物调控的。李丽辉[19-20]
通过对大鼠腓肠肌处肌筋膜触发点病理结构进行蛋白组学研究表明，肌筋膜触发点处的糖酵解/糖异生代谢通路(glycolysis/gluconeogenesis)和紧密连接信号通路(tight junction pathway)在慢性肌筋膜触发点发病时发生了显著性变化。靳飞鸿[21]通过对人体斜方肌肌筋膜触发点病理组织进行转录组学研究表明，肌筋膜触发点基因主要在糖酵解/糖异生、细胞凋亡及代谢、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、脂类及氨基酸等代谢过程表现出显著异常。尽管两项研究均表明了肌筋膜触发点的形成在糖酵解/糖异生代谢途径表现处显著异常，但有限的资料并不能给予明确的结论，并且国内外对肌筋膜触发点在代谢物层面系统全面性研究尚未有过开展。
3.2 研究的意义利用代谢组学技术和生物信息学分析，深入挖掘肌筋膜触发点的潜在生物标志物和相关代谢途径从内源性小分子代谢物层面探究慢性肌筋膜触发点的发病机制，为临床应用提供实验基础。此次研究通过利用LC-MS非靶向代谢组学技术对大鼠尿样进行代谢图谱检测，筛选出共同差异代谢物32个，其中上调代谢物21个，下调代谢物11个。在差异代谢物中，经过文献检索，与骨骼肌损伤、疼痛显著相关的代谢物有鹅去氧胆酸半胱氨酸、3，4-二氢-3-羟基-4-S-谷胱甘肽溴苯、3，4-二阿魏酰奎宁酸、7-酮脱氧胆酸、别胆酸和α-鼠胆酸[22-32]。
鹅去氧胆酸半胱氨酸是一种糖化胆汁酸及其衍生物的有机化合物，其结构内存在一个与胆汁酸骨架相连的甘氨酸[22-23]。α-鼠胆酸是一种羟基化胆汁酸，并以游离甘氨酸结合、牛磺酸结合和硫酸化形式存在于粪便中[22]。7-酮脱氧胆酸是一种二羟基胆汁酸、醇及其衍生物的有机化合物[23-24]。别胆酸是一种三羟基胆汁酸、醇及衍生物类有机化合物[23]。综上，在筛选出的所有差异代谢物中以胆汁酸类化合物居多，且都归属于脂质和类脂分子化合物。胆汁酸是胆汁的重要成分，分为初级胆汁酸和次级胆汁酸两种，初级胆汁酸的生物合成主要依托于肝细胞中细胞色素P450介导的胆固醇氧化，而75%的胆固醇氧化通过胆酸酶的酶促作用产生胆酸、鹅去氧胆酸和鼠胆酸等胆汁酸类代谢物[25]。此次研究发现的肌筋膜触发点大鼠尿液中初级胆汁酸生物合成通路异常可能与大鼠体内肝细胞的胆固醇氧化紊乱有关，结果造成大鼠尿液中胆汁酸显著性上调。该研究结果与MINERBI等[26]观察到的纤维肌痛患者血清内胆汁酸及其受体水平显著性较低相一致。
胆汁酸与胆汁酸受体相互作用，在多种代谢、生理和免疫过程中发挥着重要作用[26-28]。有研究表明，胆汁酸受体可能在调节痛觉信息的处理：通过激活背根神经节神经元内TRPV1离子通道诱发肠道内胆汁酸受体产生促感受效应，继而敏化并激活伤害性神经元[29]。一些次级胆汁酸也可以通过激活脊髓背角内胆汁酸受体TGR5和FXR来减轻机械性异常疼痛[26，30-32]。因此，考虑研究中肌筋膜触发点造模组大鼠尿液中胆汁酸代谢水平升高可能在疼痛的去抑制化中起着重要作用，认为对大鼠骨骼肌进行肌筋膜触发点造模导致的肌肉损伤不仅激活了脊髓背角的中枢敏化，抑制脊髓背角内胆汁酸受体TGR5和FXR的活性，也可能通过自主神经系统破坏了大鼠体内的肝胆代谢系统，造成大鼠体内肝细胞的胆固醇氧化紊乱，使得大鼠初级胆汁酸生物合成通路上调，继而提高了大鼠尿液中的胆汁酸水平。因此，未来可通过观察尿液中胆汁酸类化合物的代谢水平监测肌筋膜触发点的活化程度。
此外，此次代谢组学研究也表明肌筋膜触发点造模对花生四烯酸代谢通路显著上调，结果造成大鼠尿液内白三烯E4和19(S)-赫特含量升高。白三烯是花生四烯酸经5-脂氧合酶(5-LOX)途径代谢产生的一组炎性递质，可增加毛细血管壁的通透性，促使炎症细胞释放具有提高痛觉敏感性的炎症因子[33]。多项研究也表明，尿液内白三烯E4水平的增加与机体疼痛风险的升高有关[34-35]。因此，作者认为骨骼肌损伤所致的肌肉疼痛可通过末端肌腱水肿激活炎症因子大量堆积，致使大鼠体内炎症因子水平升高。另外，此次研究也发现细胞色素P450对外源性物质的代谢通路障碍也造成了3，4-二氢-3-羟基-4-S-谷胱甘肽溴苯和3，4-二阿魏酰奎宁酸2种代谢物在肌筋膜触发点大鼠尿液中显著性上调。3，4-二氢-3-羟基-4-S-谷胱甘肽溴苯是一种寡肽类的有机化合物。有研究报道称，寡肽可通过抑制凋亡因子Bax蛋白的表达而降低骨骼肌细胞凋亡指数，增加肌球蛋白的表达，保护线粒体膜，稳定线粒体膜电位，进而抑制活性氧的产生，降低胞浆游离钙浓度，促进骨骼肌损伤的修复[36]。而3，4-二阿魏酰奎宁酸是一种奎宁酸衍生物类化合物。研究显示，奎宁酸可抑制MAPK信号通路的激活，降低核因子κB活性，抑制下游炎症因子表达，进而减轻炎症反应，特别是在抵抗类风湿性关节炎的活性方面表现突出[37-38]。因此，此次研究中肌筋膜触发点大鼠尿液中这两类代谢物的上调与骨骼肌损伤造成的线粒体功能障碍和炎症增加有关。
此次研究利用代谢组学技术检测出慢性肌筋膜触发点大鼠体内初级胆汁酸生物合成通路和花生四烯酸代谢通路障碍，特别是尿液中胆汁酸类化合物可能显著上调。这在一定程度上能为肌筋膜触发点患者临床早期预警提供线索，从生物代谢角度阐释慢性肌筋膜触发点的病理机制，为阐明肌筋膜触发点生物学本质提供新的方法与思路。
但由于受到多方面条件限制，此次研究的样本量不够大且未进行差异代谢物的验证，因此后续将针对鉴定得到的潜在差异代谢物进行验证，并将继续通过多中心、大样本临床试验进一步靶标代谢组学以明确肌筋膜触发点的代谢特征标志物，以期为肌筋膜触发点的多元化诊断提供生物学基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析

Metabolomic analysis of urine in a rat model of chronic myofascial trigger points

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