三七治疗骨关节炎机制：基于UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟

doi:10.12307/2025.330

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (8): 1751-1760.doi: 10.12307/2025.330

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三七治疗骨关节炎机制：基于UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟

陈跃平1，陈锋2，彭清林2，陈荟伊3，董盼锋1

1广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011；2广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；3哈尔滨医科大学，黑龙江省哈尔滨市 150086

收稿日期:2024-03-20 接受日期:2024-04-30 出版日期:2025-03-18 发布日期:2024-07-06
通讯作者: 董盼锋，硕士，副主任医师，硕士生导师，广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530011
作者简介:陈跃平，男，1971年生，湖南省益阳市人，汉族，博士，主任医师，教授，博士生导师，主要从事骨与关节疾病及运动损伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82360937)，项目参与人：董盼锋；广西壮族自治区临床重点专科(创伤外科)建设项目(部门预算社(2023)1号)，项目负责人：陈跃平；广西中医药适宜技术开发与推广项目(GZSY22-36)，项目参与人：陈跃平；广西中医药大学A类“桂派中医药传承创新团队”项目(2022A004)，项目负责人：陈跃平

Based on UHPLC-QE-MS, network pharmacology, and molecular dynamics simulation to explore the mechanism of Panax notoginseng in treating osteoarthritis

Chen Yueping1, Chen Feng2, Peng Qinglin2, Chen Huiyi3, Dong Panfeng1

1Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China

Received:2024-03-20 Accepted:2024-04-30 Online:2025-03-18 Published:2024-07-06
Contact: Dong Panfeng, Master, Associate chief physician, Master’s supervisor, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Yueping, MD, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82360937 (to DPF [project participant]); Guangxi Zhuang Autonomous Region Clinical Key Specialty (Trauma Surgery) Construction Project, No. (2023)1 (to CYP); Guangxi Appropriate Technology Development and Promotion of Traditional Chinese Medicine, No. GZSY22-36 (to CYP [project participant]); Gui’s TCM Inheritance and Innovation Team Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2022A004 (to CYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
质谱：是一种分析技术，主要用于测量离子的荷质比。质谱能有效分析同位素组成、有机结构及元素内容等，提供一次分析中的丰富结构信息，具有较高的特异性和高灵敏度，被广泛应用于各种领域中。
分子动力学模拟：是一种计算模拟方法，通过求解牛顿运动定律对分子系统中每个原子的运动进行模拟，计算系统中所有原子之间的相互作用力和相应的势能，并以此为基础推算原子的加速度、速度和位置变化。分子动力学模拟术能够在原子级别上观察分子在一定时间内的行为和演化，进而分析分子结构的动态变化、热力学性质、反应动力学等。

背景：课题组前期研究发现三七能够修复骨细胞的形态结构，对于治疗骨关节炎具有良好的应用前景，但目前对于三七的具体作用机制尚不清楚。
目的：采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-Q exactive-mass spectrometry，UHPLC-QE-MS)技术鉴定三七的主要成分，并结合网络药理学、分子对接和分子动力学模拟探究三七治疗骨关节炎的作用机制。
方法：利用UHPLC-QE-MS技术鉴定三七的主要成分后，运用TCMSP数据库筛选活性成分，通过TCMSP和Uniprot数据库查找活性成分靶点，通过疾病数据库筛选骨关节炎靶点。在药物靶点与疾病靶点取交集后，导入STRING数据库和 Cytoscape软件构建蛋白互作网络筛选关键靶点，通过“活性成分-作用靶点”网络筛选关键活性成分。再对关键靶点进行富集分析，并对关键活性成分和关键靶点进行分子对接验证，最后选取结合能最低的结果进行分子动力学模拟。
结果与结论：①在三七溶液中共鉴定出57种活性成分，成分靶点与疾病靶点交集50个，关键活性成分5个(槲皮素、熊脱氧胆酸、山奈酚、柚皮素和红藻氨酸)，关键靶点5个(白细胞介素6、基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、白蛋白和趋化因子配体2)；②基因本体功能富集642个条目，其中620个条目代表生物过程，21个条目代表分子功能，1个条目代表细胞成分；京都基因与基因组百科全书通路分析63条通路，主要涉及雌激素信号通路、白细胞介素17信号通路和高糖基化终末产物-高糖基化终末产物受体信号通路；③分子对接显示关键活性成分和关键靶点结合活性良好，分子动力学模拟提示槲皮素和基质金属蛋白酶9间的相互作用稳定；④对三七成分进行了较全面研究，初步阐明了其药效物质基础，预测三七可通过多组分、多靶点、多途径和多通路发挥抗炎、软骨保护和免疫调节作用来治疗骨关节炎。
https://orcid.org/0000-0003-3860-1568(陈跃平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 三七, 骨关节炎, 分子动力学模拟, 质谱, 分子对接, 网络药理学

Abstract: BACKGROUND: Our previous research found that Panax notoginseng can repair the morphological structure of bone cells, which has a good application prospect in the treatment of osteoarthritis, but the specific mechanism of Panax notoginseng is still unclear.
OBJECTIVE: To identify the main components of Panax notoginseng using ultra-high performance liquid chromatography-Q exactive-mass spectrometry (UHPLC-QE-MS), and to explore the mechanism of Panax notoginseng in the treatment of osteoarthritis by combining network pharmacology, molecular docking and molecular dynamics simulation.
METHODS: After identifying the main components of Panax notoginseng by UHPLC-QE-MS technology, the active components were screened by TCMSP database, and the targets of active components were found by TCMSP and Uniprot database. Osteoarthritis targets were screened out through disease databases. After the intersection of drug targets and disease targets, the protein-protein interaction network was constructed by importing STRING database and Cytoscape software, and the “active ingredient-action target” network was constructed to screen key active ingredients. Then the key targets were enriched and analyzed, and the key active components and key targets were verified by molecular docking. Finally, the results with the lowest binding energy were selected for molecular dynamics simulation.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 57 active components were identified in the solution of Panax Notoginseng, including 50 intersection targets of components and disease targets, 5 key active components (quercetin, ursodeoxycholic acid, kaempferol, naringenin and erythrocyanine), and 5 key targets (interleukin 6, matrix metalloproteinase 9, interleukin 1β, albumin and recombinant chemokine c-motif ligand 2). Gene ontology enriched 642 entries, among which 620 entries represent biological processes, 21 entries represent molecular functions, and 1 entry represents cellular components. Kyoto encyclopedia of genes and genomes analysis indicated 63 pathways, mainly including estrogen signaling pathway, interleukin 17 signaling pathway and hyperglycosylation end product-hyperglycosylation end product receptor signaling pathway. Molecular docking showed good binding activity of key active components and key targets. Molecular dynamics simulation indicated that the stable interaction between quercetin and matrix metalloproteinase 9. The composition of Panax notoginseng was comprehensively studied, and the material basis of its efficacy was preliminarily clarified. It was predicted that Panax notoginseng could play an anti-inflammatory, cartilage-protective, and immunomodulatory role in treating osteoarthritis through multiple components, targets, approaches and pathways.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Panax notoginseng, osteoarthritis, molecular dynamics simulation, mass spectrometry, molecular docking, network pharmacology

中图分类号:

陈跃平, 陈锋, 彭清林, 陈荟伊, 董盼锋. 三七治疗骨关节炎机制：基于UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1751-1760.

Chen Yueping, Chen Feng, Peng Qinglin, Chen Huiyi, Dong Panfeng . Based on UHPLC-QE-MS, network pharmacology, and molecular dynamics simulation to explore the mechanism of Panax notoginseng in treating osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(8): 1751-1760.

图/表（结果） 13

2.1 三七主要成分的获取根据质谱检测结果，获得三七溶液在正离子(图1A)和负离子(图1B)全扫描模式下的总离子色谱图。通过质谱碎片检测得到大量的质谱峰，将其理论值与实测值进行比对，计算相对误差后共鉴别出2 042个主要成分。
2.2 三七活性成分靶点和骨关节炎靶点的预测将2 042个主要成分导入TCMSP数据库，剔除1 985个不符合条件的成分后，共筛选出57个活性成分，见表1。整合57个活性成分对应的靶标蛋白后，运用Uniprot数据库查询靶蛋白对应的基因名，共得到329个活性成分靶点。合并GeneCard、OMIM、TTD和PharmGKB数据库中获得的靶点，去重得到306个骨关节炎相关靶基因(图2A)。再通过构建Venn图预测“三七-骨关节炎”共有靶点，结果显示三七对应的329个靶基因与骨关节炎相关的306个靶基因相互映射，得到共有靶点50个(图2B)。
2.3 蛋白互作网络分析及 “活性成分-作用靶点”网络构建将获得的50个共有靶点导入STRING数据库，得到蛋白互作网络，再利用 Cytoscape软件对蛋白互作网络进行可视化分析(图3)。图中共涉及49个节点、687条边，根据度值筛选出排名前5的蛋白基因为白细胞介素6、基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、白蛋白和趋化因子配体2，这些蛋白基因在整个网络中发挥着关键的作用，可能是三七治疗骨关节炎的关键靶点，其基本信息见表2。将活性成分与共有靶点间的作用关系导入Cytoscape软件，构建三七治疗骨关节炎的“活性成分-作用靶点”网络(图4)，该网络中度值排名前5的活性成分分别是槲皮素、熊脱氧胆酸、山奈酚、柚皮素和红藻氨酸，为该网络的关键活性成分，对治疗骨关节炎具有重要的意义。
2.4 富集分析在GO富集分析关键靶点的功能过程中，共确定642个条目，其中620个条目代表生物过程，主要涉及神经炎症反应的调节、细胞对白细胞介素1的反应、CD4阳性α-βT细胞细胞因子产生和细胞对脂多糖的反应等方面；1个条目代表细胞成分，涉及内质网腔；21个条目代表分子功能，主要涉及细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性和生长因子受体结合。GO分析结果得出的

生物过程、细胞成分及分子功能与骨关节炎的发生发展过程密切相关(图5A)。KEGG富集分析关键靶点共确定了63个条目，主要涉及雌激素信号通路、白细胞介素17信号通路和高糖基化终末产物-高糖基化终末产物受体信号通路(图5B)。
2.5 分子对接利用Auto Dock等软件将白细胞介素6(PDB ID：8D82)、基质金属蛋白酶9(PDB ID：4H3X)、白细胞介素1β(PDB ID：5R8J)、白蛋白(PDB ID：6HN1)、趋化因子配体2(PDB ID：6CTW)与槲皮素(Pubchem CID：5280343)、熊脱氧胆酸(Pubchem CID：31401)、山奈酚(Pubchem CID：5280863)、柚皮素
(Pubchem CID：439246)、红藻氨酸(Pubchem CID：10255)进行分子对接

模拟，根据对接结果绘制结合能热图，见图6，若结合能≤-21 kJ/mol说明两者有较好结合活性[13]。研究所得结果均<-21 kJ/mol，说明关键活性成分和关键靶点具有较好的结合活性。选取结合能最低的槲皮素和基质金属蛋白酶9进行分子对接展示，见图7。
2.6 分子动力学模拟使用分子动力学技术模拟槲皮素和基质金属蛋白酶9复合物的稳定性和灵活性，评估二者的相互作用。均方根偏差是评估蛋白质结构变化的指标，此次模拟计算了槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的均方根偏差值(图8A)，在时间为100 ns的模拟过程中，槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的均方根偏差值较大，之后逐渐趋于平稳，整体来看均方根偏差值维持在一个较小的范围内(< 0.6)，说明槲皮素和基质金属蛋白酶9的结合比较稳定。均方根波动是评估蛋白质动态性的指标，此次模拟计算了槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的均方根波动值(图8B)，基质金属蛋白酶9的均方根波动值在结合部分较小，而在非结合部分较大，说明槲皮素能够使基质金属蛋白酶9的结构域柔性更大、更容易产生构象的改变。旋转半径是评估蛋白质整体紧凑程度的指标，此次模拟计算了槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的旋转半径(图8C)，结果显示槲皮素和基质金属蛋白酶9结合后的旋转半径相较于未结合前有所下降，说明槲皮素的结合使基质金属蛋白酶9更加紧凑。溶剂可及表面积是评估蛋白质表面积的指标，此次模拟计算了槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的溶剂可及表面积(图8D)，结果显示在槲皮素和基质金属蛋白酶9结合之前，基质金属蛋白酶9的溶剂可及表面积较大，而在结合后则有所下降，说明槲皮素的结合使得基质金属蛋白酶9表面积减小。此次模拟计算了槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的氢键(图8E)，结果显示，

在模拟过程中槲皮素和基质金属蛋白酶9之间形成了许多氢键，其中以基质金属蛋白酶9中的关键残基和槲皮素中重要基团之间的氢键为主。自由能形貌图反映了体系中分子之间的相互作用和能量分布，有助于理解槲皮素和基质金属蛋白酶9之间的相互作用、构象和稳定性等特征，在此次模拟中自由能形貌图上有一个低能量区域(图9)，这意味着在模拟过程中分子结构存在一个相对稳定的状态，主要集中在90 ns附近。在这个低能量区域，分子结构可能与初始结构相似度较高且结构相对紧凑，表明在模拟过程中分子可能会在这个状态下停留较长时间，显示出稳定性。

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引言

骨关节炎是一种以关节软骨退变钙化、软骨下骨重塑、骨赘形成、滑膜炎症和血管侵袭为特征的慢性退行性疾病[1-2]。流行病学研究显示，骨关节炎影响全世界超过5亿的人口，已经成为老年人慢性疼痛和残疾的主要原因[3]。
中医学根据骨关节炎的临床症状及病因病机特点，将其归纳为“痹证”范畴。随着年龄的增长及过度的关节活动可导致“肝气衰”，从而使关节老化，影响正常功能，故骨关节炎的主要病因有：肝肾亏虚，筋骨失养；长期劳损，血瘀气滞；风寒湿邪，痹阻经络等[4]。
三七是中国中医史上经典药材，主要取其“止血不留瘀，行血不出血”之功，已被广泛应用于中医临床，并取得了显著的治疗效果[5-6]。课题组前期研究发现，三七具有修复骨细胞形态结构、保护血管内皮细胞、维持血液微循环稳态、减轻线粒体肿胀、减少脂肪细胞及脂肪滴等作用，具有治疗骨关节炎的潜力[7]。现代药理学研究发现，三七不仅能通过抑制软骨下骨中异常的破骨细胞生成来防止骨关节炎进展，还可通过调控PI3K/AKT信号通路延缓关节软骨的降解，从而保护软骨细胞免于衰老和凋亡[8-9]。因此，深入研究三七的具体作用机制对于治疗骨关节炎具有重要意义。此次研究采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-Q exactive-mass spectrometry，UHPLC-QE-MS)技术对三七进行成分鉴定[10]，再运用中药系统药理学数据库及分析平台进行网络药理学分析[11]，最后进行分子对接和分子动力学模拟验证[12]，基于质谱鉴定、网络药理学预测结果、分子对接和分子动力学模拟探究三七干预骨关节炎的作用机制，以期为三七的临床应用提供更多的科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟研究。
1.2 时间及地点实验于2024年1-3月在广西中医药大学附属瑞康医院完成。
1.3 材料
1.3.1 药品和试剂三七(产品批号：20230922，购于广西中医药大学附属瑞康医院)；甲醇(CAS：67-56-1，纯度：LC-MS级，购于上海乾思生物科技有限公司)；乙腈(CAS：75-05-8，纯度：LC-MS级，购于上海乾思生物科技有限公司)；甲酸(CAS：64-18-6，纯度：LC-MS级，购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司)；L-2-氯苯丙氨酸(CAS：103616-89-3，纯度：≥98%，购于上海恒柏生物科技有限公司)。
1.3.2 实验仪器 Vanquish超高效液相(赛默飞世尔公司，美国)；Orbitrap Exploris 120高分辨质谱(赛默飞世尔公司，美国)；JXFSTPRP-24研磨仪(上海净信科技有限公司，中国)；Heraeus Fresco17离心机(赛默飞世尔公司，美国)；明澈 D24 UV纯水仪(默克密理博公司，德国)；YM-080S超声仪(深圳市方奥微电子有限公司，中国)；BSA124S-CW天平(赛多利斯公司，德国)；UPLC BEH C18色谱柱(沃特世公司，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 利用UHPLC-QE-MS技术检测三七成分将三七样本以60 Hz的频率研磨120 s。取100 mg的研磨样本加入500 μL提取液中(甲醇∶水=4∶1，内标质量浓度：10 μg/mL)，进行30 s的涡旋处理，随后以45 Hz的频率匀浆4 min，在冰水浴中超声处理1 h。完成后，在-40 ℃下静置样本1 h，再将样本在4 ℃下12 000 r/min离心15 min(离心力13 800×g，半径8.6 cm)，保留上清液。最后，通过0.22 μm微孔滤膜过滤上清液，得到用于后续定性分析的三七供试品溶液。
色谱条件：①选用UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)，进样体积为5 μL；②当进行三七样品的液相色谱分析时，使用以下梯度条件：从0-11 min，流速为500 μL/min，A相为85%水，B相为15%乙腈；在第11分钟时，B相逐渐增加至75%，A相降至25%，并维持至第12分钟；B相在接下来的2 min内增加至98%，而A相减少至2%，持续到第14分钟；在14.1 min时，梯度回到初始条件，A相恢复至85%，B相降至15%，并保持至第16分钟结束；③A和B相中都加入0.1%甲酸。
质谱条件：通过Xcalibur软件控制Orbitrap Exploris 120质谱仪，实现FullScan-ddMS2功能的一级和二级质谱数据采集。具体设定参数：鞘气流速：35 Arb，辅助气流速：15 Arb，离子传输管温度和蒸发器温度：350 ℃，全质谱分辨率：60 000，MS/MS分辨率：15 000，碰撞能量：在NCE模式下为16/32/48，喷雾电压：5.5 kV (正)/-4 kV (负)。
质谱数据分析：使用ProteoWizard软件将原始数据转换成mzXML格式后，利用R语言的“XCMS”包对数据进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分处理后得到鉴定结果。完成初步的数据处理后，对鉴定结果进行一级质谱数据比对(相对误差< 10×10-6)，确保鉴定结果的可靠性和准确性。在一级质谱数据的基础上进行二级质谱分析比对，最终确认三七的主要成分。
1.4.2 三七活性成分靶点和骨关节炎靶点的预测将鉴定得到的主要成分导入TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)的“Chemical name”模块，查找与活性成分对应的靶蛋白(如果无该成分检索结果，或该成分无对应的靶蛋白，则剔除该成分)。再运用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)查询靶蛋白对应的基因名。删除重复项后，所得结果即为三七的活性成分靶点。将骨关节炎的英文名“osteoarthritis”作为检索词检索GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)和PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)数据库获取骨关节炎的疾病靶点。合并4个数据库的检索结果后，将其与三七活性成分靶点进行映射取交集，得到共有靶点。
1.4.3 关键靶点获取及 “活性成分-作用靶点”网络构建在STRING数据库(https://string-db.org/)中输入共有靶点的基因名，设定物种为“Homo sapiens”，并设定连接评分阈值大于0.4，获取蛋白互作网络。将结果导入Cytoscape软件进行可视化处理，使用Network analyzer计算度值，获得三七治疗骨关节炎的关键靶点；同时构建三七治疗骨关节炎的“活性成分-作用靶点”网络图，并根据度值获取关键活性成分。
1.4.4 富集分析利用R语言的“cluster Profiler”包进行生物信息学分析是研究三七治疗骨关节炎生物功能的有力工具。针对关键靶点进行基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析，以深入了解其在生物功能、细胞成分和分子功能等方面的作用。此外，对关键靶点进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析，以揭示三七治疗骨关节炎的潜在信号通路，最后利用R语言的“ggplot2”包进行可视化处理。
1.4.5 分子对接对获取的关键活性成分和关键靶点进行分子对接。通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索关键活性成分，并下载其2D结构导入到Chem Office软件中，以绘制关键活性成分的3D结构图，在此过程中选择结构优化功能以实现能量最小化并保存为mol2格式。接着，通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载与关键活性成分结构最匹配的关键靶点3D结构，利用PyMOL对其进行去水、分离原配体操作，再利用AutoDock Tools 1.5.6将文件转换为pdbqt格式并寻找活性口袋，最后通过AutoDock Vina软件进行分子对接及可视化处理。
1.4.6 分子动力学模拟选取分子对接结果中结合能最低的活性成分和靶点进行分子动力学模拟，探究蛋白质与小分子的结合情况，评估二者间的相互作用。此次研究所使用的体系为蛋白质与小分子复合物，包含一个靶点的蛋白质分子和一个活性成分小分子，使用Gromacs软件进行模拟，具体步骤如下：首先使用AmberTools22对小分子添加GAFF力场同时使用Gaussian16W对小分子进行加氢和计算RESP电势操作，再将蛋白质分子和小分子的结构文件导入Gromacs软件，通过pdb2gmx和gmxeditconf命令生成拓扑文件和模拟盒子。模拟条件在静态温度26.85 ℃和标准大气压100 kPa下进行，力场采用Amber99sb-ildn，溶剂选择水分子(采用Tip3p水模型)，并通过添加合适数量的Na+来中和模拟系统的总电荷。采用最陡下降法对活性成分和靶点的结构进行能量最小化处理，随后使用gmxgrompp和gmxmdrun命令分别进行100 000步的等温等容系综平衡和等温等压系综平衡，耦合常数为0.1 ps，持续时间为100 ps模拟。最后运行自由分子动力学模拟，共计5 000 000步，步长2 fs，共计时长100 ns。在完成模拟后，使用gmxrms命令计算蛋白质与小分子之间的均方根偏差、均方根波动、旋转半径、溶剂可及表面积、氢键和自由能等。
1.5 主要观察指标 ①三七的的主要成分；②三七与骨关节炎的潜在联系；③三七关键活性成分与骨关节炎关键靶点间的作用关系。

讨论

UHPLC-QE-MS技术结合了色谱的高效分离性能与质谱的精确识别能力，因此被广泛应用于药物的分析和检测工作[10]。此次研究应用UHPLC-QE-MS技术对三七化学成分进行鉴定，建立三七溶液正/负离子全扫描模式质谱图，并将所得结果与网络药理学结合得到三七治疗骨关节炎的关键活性成分槲皮素、熊脱氧胆酸、山奈酚、柚皮素和红藻氨酸，关键靶点白细胞介素6、基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、白蛋白和趋化因子配体2。研究发现，槲皮素和山奈酚可有效降低白细胞介素6、白细胞介素1β和趋化因子配体2等炎症因子的水平，进而减少活性氧诱导的氧化应激和炎症；此外，槲皮素和山奈酚还可有效抑制M1的极化效应，降低基质金属蛋白酶9的表达，增强M2巨噬细胞极化，发挥确切的抗炎和软骨保护作用[14-17]。MOON等[18]的研究显示，口服熊去氧胆酸降低了关节软骨中白细胞介素6、白细胞介素1β等炎症因子和基质金属蛋白酶9 mRNA的表达，同时显著减少软骨下骨中的破骨细胞数量，可有效缓解疼痛并减轻软骨退化。一项对继发性骨质疏松症大鼠的研究表明，柚皮素处理后白细胞介素6、白细胞介素1β等炎症因子释放减少，减少了骨吸收和骨矿物质沉积，表现出显著的抗氧化、抗炎和植物雌激素活性，表明柚皮素在减轻骨丢失和预防骨关节炎方面具有巨大潜力[19]。红藻氨酸具有抗氧化、抗炎症和免疫调节等生物活性，可能对身体的抗氧化防御系统产生积极影响[20]。以上研究充分证实了三七活性成分在骨关节炎的治疗中有良好的抗炎、软骨保护和免疫调节作用；此外，既往大量文献研究表明这些关键靶点在骨关节炎的治疗和发病机制中发挥着关键作用[21-23]。
蛋白互作网络揭示了49个靶点之间的相互关系，表明它们并非孤立存在，而是展现出密切的相互作用，其中白细胞介素6、基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、白蛋白和趋化因子配体2这5个靶点在整个网络中扮演着至关重要的角色。在“活性成分-作用靶点”网络中，靶基因受到三七多种活性成分的调节，凸显了中医药疗法多成分、多靶点的特点[24]。进一步对关键靶点进行富集分析显示，雌激素信号通路、白细胞介素17信号通路和高糖基化终末产物-高糖基化终末产物受体信号通路是骨关节炎网络中的主要通路，该结果与既往研究一致[25-27]，表明上述通路在骨关节炎的发生发展中具有重要影响。研究表明，雌激素信号通路在调节骨密度、软骨退化中发挥重要作用，雌激素相关受体α与雌激素相关受体γ在雌激素反应元件作用下可与骨关节炎靶基因特异性结合，参与软骨细胞的生成与分化[28-30]。LIU等[31]发现白细胞介素17通过促进炎症反应、增加关节软骨破坏以及激活其他炎症细胞直接参与了骨关节炎的病理过程，与疼痛紧密关联。研究发现白细胞介素17可导致关节组织中的炎症递质释放增加，从而引发关节疼痛和功能障碍，因此，通过阻断白细胞介素17信号通路有望减缓骨关节炎的发展并减轻相关的疼痛症状。高糖基化终末产物-高糖基化终末产物受体信号通路是核因子κB信号通路的上级通路，二者活化后会导致炎症因子的表达增多，进而降低软骨结构弹性，加速软骨磨损，通过抑制其一均能打破二者间的恶性循环，从而降低氧化应激与炎症反应的有害影响，防止软骨细胞损伤[32-34]。此次研究结果表明，三七有效成分可以通过作用于多种生物学过程和信号通路，发挥抗炎、止痛和促进软骨细胞生成分化等作用，从而发挥治疗骨关节炎的作用。
分子对接结果显示，三七的关键活性成分与关键靶点展现出良好的对接活性，这一预测结果为三七中活性成分作用于特定靶点的治疗提供了理论依据。而在所有对接结果中，槲皮素和基质金属蛋白酶9的亲和力最高，体现其内在的高生物活性，因此对槲皮素和基质金属蛋白酶9进行分子动力学模拟，进一步探究二者的结合模式和稳定性以及可能的生物学效应。
分子动力学模拟是一种强大的计算模拟方法，已被广泛应用于研究分子在不同环境中的运动、结构和相互作用。通过模拟原子运动提供详细的分子动力学信息，可深入探讨分子在生物学中的行为。分子动力学模拟不仅可以探索分子静态结构，还可模拟不同条件下的动态变化，揭示分子相互作用的特性，这一方法为理解生物分子机制、药物与受体互动提供重要支持[35-36]。此次研究利用分子动力学模拟对槲皮素和基质金属蛋白酶9的结合进行更深入的分析，在槲皮素与基质金属蛋白酶9的分子动力学模拟中，均方根偏差结果显示它们结合较为稳定，均方根的波动显示槲皮素增大了基质金属蛋白酶9的结构域柔性，旋转半径减小表明结合后基质金属蛋白酶9更加紧凑，溶剂可及表面积下降表示结合后的基质金属蛋白酶9表面积减小，并且槲皮素和基质金属蛋白酶9之间形成许多氢键。自由能形貌图显示分子结构在90 ns附近处于最稳定、结构最紧凑的状态。综合上述结果，作者可以认为槲皮素和基质金属蛋白酶9相互作用对蛋白分子整体结构的稳定性、内部结构的稳定性、紧凑性、表面特征和相互作用强度等方面均表现出良好的特征和稳定性。
综上所述，此次研究应用UHPLC-QE-MS技术对三七的活性成分进行快速、全面识别，可为进一步研究三七治疗骨关节炎及阐明三七药理作用提供依据；同时，基于网络药理学、分子对接和分子动力学模拟结果提示三七可通过抗炎、软骨保护和免疫调节发挥抗骨关节炎的作用，可为三七治疗骨关节炎的实验和临床研究提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

三七治疗骨关节炎机制：基于UHPLC-QE-MS、网络药理学及分子动力学模拟

Based on UHPLC-QE-MS, network pharmacology, and molecular dynamics simulation to explore the mechanism of Panax notoginseng in treating osteoarthritis

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