内热针治疗兔激素性股骨头坏死的机制

doi:10.12307/2024.549

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4353-4359.doi: 10.12307/2024.549

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内热针治疗兔激素性股骨头坏死的机制

马良辰1，2，田富宝2，徐玉娟2，田心保3，陶莹2，陈梦莹2，连佳伟2，林瑞珠3，朱宁3

宁夏医科大学总医院，1老年与特需医学科，3康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2023-09-21 接受日期:2023-11-01 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-27
通讯作者: 朱宁，硕士，主任医师，教授，硕士生导师，宁夏医科大学总医院康复医学科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:马良辰，女，1990年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主治医师，主要从事肌肉骨骼疾患康复研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区科学基金项目(81760904)，项目负责人：朱宁；宁夏医科大学总医院“国家自然科学基金项目孵育计划”，项目负责人：朱宁；国家自然科学基金地区科学基金项目(82360987)，项目负责人：林瑞珠

Mechanisms underlying internal heat-type acupuncture in the treatment of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rabbits

Ma Liangchen1, 2, Tian Fubao2, Xu Yujuan2, Tian Xinbao3, Tao Ying2, Chen Mengying2, Lian Jiawei2, Lin Ruizhu3, Zhu Ning3

1Department of Geriatric and Special Need Medicine, 3Department of Rehabilitation Medicine, Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-09-21 Accepted:2023-11-01 Online:2024-09-28 Published:2024-01-27
Contact: Zhu Ning, Master, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Rehabilitation Medicine, Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ma Liangchen, Master candidate, Attending physician, Department of Geriatric and Special Need Medicine, Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760904 (to ZN); Incubation Program of National Natural Science Foundation of Ningxia Medical University General Hospital (to ZN); the National Natural Science Foundation of China (Regional Program), No. 82360987 (to LRZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

内热针疗法：是在传统温针灸及银质针基础上，融入现代软组织外科学的一种创新特色疗法，通过对针芯内的电热丝进行恒温加热，能够精确调控治疗温度，具有抗炎、降低肌肉张力、改善局部血供等作用，对各种软组织及骨关节疼痛疾病均具有较好的疗效。
基质金属蛋白酶：是自然界进化中高度保守的一类蛋白酶，属于锌依赖性内肽酶家族，参与骨基质降解的同时，促进破骨细胞的迁移和黏附，从而介导骨重塑失衡的发生。

背景：内热针疗法是将针刺疗法和热疗相结合的新型治疗技术，对激素性股骨头坏死有很好的临床效果，但作用机制仍不完全清晰。

目的：探讨内热针疗法治疗兔激素性股骨头坏死的可能作用机制。
方法：32只新西兰兔采用随机数字表法分为空白组、模型组、内热针组、冲击波组，每组8只。模型组、内热针组、冲击波组采用甲泼尼龙琥珀酸钠联合大肠杆菌内毒素造模。内热针组对兔臀部进行内热针干预，每周1次，每次20 min；冲击波组对兔臀部进行冲击波干预，每周1次，每次2 000下；空白组和模型组不给予任何治疗。干预4周后进行实验兔采血及双侧股骨头取材，采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平；苏木精-伊红染色观察各组实验兔股骨头骨组织形态学变化并计算空骨陷窝率；免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹法检测骨组织中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶组织抑制剂1、基质金属蛋白酶组织抑制剂2的蛋白表达。

结果与结论：①与空白组相比，造模兔出现摄食减少、精神萎靡、活动减少等表现；与模型组相比，内热针及冲击波治疗后实验兔的上述表现均明显改善；②与空白组相比，模型组的股骨头组织形态学明显恶化且空骨陷窝率升高(P < 0.001)；内热针组及冲击波组的股骨头组织形态学较模型组明显改善且空骨陷窝率降低(P < 0.001)；③与空白组相比，模型组的血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平明显升高(P < 0.05)；与模型组相比，内热针组及冲击波组的血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平明显降低(P < 0.05)；④与空白组相比，模型组实验兔股骨头组织中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9蛋白表达水平明显升高(P < 0.001)，基质金属蛋白酶组织抑制剂1、基质金属蛋白酶组织抑制剂2的蛋白表达水平明显降低(P < 0.001)；与模型组相比，内热针组及冲击波组实验兔股骨头组织中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9蛋白表达水平明显降低(P < 0.001)，基质金属蛋白酶组织抑制剂1、基质金属蛋白酶组织抑制剂2的蛋白表达水平明显升高(P < 0.001)；⑤结果表明，内热针可能通过调控基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂及血清炎性因子水平，促进坏死股骨头的修复，从而达到治疗早期激素性股骨头坏死的目的。

https://orcid.org/0009-0006-4698-4879(马良辰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 内热针, 基质金属蛋白酶, 基质金属蛋白酶组织抑制剂, 肿瘤坏死因子α, 白细胞介素6

Abstract: BACKGROUND: Internal heat-type acupuncture therapy is a new treatment technique that combines acupuncture therapy with hyperthermia. It has good clinical effects on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, but the mechanism of action is still not fully clear.
OBJECTIVE: To explore the possible mechanism of internal heat-type acupuncture therapy in treating steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rabbits.
METHODS: Thirty-two New Zealand rabbits were randomly divided into blank group, model group, internal heat-type acupuncture group and shock wave group using a random number table method, with 8 rabbits in each group. The model group, internal heat-type acupuncture group and shock wave group were modeled using methylprednisolone sodium succinate combined with Escherichia coli endotoxin. The internal heat-type acupuncture group received an internal heat-type acupuncture intervention on the buttocks of rabbits, once a week, for 20 minutes each time. The shock wave group received shock wave intervention on the buttocks of rabbits, once a week, with 2 000 beats per session. The blank group and model group were not given any treatment. After 4 weeks of intervention, blood samples and bilateral femoral head samples were collected from experimental rabbits. The levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in serum were detected by ELISA; the histomorphology of the femoral head was observed using hematoxylin-eosin staining and the rate of empty lacunae was calculated; the protein expressions of matrix metalloproteinase 2, matrix metalloproteinase 9, matrix metalloproteinase tissue inhibitor 1, and matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2 were detected by immunohistochemistry and western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group, the model rabbits showed reduced food intake, mental fatigue, and decreased activity; compared with the model group, the above performance of the experimental rabbits was significantly improved after internal heat-type acupuncture and shock wave treatment. Compared with the blank group, the histomorphology of the femoral head in the model group deteriorated significantly and the rate of empty bone lacuna increased (P < 0.001), while the histomorphology of the femoral head in the internal heat-type acupuncture group and shock wave group was significantly improved compared with the model group, and the rate of empty bone lacuna was reduced (P < 0.001). The serum levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the model group were significantly higher than those in the blank group (P < 0.05), while the serum levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the internal heat-type acupuncture group and the shock wave group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). Compared with the blank group, the expression levels of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 9 in the femoral head of the model group were significantly increased, while the expression levels of matrix metalloproteinase tissue inhibitor 1 and matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2 were significantly decreased (P < 0.001); compared with the model group, the protein expression levels of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 9 were significantly decreased, while the protein expression levels of matrix metalloproteinase tissue inhibitor 1 and matrix metalloproteinase tissue inhibitor 2 were significantly increased in the internal heat-type acupuncture group and the shock wave group (P < 0.001). Overall, these findings indicate that internal heat-type acupuncture may promote the repair of the necrotic femoral head by regulating the levels of matrix metalloproteinases/matrix metalloproteinase tissue inhibitors and serum inflammatory factors, thus treating early steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.

Key words: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, internal heat-type acupuncture, matrix metalloproteinase, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, tumor necrosis factor-α, interleukin-6

中图分类号:

马良辰, 田富宝, 徐玉娟, 田心保, 陶莹, 陈梦莹, 连佳伟, 林瑞珠, 朱宁. 内热针治疗兔激素性股骨头坏死的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4353-4359.

Ma Liangchen, Tian Fubao, Xu Yujuan, Tian Xinbao, Tao Ying, Chen Mengying, Lian Jiawei, Lin Ruizhu, Zhu Ning. Mechanisms underlying internal heat-type acupuncture in the treatment of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rabbits[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4353-4359.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析此次实验使用32只新西兰兔，实验过程中实验兔无意外死亡，全部进入结果分析。
2.2 激素性股骨头坏死兔模型的建立使用糖皮质激素联合大肠杆菌内毒素的造模方法建立激素性股骨头坏死兔模型后，将空白组及模型组的2只实验兔通过X射线片检查进行影像学评估，见图2A，B。与空白组比较，模型组股骨头上出现弧形硬化带，边缘相对模糊，股骨头周围骨质密度减低；每组各麻醉处死1只实验兔，取股骨头标本，常规苏木精-伊红染色进行组织病理学检查，见图2C，D，模型组骨小梁变细、疏松，部分骨小梁可见断裂，骨小梁中空骨陷窝呈弥漫性，空骨陷窝率增多，同时可见骨细胞减少，骨髓脂肪细胞肥大，部分脂肪细胞融合成泡状物等异常。

2.3 各组实验兔干预前后一般状态与空白组相比，造模兔出现摄食减少、精神萎靡、活动减少等表现；与模型组相比，内热针及冲击波治疗后实验兔的上述表现均明显改善。
2.4 各组实验兔影像学改变 X射线片检查结果显示，与空白组相比，模型组股骨头出现弧形硬化带，边缘相对模糊，股骨头周围骨组织透光度增加，见图3A，B；经内热针及冲击波干预后，实验兔股骨头未见明显弧形硬化带，股骨头周围骨组织透光度减低，见图3C，D。

2.5 各组实验兔血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素6水平与空白组相比，模型组实验兔血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素6水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，内热针组及冲击波组实验兔血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.6 各组实验兔股骨头骨组织病理学改变空白组兔骨小梁饱满，排列整齐致密，骨小梁间骨髓细胞丰富，脂肪细胞少、形态正常，骨小梁内骨细胞丰富，散在空骨陷窝，空骨陷窝率低；与空白组相比，模型组兔骨小梁稀疏变细，可见骨小梁断裂，骨髓脂肪细胞肥大、部分融合成囊状，骨小梁中骨细胞减少，空骨陷窝率显著升高(P < 0.001)；与模型组相比，内热针组及冲击波组兔骨小梁排列相对致密规则，骨髓腔内骨髓细胞丰富，脂肪细胞无明显肥大，空骨陷窝率明显降低(P < 0.001)，见图4。

2.7 各组实验兔股骨头骨组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2的蛋白表达免疫组织化学染色结果显示，与空白组相比，模型组兔股骨头组织中MMP-2、MMP-9 阳性细胞较多，TIMP-1、TIMP-2阳性染色较少；经内热针及冲击波治疗后，这一趋势则完全相反。Western blot结果显示，与空白组相比，模型组股骨头骨组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高(P < 0.001)，TIMP-1、TIMP-2的蛋白表达明显降低(P < 0.001)；与模型组相比，内热针组及冲击波组股骨头骨组织中MMP-2、MMP-9的蛋白表达明显降低(P < 0.001)，而TIMP-1、TIMP-2的蛋白表达明显升高(P < 0.001)，见图5，6。

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引言

激素性股骨头坏死是一种致残性骨科疾病，是因激素类药物的长期使用，减少了骨细胞及股骨头的血供，导致股骨头骨组织缺血坏死、结构改变，从而引起股骨头塌陷、髋关节疼痛及功能障碍[1-2]。激素性股骨头坏死的致残率较高，且主要累及中青年人群，给患者、家庭乃至社会带来了严重的经济负担[3-4]。因此，对激素性股骨头坏死发病机制及防治措施的研究具有必要性和迫切性。
尽管临床糖皮质激素的使用与激素性股骨头坏死的发生密切相关，但确切的机制仍不清楚[5]。研究发现，细胞外基质中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其特异性抑制因子基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP)以及炎性因子与激素性股骨头坏死的发生密切相关[6-7]。在激素性股骨头坏死的病理过程中，糖皮质激素能够促进MMP-2和MMP-9的表达，抑制TIMP-1、TIMP-2的表达，即出现MMPs/TIMPs失衡并释放大量的炎性因子，使破骨细胞生成增加、活性增强，从而加速骨细胞的凋亡以及骨基质的降解，致使骨吸收增加，导致骨小梁变细、疏松、萎缩甚至断裂，最终导致激素性股骨头坏死的发生[8]。其中，MMP-2和MMP-9大量表达于破骨细胞，在骨吸收过程中被认为是对降解骨基质有机物成分起主要作用的蛋白酶[9]，而TIMPs是针对MMPs的天然内生抑制剂[10]；其次，炎性因子肿瘤坏死因子α及白细胞介素6能够刺激破骨细胞生成与活化、抑制成骨细胞活性，从而影响骨代谢和骨平衡[11-12]。
目前，针对激素性股骨头坏死的治疗方式包括体外冲击波、药物等传统治疗方法。其中，冲击波疗法作为指南推荐的治疗方法，可有效改善早中期股骨头坏死患者的临床症状，归因于其镇痛、修复损伤组织等作用原理[13]，但最佳剂量尚未得到科学验证[14]。因此该研究将冲击波疗法设置为对照治疗组，在验证其治疗股骨头坏死有效的同时，探讨内热针治疗方法的疗效及部分作用机制。
近年来，已有的动物实验发现温针灸和电针可有效调控MMPs/TIMPs、肿瘤坏死因子α及白细胞介素6的表达，进而发挥维持骨稳态的作用[15-16]。而内热针疗法是一种以现代软组织外科学为基础，将针刺疗法和热疗有机结合的新型治疗方法，能够抑制痉挛变性肌肉的肌张力和无菌性炎症，改善局部血液循环，对激素性股骨头坏死有较好的临床治疗效果[17-18]，但其具体作用机制尚不完全清楚。团队前期的动物实验表明，内热针对激素性股骨头坏死动物模型有确切治疗效果[19]。该研究观察内热针对兔激素性股骨头坏死模型骨组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达及血清中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平的影响，探讨内热针治疗激素性股骨头坏死的部分作用机制，为激素性股骨头坏死的临床治疗提供实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2022年10月至2023年7月在宁夏医科大学动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组 6月龄健康清洁级新西兰雄性兔32只，体质量为(2.5±0.5) kg，全部购自西安交通大学医学院动物实验中心，生产许可证号：SCXK(陕)2022-01。饲养于宁夏医科大学动物实验中心，饲养过程中单笼饲养，允许实验兔自由摄取饲料及饮用水，光照条件为昼夜交替(12 h/12 h)，实验室温度维持在20-24 ℃，设定湿度为(50±15)%。所有实验兔适应性喂养1周后检查健康状况无异常，采用随机数字表法分为4组，即空白组、模型组、内热针组及冲击波组，每组8只，除空白组外，其余实验兔制备激素性股骨头坏死兔模型。
该实验经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准(批准号：KYLL-2023-0170)。
1.3.2 主要试剂和仪器注射用甲泼尼松龙琥珀酸钠(福安药业集团湖北人民制药有限公司，批号：600-10)；大肠杆菌内毒素(Sigma，批号：0000174045)；注射用青霉素钠[石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，批号：1000-50]；MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2抗兔多克隆抗体(ABclonal，批号分别为：A11144、A2095、A1389、A1558)；二抗山羊抗兔(Servicebio，批号：GB23303)；BCA蛋白定量检测试剂盒(Servicebio，批号：G2026)；苏木精与伊红染色液(Servicebio，批号：G1003)；10%EDTA脱钙液(Servicebio，批号：G1105)；PBS(上海逍鹏，批号：2242276)；40 g/L多聚甲醛(北京雷根生物技术有限公司，批号：0706A23)；2%戊巴比妥钠溶液(银川市伟博鑫生物科技有限公司)；RM2235型石蜡切片机(Leica公司，德国)；BX51型显微镜(Olympus公司，日本)；凝胶成像系统(ABI，美国)；内热针(直径为0.5 mm，针总长100 mm，针体长65 mm，针柄长35 mm，针柄直径2.2 mm)；内热针治疗仪(济宁市佳科医疗科技有限公司)；冲击波治疗仪(SONOTHERA型，韩国)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验模型建立实验兔适应性喂养7 d后，采用激素联合大肠杆菌内毒素的造模方法，对内热针组、冲击波组和模型组共24只实验兔进行造模。首先耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素(10 μg/kg)2次，每次间隔24 h，第2次注射大肠杆菌内毒素后，立即肌肉注射甲泼尼松琥珀酸钠(右臀)20 mg/kg，每间隔24 h注射1次，共注射3次，每周2次右侧臀肌注射青霉素40万U/只，以预防感染[20]。空白组8只实验兔注射等量生理盐水。造模4周后每组各麻醉处死1只兔，进行组织形态学及影像学检查鉴定模型。

若出现以下2个方面的变化即可视为造模成功：①组织形态学[21]：骨小梁内空骨陷窝增多，呈弥漫性，骨细胞出现核固缩，骨小梁周围组织可见骨髓细胞坏死，脂肪细胞肥大；②影像学[22]：关节软骨下出现硬化区，伴或不伴有关节面塌陷。

1.4.2 内热针及冲击波治疗方法造模4周后进行治疗干预。①内热针组：参考文献[20]进行内热针进针布点，主要在髋关节的关节囊体表投影扇形区域的“内弧”及“外弧”均匀间隔2 cm交错布点，共布2排。扇形的“内弧”：两端为大转子的前后缘中点(相当于转子间线、转子间嵴的中点)，最凸处为大转子尖；扇形的“外弧”：与“内弧”平行，经过髂后上棘与大转子间连线的中外1/3交点，前端在转子间线中点与髂前上棘连线上，后端在转子间嵴中点与骶管裂孔连线上。在“内弧”距中点1 cm布2点，在“外弧”中点及距中点2 cm左右两侧各布1点，共计5点，见图1A。以标记点为中心进行常规消毒后进针，进针深度达骨膜为止。进针结束后将内热针导线接头与每根针末端连接，加热温度42 ℃，治疗20 min，每周1次，共干预4周。②冲击波组：将实验兔股骨头区剃毛，涂抹耦合剂，进行冲击波治疗，冲击波能流密度 0.22 mJ/mm2，每次2 000下，每周1次，干预4周[23]，见图1B。③空白组及模型组实验兔不予干预。4周后对各组实验兔进行行为学评价及影像学检查并麻醉处死各组实验兔进行取材。

1.4.3 取材方法使用2%戊巴比妥钠对实验兔进行麻醉(2 mL/kg)，麻醉效果满意后，以实验专用固定器固定实验兔后，经腹主动脉采血，采血过程严格无菌操作，每只兔采血2 mL，于室温下静置30 min后，以3 000 r/min离心15 min，将上清液吸取于已标记好的EP管中，放于-80 ℃冰箱保存用于后续ELISA检测。取出双侧股骨头并去除骨组织周围的肌肉和韧带，先行大体观察并记录，然后用PBS冲洗，将左侧股骨头放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h，10%EDTA脱钙4周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，常规切片，进行苏木精-伊红染色以及免疫组织化学染色。将右侧股骨头液氮冻存，然后置于-80 ℃冷冻冰箱中用于Western blot检测。
1.4.4 行为学评价观察各组实验兔的精神状态、进食情况、活动情况等方面的变化。
1.4.5 形态学观察取石蜡包埋块，切片4 μm，脱蜡后，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察股骨头骨组织结构改变情况。计算空骨陷窝率：每张切片在×200倍镜下随机选3个不重复区域，计数每个区域50个骨陷窝中的空骨陷窝数目，由此计算空骨陷窝率：空骨陷窝率=空骨陷窝数/50×100%。测定3个区域空骨陷窝率，取平均值。
1.4.6 影像学评估在造模后及干预后，各组实验兔取仰卧位固定，用X射线机拍摄实验兔双侧股骨头X射线片，观察股骨头影像学变化。
1.4.7 ELISA检测将在-80 ℃冰箱保存的实验兔血清取出，遵循ELISA试剂盒说明书步骤测定肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平。每组重复检测3次，使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，绘制标准曲线，计算各组样品相应因子浓度水平。
1.4.8 免疫组织化学染色取已烘干的各组实验兔的股骨头骨组织标本切片，进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、加一抗(MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2一抗)及山羊抗兔二抗，进行DAB显色、复染细胞核等处理，显微镜下观察染黄色或棕黄色为阳性，用Image-Pro Plus 6.0软件定量测定3个随机视野中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的阳性染色面积，采用积分吸光度值对以上蛋白进行定量分析。
1.4.9 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测将实验兔股骨头骨组织从-80 ℃冰箱取出，经研磨机离心处理后，首先用PBS冲洗细胞两三次，最后一次清洗完，倒掉PBS，加入适当体积的裂解液，经离心后收集股骨头骨组织总蛋白，测量蛋白浓度，制备分离胶和浓缩胶后上样，经过电泳及转膜后，加入5%的牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30 min，分别加入MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、GAPDH一抗(1∶500)，4 ℃孵育摇床过夜(摇床慢摇)，TBS-T洗涤3次，将山羊抗兔二抗按照1∶5 000进行稀释，与膜共同在室温下孵育30 min，然后ECL显影、定影、洗片、凝胶、成像。采用AIWBwellTM分析软件得出蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参蛋白，以目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为目标蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①各组兔的行为学表现；②各组兔双侧股骨头的影像学变化；③各组兔血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平；④各组兔股骨头骨组织病理学变化；⑤各组兔股骨头骨组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2的蛋白表达。
1.6 统计学分析数据经SPSS 26.0统计学软件进行分析。计量资料在统计分析前先进行正态性及方差齐性检验，若为正态性分布，以x±s表示，多组间的差异采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验；若数据不符合正态性分布，即采用秩和检验对数据进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.001为差异有非常显著性意义。文章统计学方法已经宁夏医科大学生物统计学专家审核。

讨论

股骨头坏死的特征是骨髓和骨细胞死亡，该病可能导致髋关节逐渐破坏。股骨头坏死可分为创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死，而非创伤性股骨头坏死是主要类型[24]。激素性股骨头坏死是由于糖皮质激素的大量使用而引起的，其发病率占非创伤性股骨头坏死的首位[25]。
当前，激素性股骨头坏死的病因及发病机制仍不完全清楚，对于该疾病的治疗，尤其是早期激素性股骨头坏死的治疗方法各有利弊[26]。内热针是一种在传统银质针基础上发展而来的新型非药物治疗方式[27]，具有消除炎症反应、松解肌肉痉挛、增加局部血液供应等作用[28]，对各种软组织及骨关节疼痛疾病都具有较好的疗效[17]，对激素性股骨头坏死亦有很好的临床效果。近期有研究表明，内热针治疗早期股骨头坏死，可缓解患者疼痛、改善功能障碍并提高患者生活质量[18，29]，但对其作用机制的认识还较缺乏。团队前期研究发现内热针通过调控MMP介导异常骨重塑，从而改善骨结构和功能[30]。另有研究发现，内热针可降低第三腰椎横突综合征大鼠血清的炎性因子水平[31]。
基于上述研究，该实验进一步探讨了内热针对激素性股骨头坏死的可能作用机制。
此次研究采用甲泼尼龙琥珀酸钠联合大肠杆菌内毒素对实验兔进行造模，经苏木精-伊红染色及影像学X射线片检查证实模型制备成功。造模成功后，观察内热针及冲击波对激素性股骨头坏死的治疗作用，发现治疗组实验兔较模型组摄食增多、精神好转、活动增多。治疗组实验兔X射线片检查显示股骨头未见明显弧形硬化带；组织学结果也显示病理改变明显改善。以上结果提示，内热针疗法及冲击波治疗对实验兔激素性股骨头坏死有确切的治疗效果。
糖皮质激素的长期使用将增强破骨细胞活性，促使成骨细胞和骨细胞凋亡或坏死，骨平衡被打破，导致骨重塑失衡，股骨头内骨小梁受到破坏造成骨折，最终发生股骨头坏死[32]。MMPs能够促使破骨细胞的迁移和黏附，同时能够直接参与骨基质降解，促进骨重塑失衡的发生[33]。其中MMP-2和MMP-9在骨重塑过程中发挥重要作用[34]。TIMPs可以抑制MMPs酶原的活化，通过与MMPs特异性结合来延迟进一步的生理进展[35]。赵红星等[7]研究表明，糖皮质激素可以使大鼠股骨头骨组织中MMPs表达升高，TIMPs表达降低，从而上调破骨细胞的活性，使成骨细胞的分化受到抑制，加快骨基质的降解，最终引起股骨头坏死的发生。王建忠等[36]研究发现，激素性股骨头坏死患者股骨头骨组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达增高，TIMP-1、TIMP-2蛋白表达降低，同样提示激素性股骨头坏死的发生可能与长期使用糖皮质激素所致的MMPs/TIMPs系统改变相关。该研究发现模型组实验兔股骨头组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显升高，TIMP-1、TIMP-2蛋白表达水平明显降低。内热针组及冲击波组实验兔上述趋势则相反。这表明MMPs/TIMPs参与激素性股骨头坏死的发生，且内热针治疗激素性股骨头坏死的部分机制可能与改变MMPs/TIMPs有关。
另有研究发现，炎性因子在激素性股骨头坏死骨重塑失衡过程中亦发挥重要作用，其中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6的作用尤为显著[37]。肿瘤坏死因子α使股骨头局部发生炎症反应以及骨细胞的坏死，导致破骨细胞活性增强，并抑制成骨细胞生成，使骨细胞代谢失衡，加重股骨头的坏死[38]。此外，高水平的肿瘤坏死因子α可以促进白细胞介素1β、白细胞介素6等促炎因子的释放，使局部炎症反应进一步增加[39]。而白细胞介素6是一种炎性因子，同时也是重要的破骨细胞调节因子之一，能促进破骨细胞的生成并抑制成骨细胞的活性和功能[40]。同时，白细胞介素6还可以通过影响MMPs/TIMPs系统来调节骨代谢[41]。杨国柱等[42]在动物实验中研究发现，激素性股骨头坏死模型大鼠关节液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平明显升高，予以治疗后上述炎性因子水平明显降低，表明肿瘤坏死因子α、白细胞介素6在激素性股骨头坏死的发生机制中发挥重要作用。在该研究中，模型组兔血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素6水平明显升高，内热针组及冲击波组兔血清肿瘤坏死因子α及白细胞介素6水平明显降低，同样提示激素性股骨头坏死的发生可能与肿瘤坏死因子α、白细胞介素6有关，且内热针可能通过下调肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平抑制炎症反应、改善骨重塑失衡，从而达到治疗激素性股骨头坏死的目的。
此外，该研究对比了内热针疗法与指南推荐的冲击波治疗的效果，结果显示内热针组与冲击波组之间不具有显著性差异，说明两种治疗方式对于激素性股骨头坏死模型的作用相当，因此，内热针疗法是治疗早期激素性股骨头坏死的重要方式之一。
综上所述，内热针疗法通过改善MMPs/TIMPs失衡及下调血清炎性因子水平，达到治疗早期激素性股骨头坏死的目的，同时也为内热针在临床上应用于激素性股骨头坏死的治疗提供了实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

内热针治疗兔激素性股骨头坏死的机制

Mechanisms underlying internal heat-type acupuncture in the treatment of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rabbits

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