丁香苷抑制大鼠椎间盘退变

doi:10.12307/2024.506

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (32): 5104-5109.doi: 10.12307/2024.506

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丁香苷抑制大鼠椎间盘退变

张云鑫1，张存鑫2，王倩2，徐新亮3，吕超亮2，倪勇2

1济宁医学院临床医学院，山东省济宁市 272067；济宁市第一人民医院，2脊柱外科，3疼痛科，山东省济宁市 272000

收稿日期:2023-08-16 接受日期:2023-10-12 出版日期:2024-11-18 发布日期:2023-12-28
通讯作者: 倪勇，硕士，副主任医师，济宁市第一人民医院脊柱外科，山东省济宁市 272000 吕超亮，博士，主任医师，济宁市第一人民医院脊柱外科，山东省济宁市 272000
作者简介:张云鑫，男，1997年生，山东省威海市人，汉族，在读硕士，主要从事椎间盘退变、显微脊柱外科方面的研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划项目(202204070552)，项目负责人：王倩；山东省医药卫生科技发展计划项目(2021M079)，项目负责人：徐新亮；济宁市重点研发计划项目(2021YXNS050)，项目负责人：王倩；济宁市重点研发计划项目(2020JKNS008)，项目负责人：张存鑫

Syringin inhibits intervertebral disc degeneration in rats

Zhang Yunxin1, Zhang Cunxin2, Wang Qian2, Xu Xinliang3, Lyu Chaoliang2, Ni Yong2

1School of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China; 2Department of Spine Surgery, 3Department of Pain, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272000, Shandong Province, China

Received:2023-08-16 Accepted:2023-10-12 Online:2024-11-18 Published:2023-12-28
Contact: Ni Yong, Master, Associate chief physician, Department of Spine Surgery, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272000, Shandong Province, China Lyu Chaoliang, MD, Chief physician, Department of Spine Surgery, Jining No. 1 People’s Hospital, Jining 272000, Shandong Province, China
About author:Zhang Yunxin, Master candidate, School of Clinical Medicine, Jining Medical University, Jining 272067, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Province Medical and Health Science and Technology Development Plan Projects, Nos. 202204070552 (to WQ) and 2021M079 (to XXL); Jining Key Research and Development Plan Project, Nos. 2021YXNS050 (to WQ) and 2020JKNS008 (to ZCX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

丁香苷：是一种提取自刺五加科(五加科)刺五加球菌的化合物，含有丰富的抗氧化剂，可以有效清除自由基、减轻炎症反应，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂、降血糖等作用，对某些疾病(心血管疾病、肿瘤、老年痴呆)具有预防和辅助治疗作用。
基质金属蛋白酶13：是一种属于基质金属蛋白酶家族的酶，主要通过降解和分解细胞外基质成分来发挥作用。在正常椎间盘中基质金属蛋白酶13的表达通常较低，在椎间盘退变过程中基质金属蛋白酶13的表达升高，引发细胞外基质的降解和破坏、炎症反应和疼痛传导的增加，加剧椎间盘退变程度。

背景：椎间盘退变是由于椎间盘内部髓核和纤维环组织发生损伤和退化导致的椎间盘结构和功能发生变化，目前尚无有效的治疗药物。

目的：探讨丁香苷抑制大鼠椎间盘退变的作用。
方法：取10只雄性 SD大鼠，将每只大鼠的尾椎Co4/Co5椎间盘设为模型组、Co5/Co6椎间盘设为丁香苷组、Co6/Co7椎间盘设为对照组，对照组不进行任何处理，模型组、丁香苷组采用微型穿刺针进行纤维环全层穿刺建立椎间盘退变模型，造模后即刻，模型组、丁香苷组椎间盘分别注射2.5 μL的生理盐水、丁香苷溶液(5 μmol/L)。注射4周后取材，采用苏木精-伊红和番红O-固绿染色观察大鼠椎间盘退变程度，免疫组化染色分析大鼠椎间盘组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖及基质金属蛋白酶3，13的表达。

结果与结论：①苏木精-伊红染色显示，模型组椎间盘高度降低，软骨终板变薄且有裂隙出现，纤维环结构紊乱且出现裂隙，髓核消失；丁香苷组椎间盘高度正常或略低于对照组，软骨终板退变程度较模型组轻，纤维环排列较模型组相对规整且无裂隙，髓核部分皱缩。②番红O-固绿染色显示，模型组椎间盘软骨终板出现缺损且软骨钙化层变薄，出现明显退变；丁香苷组椎间盘软骨终板结构形态有一定程度恢复。③免疫组化染色显示，与对照组比较，模型组椎间盘软骨组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达降低(P < 0.000 1)，基质金属蛋白酶3，13的表达升高(P < 0.000 1)；与模型组比较，丁香苷组椎间盘软骨组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达升高(P < 0.001，P < 0.000 1)，基质金属蛋白酶3，13的表达降低(P < 0.001，P < 0.000 1)。④结果表明，丁香苷可通过抑制基质金属蛋白酶3，13的表达、提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达来改善椎间盘的结构和功能，预防和减缓椎间盘退变过程。

https://orcid.org/0009-0009-7712-9818(张云鑫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 丁香苷, 椎间盘退变, 腰痛, 针刺法, 髓核细胞, 中药单体, 基质金属蛋白酶

Abstract: BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is caused by damage and degeneration of the nucleus pulposus and annulus fibrosus tissues inside the intervertebral disc, resulting in structural and functional changes of the intervertebral disc. However, there is yet no effective drug treatment for intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effect of syringin on intervertebral disc degeneration.
METHODS: A total of 10 male Sprague-Dawley rats were selected, and the coccygeal intervertebral disc (Co4/Co5) of each rat was set as model group, Co5/Co6 intervertebral disc as syringin group, and Co6/Co7 intervertebral disc as control group. The control group did not receive any treatment. In the model group and syringin group, a miniature puncture needle was used to puncture the annulus fibrosus to establish an intervertebral disc degeneration model. Immediately after modeling, 2.5 μL of normal saline and syringin solution (5 μmol/L) were given in the model and syringin groups, respectively. Four weeks after injection, the samples were taken. The degree of intervertebral disc degeneration in rats was observed by hematoxylin-eosin and safranine O-fast green staining. The expressions of type II collagen, aggrecan and matrix metalloproteinases 3 and 13 in intervertebral disc tissue were analyzed by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed that in the model group, the height of intervertebral disc decreased, the cartilage endplate became thinner and cracked, the fibrous ring structure was disordered and cracked, and the nucleus pulposus disappeared; in the syringin group, the height of intervertebral disc was normal or slightly lower than that in the control group, the degree of cartilage endplate degeneration was lighter than that in the model group, the fiber circle permutation was relatively regular with no cracks, and the nucleus pulposus was partially shrunk. Safranine O-fast green staining showed that in the model group, the cartilage endplate of the intervertebral disc was defective and the calcified layer of cartilage became thinner, showing obvious degeneration. The structure and morphology of intervertebral disc cartilage endplate in the syringin group recovered to some extent. Immunohistochemical staining showed that, compared with the control group, the expressions of type II collagen and aggrecan in the intervertebral disc cartilage were decreased in the model group (P < 0.000 1), while the expressions of matrix metalloproteinases 3 and 13 increased (P < 0.000 1). Compared with the model group, the expressions of type II collagen and aggrecan in the intervertebral disc cartilage tissue were increased in the syringin group (P < 0.001, P < 0.000 1), while the expressions of matrix metalloproteinases 3 and 13 decreased (P < 0.001, P < 0.000 1). These results showed that syringin could improve the structure and function of intervertebral disc by inhibiting the expression of matrix metalloproteinases 3 and 13 and increasing the expression of type II collagen and aggrecan, thus preventing and slowing down the procession of intervertebral disc degeneration.

Key words: syringin, intervertebral disc degeneration, lumbago, acupuncture, nucleus pulposus cell, monomer of traditional Chinese medicine, matrix metalloproteinase

中图分类号:

张云鑫, 张存鑫, 王倩, 徐新亮, 吕超亮, 倪勇. 丁香苷抑制大鼠椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5104-5109.

Zhang Yunxin, Zhang Cunxin, Wang Qian, Xu Xinliang, Lyu Chaoliang, Ni Yong. Syringin inhibits intervertebral disc degeneration in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(32): 5104-5109.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验纳入10只SD大鼠，造模过程中死亡4只，最终进入结果分析6只。
2.2 大鼠椎间盘组织苏木精-伊红染色结果见图2。

苏木精-伊红染色显示，对照组大鼠椎间盘形态良好，椎间盘高度正常，纤维环呈环状分层排列整齐，无纤维环断裂或紊乱迹象，髓核中心部分呈椭圆形、体积饱满，无明显炎症细胞浸润，上下软骨终板厚度一致，连续性好。模型组大鼠椎间盘组织染色不均匀，椎间盘高度降低，软骨终板变薄、连续性差且有裂隙出现，纤维环结构紊乱、呈现玻璃样变，纤维环内存在裂隙，髓核皱缩或消失，胶原含量明显减少，可见大量类软骨细胞坏死，核碎裂或溶解，胞质嗜酸性增强，没有内部细胞结构，无细胞外基质染色，如Ⅱ型胶原和聚集物。丁香苷组大鼠椎间盘组织中纤维环排列较模型组相对规整，椎间盘高度正常或略低于对照组，软骨终板厚度与模型组相比均匀且连续性较好，未出现裂隙，髓核部分皱缩，但中央透明空腔仍存在，可见少量类软骨细胞坏死，部分核碎裂或溶解，少量胞质嗜酸性增强。这些研究结果提示与对照组对比，模型组大鼠椎间盘在组织结构、形态方面发生明显病理学变化；穿刺联合丁香苷药物注射处理后，大鼠椎间盘组织病理形态学较模型组明显改善。所以基于该实验结果，推测丁香苷可能具有抑制大鼠椎间盘退变的作用。
椎间盘退变组织学评分结果显示，对照组、丁香苷组、模型组的评分分别为(1.00±0.64)，(5.00±1.27)，(11.83±1.47)分，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.000 1)。
2.3 大鼠椎间盘组织番红O-固绿染色结果见图3。

番红O-固绿染色显示，对照组大鼠椎间盘软骨终板软骨钙化层厚薄一致，潮线清晰，染色均匀；与对照组相比，模型组大鼠椎间盘软骨终板组织出现缺损并且软骨钙化层明显变薄，染色不均匀，番红染色变浅，这表明软骨终板中胶原蛋白含量降低，出现明显退变；丁香苷组大鼠椎间盘软骨终板结构形态可得到一定程度恢复，退变程度减轻。软骨终板厚度测量结果显示，对照组、丁香苷组及模型组分别为(17.99±1.84)，(15.11±1.91)，(13.13±2.23) μm，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001，P < 0.000 1)。
2.4 大鼠椎间盘组织免疫组化染色结果见图4。

免疫组化染色显示，对照组大鼠椎间盘中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖高度表达，主要位于软骨组织和髓核区域，反映了健康的软骨结构；基质金属蛋白酶3，13的表达较低，反映了正常椎间盘中的细胞活动和降解过程有限。模型组大鼠椎间盘中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达显著减少，基质金属蛋白酶3，13的表达显著增加，表明椎间盘发生了退变。相较于模型组，丁香苷组大鼠椎间盘中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达增加，基质金属蛋白酶3，13的表达减少，表明丁香苷对椎间盘退变有一定的抑制作用。
免疫组化染色定量分析结果显示，对照组、丁香苷组及模型组大鼠椎间盘中Ⅱ型胶原阳性区域面积分别为(35.88±2.80)%，(18.01±2.28)%，(11.61±1.30)%，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001，P < 0.000 1)；对照组、丁香苷组及模型组大鼠椎间盘中聚集蛋白聚糖阳性区域面积分别为(18.04±1.04)%，(13.65±0.92)%，(6.98±1.74)%，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.000 1)；对照组、丁香苷组及模型组大鼠椎间盘中基质金属蛋白酶3阳性区域面积分别为(4.93±1.38)%，(8.53±1.00)%，(21.15±1.34)%，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001，P < 0.000 1)；对照组、丁香苷组及模型组大鼠椎间盘中基质金属蛋白酶13阳性区域面积分别为(5.69±1.44)%，(10.22±1.62)%，(16.73±1.77)%，组间比较差异有非常显著性意义(P < 0.001，P < 0.000 1)。

参考文献

[1] 陈莎,王诗忠,邓德万.大鼠腰椎间盘退变模型的建立及其形态学观察[J].福建中医药,2021,52(9):39-40.
[2] 康小彪,李鹏飞,滕元平,等.淫羊藿苷通过核转录因子KappaB通路减轻大鼠椎间盘退变[J].广州中医药大学学报,2022,39(8):1878-1885.
[3] JENSEN CE, RIIS A, PETERSEN KD, et al. Economic evaluation of an implementation strategy for the management of low back pain in general practice. Pain. 2017;158(5): 891-899.
[4] 方未晶.髓核靶向性纳米给药系统的构建及在椎间盘退变中的应用[D].杭州:浙江大学,2020.
[5] ROH EJ, DARAI A, KYUNG JW, et al. Genetic Therapy for Intervertebral Disc Degeneration. Int J Mol Sci. 2021;22(4):1579.
[6] 马振,李延坤,翟凯,等.基质金属蛋白酶-1在椎间盘退变中的表达与调节机制的研究进展[J].湖北民族学院学报(医学版),2019,36(1):72-74.
[7] 许大勇,李云朋,魏景梅,等.芸香苷改善大鼠椎间盘退变的机制[J].中国组织工程研究,2023,27(14):2139-2145.
[8] 王啸华,何敢声,谢林.氧化应激在椎间盘退变中的作用进展[J].中医正骨,2023, 35(5):44-48.
[9] WANG G, HUANG K, DONG Y, et al. Lycorine Suppresses Endplate-Chondrocyte Degeneration and Prevents Intervertebral Disc Degeneration by Inhibiting NF-kappaB Signalling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2018;45(3):1252-1269.
[10] 杨青志,毛碧峰.腰椎间盘突出症的治疗进展[J].实用中医内科杂志,2023,37(6): 66-70.
[11] 代守前.丹酚酸B调节氧化应激缓解椎间盘退变的体内体外实验研究[D].苏州:苏州大学,2021.
[12] KEOROCHANA G, JOHNSON JS, TAGHAVI CE, et al. The effect of needle size inducing degeneration in the rat caudal disc: evaluation using radiograph, magnetic resonance imaging, histology, and immunohistochemistry. Spine J. 2010;10(11):1014-1023.
[13] HAN B, ZHU K, LI FC, et al. A simple disc degeneration model induced by percutaneous needle puncture in the rat tail. Spine (Phila Pa 1976). 2008;33(18):1925-1934.
[14] SUZUKI S, FUJITA N, HOSOGANE N, et al. Excessive reactive oxygen species are therapeutic targets for intervertebral disc degeneration. Arthritis Res Ther. 2015;17:316.
[15] WANG Y, CHENG H, WANG T, et al. Oxidative stress in intervertebral disc degeneration: Molecular mechanisms, pathogenesis and treatment. Cell Prolif. 2023;56(9):e13448.
[16] 王倩,卢子昂,李利和,等.青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J].中国组织工程研究,2024,28(2):224-230.
[17] KANG L, LIU S, LI J, et al. The mitochondria-targeted anti-oxidant MitoQ protects against intervertebral disc degeneration by ameliorating mitochondrial dysfunction and redox imbalance. Cell Prolif. 2020;53(3):e12779.
[18] YU H, HOU G, CAO J, et al. Mangiferin Alleviates Mitochondrial ROS in Nucleus Pulposus Cells and Protects against Intervertebral Disc Degeneration via Suppression of NF-kappaB Signaling Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:6632786.
[19] GONG X, ZHANG L, JIANG R, et al. Hepatoprotective effects of syringin on fulminant hepatic failure induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide in mice. J Appl Toxicol. 2014;34(3):265-271.
[20] ZHANG H, GU H, JIA Q, et al. Syringin protects against colitis by ameliorating inflammation. Arch Biochem Biophys. 2020;680:108242.
[21] 石雅倩,李鑫,黄思源,等.紫丁香苷调控PI3K/Akt/mTOR诱导乳腺癌细胞凋亡的研究(英文)[J].生物化学与生物物理进展,2023:1-16. doi：10.16476/j.pibb.2023.0061
[22] 宋媛媛,周越,孙守兵,等.丁香苷对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用[J].中药药理与临床,2013,29(2):44-47.
[23] 石美晶,师幸伟,石珍,等.丁香苷对H/R心肌细胞的保护作用及其机制研究[J].西部医学,2019,31(3):364-369.
[24] 宋媛媛,李媛,张洪泉.丁香苷对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及其机制[J].药学学报,2010,45(8):1006-1011.
[25] 谭俊毅.丁香苷通过FOXO3a/NF-κB途径对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[D].重庆:重庆医科大学,2021.
[26] ZHANG B, ZHAO Q, LI Y, et al. Moxibustion alleviates intervertebral disc degeneration via activation of the HIF-1alpha/VEGF pathway in a rat model. Am J Transl Res. 2019; 11(9):6221-6231.
[27] 廖瑶,涂婷,曾惜羽,等.瑞芬太尼对椎间盘退变模型大鼠椎间盘的影响及机制[J].重庆医科大学学报,2023,48(7):760-764.
[28] LAI A, GANSAU J, GULLBRAND SE, et al. Development of a standardized histopathology scoring system for intervertebral disc degeneration in rat models: An initiative of the ORS spine section. JOR Spine. 2021;4(2):e1150.
[29] 吴靖平,朱斌,丁磊,等.大鼠椎间盘软骨终板退变与细胞凋亡的形态计量学研究[J].复旦学报(医学版),2010,37(2):140-145.
[30] BASSO M, CAVAGNARO L, ZANIRATO A, et al. What is the clinical evidence on regenerative medicine in intervertebral disc degeneration? Musculoskelet Surg. 2017; 101(2):93-104.
[31] 陈江,肖辉灯,孙旗,等.人椎间盘髓核细胞增殖活性与益肾活血通络方的干预调控[J].中国组织工程研究,2020,24(8):1200-1206.
[32] ZHANG Y, HE F, CHEN Z, et al. Melatonin modulates IL-1beta-induced extracellular matrix remodeling in human nucleus pulposus cells and attenuates rat intervertebral disc degeneration and inflammation. Aging (Albany NY). 2019;11(22):10499-10512.
[33] XIE T, PAN R, HUANG W, et al. Myricetin alleviates H2O2-induced senescence and apoptosis in rat nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells. Folia Histochem Cytobiol. 2023;61(2):98-108.
[34] VO N, NIEDERNHOFER LJ, NASTO LA, et al. An overview of underlying causes and animal models for the study of age-related degenerative disorders of the spine and synovial joints. J Orthop Res. 2013;31(6):831-837.
[35] KIM KW, CHUNG HN, HA KY, et al. Senescence mechanisms of nucleus pulposus chondrocytes in human intervertebral discs. Spine J. 2009;9(8):658-666.
[36] FINKEL T. Signal transduction by reactive oxygen species. J Cell Biol. 2011;194(1):7-15.
[37] 刘祺,杨舟,朱青安.氧化应激与椎间盘退变的研究进展[J].中国临床解剖学杂志, 2020,38(3):363-366.
[38] JOHNSON ZI, SHAPIRO IM, RISBUD MV. Extracellular osmolarity regulates matrix homeostasis in the intervertebral disc and articular cartilage: evolving role of TonEBP. Matrix Biol. 2014;40:10-16.
[39] 陶红平,张觅,游长江,等.IL-13抑制剂在损伤大鼠尾椎间盘退变中的作用研究[J].生物技术进展,2021,11(3):369-377.
[40] ZHOU T, LIN H, CHENG Z, et al. Mechanism of microRNA-146a-mediated IL-6/STAT3 signaling in lumbar intervertebral disc degeneration. Exp Ther Med. 2017;14(2):1131-1135.
[41] HSU HT, YUE CT, TENG MS, et al. Immuohistochemical score of matrix metalloproteinase-1 may indicate the severity of symptomatic cervical and lumbar disc degeneration. Spine J. 2020;20(1):124-137.
[42] 赵继荣,杨正汉,马俊飞,等.中医药干预基质金属蛋白酶表达治疗椎间盘退变研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(5):272-282.
[43] 李陆虎.腰椎间盘突出症中医证型与退变椎间盘组织中MMP-2、MMP-13相关性研究[D].咸阳:陕西中医药大学,2017.
[44] 李熙阳.HOTAIR与COLⅡ、MMP3在椎间盘退变中的表达及相关性研究[D].衡阳:南华大学,2020.
[45] WANG Q, SUN CT. Characteristics and correlation analysis of spino-pelvic sagittal parameters in elderly patients with lumbar degenerative disease. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):127.
[46] LI W, ZHOU P, YAN B, et al. Disc regeneration by injectable fucoidan-methacrylated dextran hydrogels through mechanical transduction and macrophage immunomodulation. J Tissue Eng. 2023;14:1778670354.
[47] LIU J, ZHANG Z, GUO Q, et al. Syringin prevents bone loss in ovariectomized mice via TRAF6 mediated inhibition of NF-kappaB and stimulation of PI3K/AKT. Phytomedicine. 2018;42:43-50.
[48] SUN S, ZHANG Y, XU W, et al. Mitochondrial dysfunction is involved in the cellular activity inhibition by eleutheroside B in SMMC-7721 and HeLa cells. Hum Exp Toxicol. 2022;41:774860050.
[49] DENG Z, REN C, TANG C, et al. Syringin alleviates hepatic fibrosis by enhancing autophagic flux and attenuating ER stress-TRIB3/SMAD3 in diabetic mice. Tissue Cell. 2023;83:102159.
[50] 罗力文,简秀英,周跃.GATA4调控NF-κB信号通路促进椎间盘髓核细胞发生炎症和衰老[J].免疫学杂志,2021,37(7):553-559.
[51] 李敬超.红景天苷通过Nrf2/ARE信号通路缓解椎间盘退变的研究[D].天津:天津医科大学,2020.
[52] 刘志超,张帆,祝永刚,等.身痛逐瘀汤方对椎间盘退变中PI3K/AKT通路影响的研究[J].中国中医骨伤科杂志,2018,26(10):14-19.
[53] 罗明秀,马海江,张甜,等.TGF-β对C-28/I2人软骨细胞聚集蛋白聚糖硫酸化修饰的影响[J].宁夏医学杂志,2021,43(6):481-484.
[54] 姚思琦,黎文正,汪虹.转化生长因子β/Smad信号通路与瘢痕疙瘩的靶向治疗[J].中国组织工程研究,2024,28(16):2619-2624.

引言

由于生活方式不健康和人口老龄化进程的加速，腰痛的发病率越来越高并有年轻化趋势，严重影响人们的生活及工作[1-2]。有研究表明，目前全世界有超过80%的人正遭受腰痛的困扰[3]，腰痛的常见原因之一就是椎间盘退变。椎间盘退变通常与年龄相关，即随着年龄的增长，椎间盘会逐渐失去水分，变得干燥和脆弱，导致退化。近年来关于椎间盘退变机制的研究取得了一些进展，同时也出现了一些新的治疗策略，例如：干细胞、基因和分子治疗，药物递送系统及生物材料应用等[4-5]。
椎间盘是人体最大的无血管组织，包括髓核、纤维环和上下软骨终板[6]，而髓核是椎间盘的核心部分，主要由髓核细胞和细胞外基质组成[7]。细胞外基质主要由水分、胶原、蛋白多糖及弹性蛋白等组成。目前椎间盘退变的致病机制仍不完全清楚，被认可的主要机制是：当椎间盘的机械载荷异常、免疫异常、代谢紊乱和氧化应激等因素发生时[8]，髓核内的各种炎症因子、基质金属蛋白酶及其他蛋白水解酶含量明显增加，使细胞外基质发生降解、髓核细胞数量降低及各种蛋白多糖相关产物的合成降低，导致椎间盘张力降低[9]、纤维环发生破裂、髓核突出压迫和刺激神经根及马尾神经，进而导致腰痛和其他不适症状[10]。上述椎间盘退变的病理生理过程和致病机制中，氧化应激被认为是主要的致病因素。由于目前很少有合适的动物模型能够准确地模拟人类椎间盘退变的病理状态[11]，所以此次实验采用文献中报道较多的椎间盘退变模型建立方法——经皮穿刺大鼠尾椎椎间盘来诱导退变模型[12-13]。有研究表明，针刺后椎间盘细胞内会出现活性氧水平升高和氧化应激反应[14]，氧化应激会导致氧化还原平衡失调，而氧化还原平衡对于维持正常的细胞功能极为重要[15]；此外有研究表明，氧化应激可以通过多种途径促进椎间盘细胞的凋亡，从而加速椎间盘退变的进展[16-17]。抑制氧化应激可通过减少椎间盘细胞的凋亡来延缓椎间盘退变[18]，因此一些具有抗炎、抗氧化功能的药物在椎间盘退变治疗方面具有潜在的疗效。
丁香苷又称刺五加苷B、紫丁香苷、紫丁香酚甙，提取自刺五加科(五加科)刺五加球菌[19]，具有广泛的药理特性，包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节作用等[20-22]，在大鼠佐剂性关节炎、大鼠脑缺血再灌注损伤、缺氧/复氧心肌细胞损伤、小鼠免疫功能调节等方面均有显著疗效[23-25]，但丁香苷在椎间盘退变过程中的治疗作用鲜有报道。此次实验旨在探讨丁香苷对椎间盘退变的治疗作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组动物实验。数据符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，方差齐则用LSD分析，方差不齐则用Game’s-Howell分析；数据不符合正态分布则进行秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2023-03-01/06-30在济宁市第一人民医院肿瘤转化实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2月龄健康SD大鼠10只，雌雄不拘，体质量220 g左右，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK(鲁)20190003。饲养室温度25 ℃左右，湿度60%，12 h光照/12 h黑暗。适应性饲养7 d后进行实验。实验方案已通过济宁市第一人民医院动物实验中心伦理审查(伦理编号：JNRM-2022-DW-023)。
1.3.2 实验试剂丁香苷购自上海源叶生物科技有限公司，HPLC测定质量分数≥98%；二甲基亚砜(货号：D8371，规格50 mL，索莱宝)；改良苏木精-伊红染色试剂盒(货号：G1121，规格：4×10 mL，索莱宝)；改良番红O-固绿软骨染色液(货号：G1371，规格：5×50 mL，索莱宝)；2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit IgG Detection System(With DAB Solution)(货号：E-IR-R215，规格：6 mL，Elabscience)；40 g/L多聚甲醛/通用型组织固定液(货号：BL539A，规格：500 mL，Biosharp)；EDTA脱钙液(货号：R20403，规格：500 mL，上海源叶生物科技有限公司)；Ⅱ型胶原抗体(货号：AF0135，规格：50 μL，Affinity)；聚集蛋白聚糖抗体(货号：DF7561，规格：50 μL，Affinity)；基质金属蛋白酶3抗体(货号：AF0217，规格：50 μL，Affinity)；基质金属蛋白酶13抗体(货号：AF5355，规格：50 μL，Affinity)。
1.3.3 实验仪器倒置显微镜(型号：ECLIPSE Ts2，尼康)；石蜡切片机(型号：HM340E，美国Thermo Fisher Scientific公司)；病理切片扫描仪(型号：Pannoramic MIDI，匈牙利3DHISTECN公司)。
1.4 方法
1.4.1 椎间盘退变模型建立及分组干预实验前1 d，10只SD大鼠禁食、禁水。腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)后通过触诊确定椎间盘水平，将大鼠的尾椎Co4/Co5椎间盘设为模型组、Co5/Co6椎间盘设为丁香苷组、Co6/Co7椎间盘设为对照组。为避免感染，所有手术器械均无菌消毒后使用，手术部位碘伏消毒。将一根21 G的微型穿刺针分别插入3组目标椎间盘中(图1)，进针深度为纤维环全层针刺(控制刺入深度为2.0-3.0 mm)，停留并轻轻旋转360°，10 s后拔出穿刺针[26-27]。

造模后即刻，使用31 G微型注射器向模型组、丁香苷组椎间盘分别注射2.5 μL的生理盐水、丁香苷溶液(5 μmol/L)。预实验结果表明，丁香苷(2.5，5，10 μmol/L)在体外具有抗炎和抗分解代谢的生物活性。将丁香苷溶解在二甲基亚砜中作为储备液，然后稀释在生理盐水中，丁香苷的最终浓度为5 μmol/L，二甲基亚砜的最终浓度为0.1%。注射4周后麻醉下颈椎脱臼处死大鼠，取目标椎间盘进行组织学分析。

1.4.2 组织学染色依次剥离大鼠尾部皮肤、筋膜、肌层，取出对应节段尾椎椎体标本，浸于40 g/L多聚甲醛溶液中12 h，置于EDTA脱钙液中脱钙2周，将标本嵌入石蜡中进行切片(5 μm厚)，分别用于苏木精-伊红、番红O-固绿和免疫组化染色。

根据苏木精-伊红染色结果进行椎间盘退变组织学评分[28]，总评分为0-16分，得分越高椎间盘退变越严重，见表1。利用病理切片扫描仪扫描切片以后将数据传至电脑，通过CaseViewer软件测量番红O-固绿染色切片软骨终板厚度，40倍放大后测量被染成红色的软骨终板厚度；测定每组6个椎间盘软骨终板正中矢状位前侧1/3、中心点、后侧1/3的厚度，取3处测量的平均值[29]。

免疫组化染色：细胞爬片经多聚甲醛固定、PBS 冲洗，0.5%Triton X-100 通透化处理 15 min，体积分数 3%过氧化氢室温孵育15 min，用PBS冲洗3次，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液(95 ℃)修复 15 min，冷却后用PBS 冲洗3次，体积分数 5%山羊血清封闭 30 min(37 ℃)，加入一抗(Ⅱ型胶原抗体、聚集蛋白聚糖抗体、基质金属蛋白酶3抗体、基质金属蛋白酶13抗体)后过夜(4 ℃)，PBS冲洗 3 次后滴加生物素标记的二抗，室温孵育30 min后用PBS冲洗 3 次，DAB显色5 min 后进行苏木精复染，中性树脂封固，光镜下观察Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖及基质金属蛋白酶3，13的表达。采用Image J(版本win64，V 1.8.0)软件对切片进行量化分析。
1.5 主要观察指标 6只大鼠各组椎间盘组织学观察结果。
1.6 统计学分析实验结果采用SPSS 27.0(美国IBM公司)进行数据分析，应用Graph Pad Prism 9(美国Graph Pad Software公司)进行统计绘图。计量资料以x±s表示，两组数据之间采用独立样本t检验进行分析，多组之间采用单因素方差分析(ANOVA)进行比较检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经济宁市第一人民医院生物统计学专家审核。

讨论

此次动物实验发现，对照组椎间盘结构良好，纤维环排列整齐，内部组织形态正常，软骨终板连续性好，并且没有出现明显的退变迹象；模型组椎间盘组织出现形态学上的病理改变，包括椎间盘高度降低、纤维环结构紊乱、纤维环内存在裂隙和断裂、髓核皱缩或消失、胶原含量明显减少、类软骨细胞坏死和胞质嗜酸性增强等退变特征；丁香苷组椎间盘组织的病理形态学得到明显改善，纤维环排列较模型组更规整，椎间盘高度恢复正常或略低于对照组，软骨终板退变程度较轻，未出现裂隙，髓核部分皱缩，但仍存在中央透明空腔，类软骨细胞坏死和胞质嗜酸性增强的现象相对减少。免疫组化染色结果显示，模型组椎间盘中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达明显减少，丁香苷组相比模型组有一定程度的恢复；模型组椎间盘中基质金属蛋白酶3，13的表达明显增加，而对照组和丁香苷组中基质金属蛋白酶3，13的表达较低。所以基于以上实验结果认为丁香苷具有改善椎间盘的形态学特征、减轻软骨终板退变并调节一些关键分子表达的能力，对椎间盘退变具有一定的保护作用。
由于椎间盘无血管组织所以其再生潜能较差，当代谢稳态破坏后难以自身进行调控恢复[30]。许多研究表明，炎症反应、氧化应激反应、髓核细胞凋亡等均可引起椎间盘退变[31-33]，如年龄、创伤、炎症等均会使椎间盘组织受到氧化应激的影响。VO等[34]研究发现椎间盘内的髓核组织主要通过氧化磷酸化供能，这一过程会产生活性氧；同时氧化应激也会导致自由基和活性氧的产生增加，这些活性氧会损伤椎间盘组织中的细胞和分子结构，进而引起椎间盘退变的发生，这种活性氧以过氧化氢的形式产生[35]。传统上认为氧化应激是有害的，但实际上正常细胞中受控产生的活性氧有助于调节信号通路。活性氧可以作为重要介质参与调节细胞分裂、炎症、免疫功能、自噬和应激反应等过程[36]。在退变的椎间盘组织中抗氧化蛋白水平明显下降，这导致椎间盘组织的抗氧化能力降低，退变的椎间盘组织缺乏足够的抗氧化防御机制，使其更容易受到氧化损伤[37]。椎间盘退变后其组织结构发生改变，细胞外基质的一些破坏性蛋白表达增加，使得分解代谢平衡遭到破坏[38]。正常椎间盘主要由髓核、纤维环和软骨终板三部分构成，椎间盘退变后髓核出现皱缩或消失现象，这意味着髓核的体积和形态发生改变，可能由于细胞死亡或溶解导致。椎间盘退变后，外层结构的纤维环排列变得混乱，并且内部出现裂隙和断裂现象。软骨终板是椎间盘上下两端的软骨组织，连接着相邻椎骨，软骨终板也在退变后出现变薄和断裂，即软骨组织的连续性受损[39]。
在分子表达方面，椎间盘退变后的细胞外基质成分会发生降解[40]。在降解过程中基质金属蛋白酶发挥着重要作用，有研究发现，基质金属蛋白酶在退变椎间盘的纤维环和髓核细胞中表达，却在正常组织中不表达[41]。基质金属蛋白酶中与椎间盘退变相关的包括基质金属蛋白酶3，13等都可降解细胞外基质中的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原[42]，进而加速椎间盘退变[43-45]。目前椎间盘退变的治疗局限于保守治疗和手术治疗，如果保守治疗效果欠佳、无法解决潜在根本问题，就需要手术治疗，但手术治疗存在一定风险，因此迫切需要一种简单有效的替代治疗方法[46]，从椎间盘退变的分子机制入手可以有助于发现新的治疗途径。随着腰痛患者的日渐增多以及对椎间盘病理机制的深入研究和关注，探索一种能够在椎间盘退变早期治疗的药物显得尤为重要。
丁香苷是从刺五加中分离出来的一种活性酚类糖苷[47]，其可以通过阻断细胞增殖和调节凋亡信号通路发挥显著的抗肿瘤作用[48]，此外还具有抗炎、抗氧化和抗凋亡特性[49]。此次实验结果显示，经丁香苷处理后的大鼠退变椎间盘髓核细胞形态、纤维环等都得到恢复，退变椎间盘Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖表达增加，而基质金属蛋白酶3，13的表达下降，这表明丁香苷具有抑制椎间盘退变作用。根据这些特性，结合在椎间盘退变模型中观察到的结果，推测其抑制椎间盘退变的机制可能与一些信号通路有关，例如：通过调节炎症途径核因子κB信号通路来发挥作用[50]；通过调节Nrf2-ARE通路提高抗氧化酶的表达，从而减少氧化应激引起的损伤[51]；通过影响PI3K/AKT信号通路调节细胞增殖、凋亡等[52]；通过调节胶原合成途径转化生长因子β/Smad信号通路来促进椎间盘中相关胶原及聚集蛋白聚糖的表达等[53-54]。
综上所述，丁香苷可通过抑制基质金属蛋白酶3，13的表达、提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达来改善椎间盘的结构和功能，预防和减缓椎间盘退变过程。实验初步探讨了丁香苷在大鼠椎间盘退变过程中对椎间盘组织结构和相关蛋白表达的影响，但并未用相关通路进行验证解释其作用机制，因此仍需后续的细胞实验深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

丁香苷抑制大鼠椎间盘退变

Syringin inhibits intervertebral disc degeneration in rats

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[1]	刘鑫, 胡满, 赵文杰, 张钰, 孟博, 杨盛, 彭晴, 张亮, 王静成. 镉暴露激活PI3K/Akt信号通路诱导椎间盘纤维环细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1217-1222.
[2]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 中药单体靶向自噬治疗骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 627-632.
[3]	李洋, 马飞, 冷叶波, 徐世财, 何宝强, 周佳俊, 廖烨晖, 唐强, 唐超, 王清, 钟德君. 脊柱椎间盘退变与高尿酸血症的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5091-5096.
[4]	陈吉, 张晨, 张濒, 黄磊涛. MR T2* mapping成像技术定量评价腰椎小关节炎软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(30): 4866-4870.
[5]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 380-386.
[6]	周明瀚, 张慧, 郑先波, 徐无忌. 不同氧浓度下髓核细胞中PI3K/Akt/HIF-1α信号通路表达对延缓椎间盘退变的意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4491-4497.
[7]	郭泽华, 李兆勇, 陈龙, 段嘉豪, 蒋浩波, 陈光学, 苏友贤, 刘恩旭, 杨少锋. 补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3974-3980.
[8]	黄杰, 蒋强, 韩嘉恒, 刘江, 张燕, 卢正操, 丁宇. 白细胞介素1β调控信号素3A表达诱发椎间盘退变的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3680-3685.
[9]	谢越, 翟伟峰, 郭际, 贾永伟. 椎间盘退变相关焦亡基因的综合分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(21): 3438-3444.
[10]	王倩, 卢子昂, 李利和, 吕超亮, 王盟, 张存鑫. 青藤碱可有效抑制白细胞介素1β介导的髓核细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 224-230.
[11]	杨云云, 陈祁青, 赵继荣, 朱宝, 马东, 黄军凯, 安德浩, 邹继鹏, 刘伟航. 中药单体介导相关信号通路治疗椎间盘退行性变研究现状[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(18): 2918-2924.
[12]	赵莎莎, 贺庆, 李佳, 吴迎. 补充重组人源胶原蛋白对离心运动后小鼠骨骼肌细胞外基质重塑的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2542-2549.
[13]	寇裕, 顾勇, 陈亮. 黑磷调控氧化应激-炎症级联效应延缓椎间盘退变的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2338-2345.
[14]	李土胜, 丁宇, 蒋强, 张晗硕, 刘江. 经皮椎间孔镜椎间盘切除联合富血小板血浆治疗腰椎间盘突出症[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2385-2390.
[15]	苏少亭, 周红海, 侯召猛, 陆延, 王伟, 陈一鑫, 陈龙豪, 田聪. 腰椎定点旋转手法操作中拇指推力的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(12): 1823-1828.