2.1   原发性骨质疏松症相关差异基因的获取及分析   该研究中GSE35958数据集进行标准化，把符合P < 0.05和|log2 FC| > 1标准的基因进行差异分析得到126个差异基因，并根据差异基因在不同样本中的表达情况绘制成表达热图，见图1。GSE35958数据集相关信息见表3。
2.2   差异基因的通路分析结果   为了探究差异基因的通路分析，文章分别进行基因本体分析及京都基因和基因组百科全书分析，见图2。
   基因本体分析表明，差异基因在








对细胞外刺激的反应、细胞对氧化应激的反应以及自噬的调节等生物过程中发挥作用，在细胞组分中，与自噬体、核被膜以及过氧物酶体等；在分子功能中，主要在DNA结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合以及泛素样蛋白连接酶结合等发挥作用。京都基因和基因组百科全书的生物学机制分析显示，交集基因主要聚集在人巨细胞病毒感染、自噬以及细胞衰老等信号通路中。
2.3   蛋白质相互作用网络分析结果   使用STRING数据库构建了原发性骨质疏松中与核心差异基因相互作用的潜在蛋白质作用网络，见图3。结果中显示位于网络中心的核心基因影响其他基因在生物系统中的关系，共包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、丝裂原活化蛋白激酶14、赖氨酸脱甲基酶6B及小鼠双微体2等27个核心基因，最后选取该网络中的27个核心基因进行生物标志物筛选。
2.4   生物标志物的筛选与验证结果   该研究通过最小绝对收缩选择算子逻辑回归算法从27个核心基因中鉴定出前列腺素、表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶3、转化生长因子B1和视网膜母细胞瘤基因1等5个原发性骨质疏松相关的生物标志物，见图4A。
受试者工作特征分析曲线显示出它们具有较高的精确性，其中前列腺素的曲线下面积为1.000，表皮生长因子受体的曲线下面积为0.950，丝裂原活化蛋白激酶3的曲线下面积为1.000，转化生长因子B1的曲线下面积为1.000，以及视网膜母细胞瘤基因1的曲线下面积为1.000，见图4B-F。这些生物标志物在对照组即正常组织中与实验组即原发性骨质疏松组织中的差异表达分析显示，实验组中前列腺素、表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶3以及转化生长因子B1的表达水平均明显高于对照组样本(P < 0.05)，见图4G-J；而视网膜母细胞瘤基因1在实验组表达量明显低于对照组样本(P < 0.05)，见图4K。
2.5   生物标志物的免疫分析结果   该研究中免疫分析结果表明，细胞免疫在原发性骨质疏松中起重要作用。通过CIBERSORT算法分析生物标志物在不同免疫细胞浸润情况，表皮生长因子受体与辅助型T细胞1密切关联，视网膜母细胞瘤基因1在巨噬细胞中显著聚集见图5。
2.6   生物标志物的基因富集分析结果   将原发性骨质疏松的生物标志物进行基因富集分析。前列腺素的分析结果表明，其高表达可能影响蛋白酶体和EB病毒感染等方面，低表达可能与抗坏血酸和醛达酸代谢等方面有关，见图6A。表皮生长因子受体的分析结果表明，其高表达可能影响同种异体移植排斥及自身免疫性甲状腺疾病等，低表达可能影响移植物抗宿主疾病等，见图6B。丝裂原活化蛋白激酶3的分析结果表明其与JAK?STAT信号通路、同种异体移植排斥及爱帕琳肽信号通路相关，见图6C。转化生长因子B1的分析结果表明，其与同种异体移植排斥、抗坏血酸和醛达酸代谢、自身免疫性甲状腺疾病等通路相








关，见图6D。视网膜母细胞瘤基因1的分析结果表明其与Ras相关蛋白1信号通路、同种异体移植排斥以及自身免疫性甲状腺疾病等显著相关，见图6E。
2.7   药物标靶网络分析结果   将获得的原发性骨质疏松生物标志物建立药物标靶网络，可以看到生物标志物与原发性骨质疏松相关药物基因的关系，见图7。其中转化生长因子B1与非苏木单抗、美替木单抗有协同作用；丝裂原活化蛋白激酶3与ERK激酶抑制剂Ravoxertinib存在协同作用；表皮生长因子受体与拉帕替尼、泛表皮生长因子受体小分子抑制剂以及伊马曲单抗等药物具有协同作用。
2.8   各标志物基因的qPCR验证结果   在以上生物信息学分析的基础上，收集原发性骨质疏松患者及正常健康人外周血清，提取RNA进行qPCR分析，结果表明前列腺素、表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶3和转化生长因子B1在原发性骨质疏松患者的外周血清中转录水平上升(P < 0.001)，见图8；而视网膜母细胞瘤基因1在原发性骨质疏松患者的外周血清中转录水平下降(P < 0.001)，见图8。qPCR结果与文章的模型表现出良好的吻合度。

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骨质疏松症是全身性骨骼疾病，被称为“21世纪的无声流行病”，在全球范围内非常普遍，以骨密度降低、骨组织退化、骨微结构破坏、骨强度受损和骨折为特征[1]，影响患者生活质量，增加死亡率和经济负担。雌激素水平降低、吸烟、体质量以及免疫因素等都对骨质疏松症的发生发展产生影响[2-7]。原发性骨质疏松占骨质疏松症患者约95%[6]，常认为由于骨吸收过多致其与骨生成间平衡被破坏所致，骨吸收增加会降低骨量，破坏骨质连续性而抑制骨形成[8-9]。及时开展适当治疗，对骨代谢调节及降低骨质疏松患者骨折的发生至关重要[10]，防止骨折及后续并发症。而目前生化指标对骨质疏松症早期临床诊断敏感性较低，急需新的潜在生物标志物来预测骨质流失的发生[11]。原发性骨质疏松治疗药物主要有抗分解代谢药、骨形成剂和雌激素等，可通过抑制骨吸收维持骨密度；此外，补充钙质、加强骨骼力量是重要辅助手段[12]，体育锻炼也可以预防原发性骨质疏松，降低骨折风险[13]。然而，骨质疏松症的治疗效果往往都十分有限，通常需要持续3-5年疗程，疗程较长且难以完全治愈，药物不良反应也严重影响患者健康。迫切需要探明原发性骨质疏松的发生及作用机制，寻找原发性骨质疏松的生物标志物，早期筛查并使用更有效或不良反应更少的治疗方法，实现诊疗一体化。
随着生物信息学的不断发展，基因微阵列分析已成为识别各种疾病中潜在生物标志物以及发生发展机制的有效方法，通过分析高维转录组数据并识别具有生物学意义的特征基因可以促进对疾病发病机制和治疗的了解。尽管以前的研究已经确定了一些原发性骨质疏松相关的潜在基因以及通路机制，如Wnt信号通路、Notch信号通路和P2X7受体等[14-16]，但目前针对原发性骨质疏松的研究仍处于早期阶段，有待进一步探究。基因微阵列分析的应用可以通过生物学方法帮助理解基因与骨组织工程之间的关系，尤其在早期确定及诊疗原发性骨质疏松的应用。通过基因微阵列分析，可以研究相关生物标志物对原发性骨质疏松的影响，进而为原发性骨质疏松的临床诊疗提供帮助。
该研究采用生物信息学方法，通过对基因表达综合数据库中GSE35958数据集进行原发性骨质疏松相关差异基因表达研究、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析以及基因本体(gene ontology，GO)分析、蛋白质-蛋白质相互作用分析、免疫细胞浸润分析、基因富集分析(gene enrichment analysis，GSEA)及药物标靶网络分析来确定原发性骨质疏松的生物标志物并使用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)进行验证，旨在通过生物信息学分析原发性骨质疏松的发生机制及潜在标志物，寻找原发性骨质疏松的生物标志物，以进行早期筛查和有效治疗，促进诊疗一体化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1   资料和方法   Data and methods
1.1   设计   通过生物信息学分析原发性骨质疏松患者骨髓样本中的差异基因及相关信号通路，然后通过原发性骨质疏松患者外周血清来进行验证，筛选确定原发性骨质疏松潜在的生物标志物和治疗靶点，组间数据比较采用独立样本 t 检验。
1.2   时间及地点   实验于2022年8月至2023年6月在南通大学附属医院创伤中心完成。
1.3   资料   
1.3.1   数据样本   从基因表达综合数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索与原发性骨质疏松相关的数据集，符合该研究目的并使用的数据集编号为GSE35958。该数据集包括4个正常人骨髓样本及5个原发性骨质疏松患者骨髓样本。该研究所用数据集均从公共数据库下载，正常人骨髓样本为对照组，原发性骨质疏松患者骨髓样本为实验组，实验中使用的软件及数据库见表1。

1.3.2   验证对象   该研究中收集了2022年9月至2023年6月来自南通大学附属医院11例临床原发性骨质疏松症患者和11例健康成人的外周血液样本，健康成人为对照组，原发性骨质疏松患者为实验组。
   该研究全部受试者均对研究内容知情同意，并签署知情同意书。该研究根据赫尔辛基宣言的原则进行，获得南通大学附属医院伦理委员会批准，审批时间：2019年9月，伦理审查号：2019-K078。
1.4   方法   
1.4.1   骨质疏松相关基因的筛选及差异分析   GSE35958数据集进行标准化后，用R软件中的“limma”包，P < 0.05和|log2 FC| > 1的基因被定义为差异基因，进行原发性骨质疏松症与正常样本之间的差异基因的筛选，观察差异基因在正常组与原发性骨质疏松组中的表达。
1.4.2   差异基因的基因本体分析及京都基因和基因组百科全书分析   筛选的差异基因通过R软件中的“clusterProfiler”包进行基因本体分析及京都基因和基因组百科全书分析，相关参与途径由P < 0.05为筛选标准来确定。京都基因分析包括生物过程、分子功能和细胞组分。京都基因和基因组百科全书通过分析差异基因所参与的代谢通路。
1.4.3   蛋白质-蛋白质相互作用网络的建立和核心基因的确定   筛选后的差异基因导入STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，随后利用R软件中的“STRIGdb”程序，将基因之间的联系进行网络可视化，并获取原发性骨质疏松相关的核心基因。
1.4.4   生物标志物筛选与验证   该研究通过将蛋白质-蛋白质相互作用网络确定的原发性骨质疏松相关的核心基因，用R软件中“glmnet”包最小绝对收缩选择算子逻辑回归算法进行原发性骨质疏松症相关生物标志物的筛选。将筛选后的生物标志物在原发性骨质疏松症组中与正常组中表达程度绘制箱型图，进行推导受试者工作特征分析，用R软件中“pROC”包计算曲线下面积值(area under the curve，AUC)，以确定这些生物标志物的准确性。
1.4.5   构建生物标志物的药物标靶网络   在DGIdb数据中，确定原发性骨质疏松症药物相关基因与生物标志物的相关性，利用Cytoscape 3.9.1软件构建了原发性骨质疏松症药物标靶网络，通过网络可以直观的反应出药物基因与生物标志物之间的关系。
1.4.6   生物标志物与免疫细胞相关性分析   既往有相关研究表明，免疫系统与原发性骨质疏松症的病理生理密切相关。在该研究中利用R软件中的“CIBERSORT”包分析生物标志物和免疫细胞之间相关性，进一步了解原发性骨质疏松症患者的免疫系统发生的变化。
1.4.7   生物标志物的基因集富集分析   为了更好地研究生物标志物的涉及的通路及功能，文章将筛选后的生物标志物进行基因集富集分析，将生物标志物高表达和低表达的情况分别进行富集分析，并将结果按顺序排列。
1.4.8   qPCR验证   参照Total RNA试剂盒说明书进行相应操作，从健康成人及原发性骨质疏松患者血清中提取总RNA(Vazyme，中国)并检测RNA纯度，参照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA(Takara，日本)，再参照QuantiTect SYBR® Green PCR试剂盒说明书进行qPCR反应(Takara，日本)，计算目标基因相对于内参基因表达量。引物均来自于Sangon Biotech(苏州，中国)，引物序列见表2。
1.5   主要观察指标   生物信息学分析筛选结果及标志物基因的qPCR验证结果。
1.6   统计学分析   数据统计分析均由SPSS 26.0统计学软件和R软件(4.1.3)进行。图像绘制由Cytoscape(v3.9.1)软件完成。所有计量数据表示为x±s。组间数据差异比较采用独立样本t检验，当P < 0.05时表明差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经通过南通大学统计学专家审核。

目前临床上对原发性骨质疏松的筛查主要通过评估个体骨折风险、个人和家族史、体格检查，对于有提示性表现如身高下降、背痛的患者，进行重点研究以排除骨脆性的继发性原因，并进行椎体影像学检查。同时，骨质疏松和骨折的风险随着年龄的增长呈指数增加，骨密度随年龄增长而下降。对老年人进行骨密度检测，可筛查原发性骨质疏松。由于没有明显的警示体征，许多患者直到骨折后才被诊断，带来不必要的后果。临床上对于原发性骨质疏松的治疗疗程长且不良反应多[17]。因此原发性骨质疏松患者需尽早进行诊断和评估并接受适当的治疗以降低风险，了解原发性骨质疏松的发生机制或者相关标志物有助于尽早的识别与治疗原发性骨质疏松。
该研究通过在公共基因表达数据库筛选原发性骨质疏松症差异基因数据，发现了GSE35959数据集中的差异基因。通过基因本体分析，该数据集中的原发性骨质疏松症差异基因主要集中在细胞外刺激的反应、细胞对氧化应激的反应以及自噬的调节等，都是近年来关于原发性骨质疏松的研究热点。其中氧化应激可能在原发性骨质疏松的发展过程中起到关键作用，许多学者研究了氧化应激与原发性骨质疏松之间的关系，氧化应激对骨代谢具有直接影响，其损伤主要包括氧化应激的直接作用和抗氧化酶活性的降低，可以通过抑制成骨标志物的表达[18]，形成凋亡体[19]、增加线粒体膜通透性等方式影响成骨细胞[20]，而对破骨细胞的分化却有积极作用[21]。抗氧化酶活性也被认为是骨质疏松的危险因素[22]。此外，氧化应激相关的两种病理生理状态：炎症和缺氧也是原发性骨质疏松患者的常见状态。研究表明通过激活AMPK信号通路可以抑制细胞内氧化应激并改善原发性骨质疏松[23]。骨质疏松使氧化应激和炎症水平升高，同时抗氧化活性显著下调，进一步促进骨质流失，核转录因子E2相关因子2的激活可以抑制氧化应激和破骨细胞相关蛋白包括核转录因子κB、白细胞介素6和活化T细胞核转录因子1的表达从而预防骨质疏松[24]。因此，抑制氧化应激对骨质疏松的治疗具有潜在作用。
文章在京都基因和基因组百科全书分析中发现，原发性骨质疏松相关差异基因存在于人巨细胞病毒感染、自噬以及细胞衰老等信号通路中。既往研究表明，巨细胞病毒感染可通过降低单核细胞中集落刺激因子1受体和核转录因子κB受体活化因子配体表达来抑制破骨细胞形成[25]，靶向去除衰老细胞可缓解年龄或化疗相关性的骨质流失[26-27]。自噬高度参与骨组织代谢，维持骨髓间充质干细胞来源细胞稳态；成骨细胞自噬受损使骨量减少，骨细胞自噬抑制会使骨组织衰老；自噬对成骨细胞分化和破骨细胞功能也有一定作用，可见自噬在骨重塑和再生中起着决定性作用[28-31]。而自噬与氧化应激也有密切的联系，氧化应激可诱导自噬，促进破骨细胞分化形成[32]。文章研究发现的潜在生物标志物前列腺素、表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶3及转化生长因子B1在自噬中具有多方面的作用，其介导自噬已被作为慢性疾病癌症等潜在治疗策略[33-36]。因此自噬及其与氧化应激反应间的联系，可能会是原发性骨质疏松的重要作用机制。
该研究通过最小绝对收缩选择算子逻辑回归算法得到了5个可能参与原发性骨质疏松发生发展的生物标志物，其中前列腺素、表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶3、转化生长因子B1在原发性骨质疏松中均高表达，而视网膜母细胞瘤基因1在原发性骨质疏松中低表达，并通过qPCR实验进行了验证，验证结果与文章的研究结果有良好的吻合度。表皮生长因子受体是酪氨酸激酶受体家族成员之一，酪氨酸激酶受体家族与原发性骨质疏松之间存在联系，TIAN等[37]发现Spry蛋白可通过酪氨酸激酶受体家族介导细胞外信号调节激酶信号传导影响成骨细胞分化。表皮生长因子受体激活会抑制细胞凋亡、增殖和迁移，激活炎症反应和增加黏液产生[38]，还可通过抑制成骨细胞转录因子的表达以及胰岛素样生长因子1受体及雷帕霉素靶蛋白通路来抑制成骨细胞分化，影响骨生成[39-40]。丝裂原活化蛋白激酶3参与多种基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用如增殖、分化和细胞周期进程等[41]，大量研究表明其与骨质疏松症之间的关系，可能参与骨质疏松症的发展。TANG等[42]研究发现成纤维细胞生长因子9可以通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进破骨形成。
长链非编码RNA可通过影响p38及丝裂原活化蛋白激酶信号通路，直接或间接参与骨质疏松症的发生及发展过程[43]，抑制丝裂原活化蛋白激酶3的表达可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化并促进成骨细胞分化[44]。转化生长因子B1是转化生长因子家族蛋白中的一员，可以通过SMAD蛋白通路参与包括骨骼疾病多种疾病的发生发展[45]。转化生长因子家族蛋白不仅在原发性骨质疏松的间充质干细胞中富集[46]，也存在于皮质骨来源干细胞中。皮质骨来源干细胞是软骨细胞谱系中的一员，皮质骨来源干细胞可以分泌更多的转化生长因子B1，且其有助于皮质骨来源干细胞的迁移与活化[47]，而当成骨细胞从基质形成阶段分化到矿化阶段时，若转化生长因子B的作用依旧持续存在，会阻碍多种间充质的分化进而影响成骨[48]。
视网膜母细胞瘤基因1基因编码的蛋白是细胞周期的负调控因子，具有维持染色质结构稳定的作用，处于去磷酸化形式的视网膜母细胞瘤基因1可以与转录因子E2F1结合，作为细胞周期的负调控因子，阻止细胞通过G1-S检查点，使细胞周期停滞，视网膜母细胞瘤基因1对抑制多种肿瘤的发生发挥着不可或缺的作用[49]。视网膜母细胞瘤基因1是间充质干细胞的关键调节因子，与骨形成息息相关。成骨细胞分化和骨形成所需的转录因子Runt-相关转录因子2与视网膜母细胞瘤基因1相互作用，共同促进成骨，视网膜母细胞瘤基因1基因的缺失增加了棕色脂肪水平而导致骨形成减少和成骨基因表达的抑制[50-51]。前列腺素是磷酸戊糖途径中重要的氧化羧化酶[52]，尚无与原发性骨质疏松相关的机制研究，有待于将来的发现。该研究的生物标志物与原发性骨质疏松之间的关系及其潜在机制见表4。

该研究通过生物信息学分析方法共筛选出原发性骨质疏松中的5个核心差异基因，并构建了差异基因与潜在药物靶标调控网络，尽管筛选的5个核心差异基因可能是影响原发性骨质疏松进展的调控基因，但也存在一定的局限性。首先，GEO数据库中关于原发性骨质疏松的数据集偏少，实验中使用的验证数据集GSE35958数据集为原发性骨质疏松数据，这可能使分析结果的相互验证受到一定影响；其次，实验尚未在体内外进一步验证这些差异核心基因的诊断价值、潜在作用及机制。因此，在未来的研究中将在临床样本中检测这些核心差异基因的表达模式并通过分子生物学实验在体内外探索调控原发性骨质疏松发生发展的机制和生物学过程。
综上所述，该研究通过使用生物信息学方法对GEO中的原发性骨质疏松数据集分析后，筛选出5个在潜在的核心差异基因，通过功能富集分析表明这5个核心差异基因在原发性骨质疏松的发生机制可能与氧化应激以及自噬密切相关。此外还构建了核心差异基因与潜在药物靶标调控网络，为原发性骨质疏松可能的发病机制、早期筛查诊断及治疗提供了一定的研究方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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原发性骨质疏松症在世界上发病率高，困扰着很多患者，但发病机制尚不完全清楚，缺乏有效的早期筛查指标和治疗方案。#br# #br# 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#

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