黑磷调控氧化应激-炎症级联效应延缓椎间盘退变的机制

doi:10.12307/2024.250

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (15): 2338-2345.doi: 10.12307/2024.250

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黑磷调控氧化应激-炎症级联效应延缓椎间盘退变的机制

寇裕，顾勇，陈亮

苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2022-12-13 接受日期:2023-02-14 出版日期:2024-05-28 发布日期:2023-09-19
通讯作者: 陈亮，教授，博士生导师，主任医师，苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215000
作者简介:寇裕，男，1996年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，苏州大学附属第一医院研在读硕士，主要从事骨组织工程方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81972078，82072438)，项目负责人：陈亮

Mechanism of black phosphorus regulating oxidative stress-inflammation cascade in retarding intervertebral disc degeneration

Kou Yu, Gu Yong, Chen Liang

First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2022-12-13 Accepted:2023-02-14 Online:2024-05-28 Published:2023-09-19
Contact: Chen Liang, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
About author:Kou Yu, Master candidate, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81972078, No. 82072438 (to CL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

黑磷量子点：黑磷是一种磷原子构成的片层状二维材料，化学性质较为稳定，生物相容性良好，具有一定的还原性。黑磷量子点是将黑磷晶体通过超声液相剥离法制备的、具有超小尺寸和超薄厚度的黑磷纳米材料。黑磷量子点特定的理化性质使得其在光伏、光电子器件和生物医学等领域具有广泛的应用前景。
Nrf2/ARE通路：对调节细胞氧化应激起重要作用。Nrf2蛋白是一种转录因子，正常情况下细胞在受到氧化性物质激活后，Nrf2转入细胞核与ARE的DNA序列结合，促进NQO1和血红素加氧酶1等具有抗氧化作用的Ⅱ期解毒酶的表达。

背景：氧化应激在椎间盘退行性变中扮演了重要的角色，黑磷量子点作为具有良好生物相容性的还原性材料，具有抗氧化应激并延缓椎间盘退变的潜力。

目的：通过体内外实验验证黑磷量子点清除椎间盘微环境内活性氧的作用，并进一步探究黑磷量子点对抗氧化通路Nrf2/ARE与椎间盘炎症的作用。
方法：采用超声液相剥离法制备黑磷量子点。①体外实验：分离提取SD大鼠髓核细胞，将第2-4代髓核细胞分别与不同的溶液共培养，分别为F12-DMEM培养基(空白组)、黑磷量子点溶液、过氧化氢溶液、过氧化氢+黑磷量子点溶液、过氧化氢+黑磷量子点+Nrf2特异性抑制剂ML385溶液，分别进行细胞活/死染色及细胞内活性氧、线粒体膜电位及Western Blot检测；②体内实验：将30只SD大鼠随机分为假手术组、穿刺组、穿刺+黑磷组，每组10只，穿刺组与穿刺+黑磷组采用椎间盘穿刺法建立Co7-10椎间盘退变模型，穿刺+黑磷组穿刺后向椎间盘注射黑磷量子点分散液，术后4，8周进行椎间盘组织影像学与组织学染色评估。

结果与结论：①体外实验：活/死染色显示，黑磷量子点生物相容性好，对细胞无毒性作用，且在氧化应激条件下对髓核细胞具有保护作用。细胞内活性氧及JC-1荧光探针显示，黑磷量子点可调控氧化应激导致的髓核细胞线粒体膜电位降低，并保护细胞免受过氧化氢诱导的细胞内氧化应激。Western Blot检测显示，与空白组比较，过氧化氢组Nrf2、血红素加氧酶1、醌氧化还原酶、Ⅱ型胶原的蛋白表达降低(P < 0.05)，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13、p65的蛋白表达升高(P < 0.05)；黑磷量子点的加入可逆转过氧化氢对Nrf2通路的抑制作用，减轻氧化应激造成的炎症反应，但Nrf2特异性抑制剂可取消这一作用。②体内实验：X射线片与MRI检测显示，术后4，8周，穿刺组椎间盘高度与髓核含水量低于假手术组(P < 0.05)，穿刺+黑磷组椎间盘高度与髓核含水量高于穿刺组(P < 0.05)。组织学染色显示，穿刺+黑磷组椎间盘退变程度轻于穿刺组，血红素加氧酶1蛋白表达量高于穿刺+黑磷组。③结果表明：黑磷量子点可通过调控Nrf2/ARE通路发挥抗氧化作用，并延缓椎间盘退变。

https://orcid.org/0000-0002-2936-8031(寇裕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 黑磷量子点, 抗氧化应激, Nrf2/ARE通路, 炎症, 椎间盘退变

Abstract: BACKGROUND: Oxidative stress plays a critical role in intervertebral disc degeneration. As a reducing material with good biocompatibility, black phosphorus quantum dots have the potential to resist oxidative stress and retard intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of black phosphorus quantum dots on scavenging reactive oxygen species in the microenvironment of an intervertebral disc through in vivo and in vitro experiments, and further explore the role of black phosphorus quantum dots in Nrf2/ARE pathway and intervertebral disc inflammation.
METHODS: Black phosphorus quantum dots were prepared by a liquid exfoliation technique. (1) In vitro experiment: The nucleus pulposus cells of SD rats were isolated and extracted, and the passages 2-4 nucleus pulposus cells were cocultured with different solutions, including F12-DMEM medium (blank group), black phosphorus quantum dot solution, hydrogen peroxide solution, hydrogen peroxide+black phosphorus quantum dot solution, hydrogen peroxide+black phosphorus quantum dot+Nrf2 specific inhibitor ML385 solution. Cell live/dead staining and intracellular reactive oxygen species, mitochondrial membrane potential and western blot assay were performed respectively. (2) In vivo experiment: Thirty SD rats were randomly divided into sham operation, puncture and puncture + black phosphorus groups, with 10 rats in each group. A Co7-10 intervertebral disc degeneration model was established using intervertebral disc puncture in the puncture group and the puncture+black phosphorus group. Black phosphorus quantum dot solution was injected in the intervertebral disc after a puncture in the puncture+black phosphorus group. The intervertebral disc tissue imaging and histological staining were evaluated at 4 and 8 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: Live/dead staining revealed that the black phosphorus quantum dots had good biocompatibility, were non-toxic to cells, and had a protective effect on nucleus pulposus cells under oxidative stress. Intracellular reactive oxygen species and JC-1 fluorescent probes showed that black phosphorus quantum dots could regulate the reduction of mitochondrial membrane potential caused by oxidative stress in nucleus pulposus cells and protected cells from hydrogen peroxidation-induced intracellular oxidative stress. Western blot analysis showed that compared with the blank group, the protein expressions of Nrf2, heme oxygenase 1, quinone oxidoreductase and type II collagen were decreased in the hydrogen peroxide group (P < 0.05), while the protein expressions of tumor necrosis factor α, interleukin 1β, matrix metalloproteinase 13 and p65 were increased (P < 0.05). The addition of black phosphorus quantum dots could reverse the inhibitory effect of hydrogen peroxide on the Nrf2 pathway and reduce the inflammatory response caused by oxidative stress, but NrF2-specific inhibitors could cancel this effect. (2) In vivo experiment: X-ray and MRI demonstrated that at 4 and 8 weeks after surgery, the intervertebral disc height and water content of nucleus pulposus in the puncture group were lower than those in the sham operation group (P < 0.05), and the intervertebral disc height and water content of nucleus pulposus in the puncture+black phosphorus group were higher than those in the puncture group (P < 0.05). Histological staining exhibited that the degree of intervertebral disc degeneration in the puncture+black phosphorus group was less than that in the puncture group, and the expression of heme oxygenase 1 protein was higher than that in the puncture+black phosphorus group. (3) Our results have indicated that black phosphorus quantum dots can exert an antioxidant effect and delay intervertebral disc degeneration by regulating Nrf2/ARE pathway.

Key words: black phosphorus quantum dot, antioxidant stress, Nrf2/ARE pathway, inflammation, intervertebral disc degeneration

中图分类号:

寇裕, 顾勇, 陈亮. 黑磷调控氧化应激-炎症级联效应延缓椎间盘退变的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(15): 2338-2345.

Kou Yu, Gu Yong, Chen Liang. Mechanism of black phosphorus regulating oxidative stress-inflammation cascade in retarding intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(15): 2338-2345.

图/表（结果） 8

2.1 黑磷量子点表征结果通过超声液相剥离法成功制备黑磷量子点，如图1A所示，制得的黑磷量子点分散液性状为淡黄色半透明液体，与典型黑磷量子点分散液性状一致[32]。透射电镜下黑磷量子点分散均匀且形态规则，见图1B。粒度分析仪测得黑磷量子点平均粒径为8 nm，见图1C。如图1D所示，黑磷量子点中拉曼散射光谱的代表峰约为平面外声子模(A1g)358.4 cm-1、平面内模(B2g)438.2 cm-1和(A2g)467.1 cm-1，与黑磷的典型拉曼光谱一致[33]，加入过氧化氢后黑磷量子点拉曼光谱特征性峰值下降，表明黑磷量子点在与过氧化氢的反应中被消耗[24]。

2.2 黑磷量子点体外细胞实验结果
2.2.1 黑磷量子点生物相容性及保护髓核细胞增殖活性能力 CCK-8实验结果显示，黑磷量子点质量浓度在100，200，400，800 μg/mL时，髓核细胞的增殖活性与空白组无明显差异(P > 0.05)，见图2A，进一步验证了黑磷量子点良好的生物相容性。过氧化氢浓度在50，100，200，400，800 μmol/L时，髓核细胞的增殖活性受到抑制，且这一作用随过氧化氢浓度的增高更加明显，见图2B。使用黑磷量子点与过氧化氢共同干预髓核细胞，相较空白组，过氧化氢的干预显著降低了髓核细胞的增殖活性，当黑磷量子点质量浓度在100，200，400，800 μg/mL时髓核细胞增殖活性有所恢复，黑磷量子点质量浓度在100，200 μg/mL时细胞增殖活性升高(P < 0.05，P < 0.01)；黑磷量子点质量浓度在200，400，800 μg/mL时3组细胞增殖活性无明显差异(P > 0.05)，见图2C。活/死染色结果显示，黑磷组、空白组髓核细胞增殖良好，几乎没有死细胞，说明黑磷量子点生物相容性良好，对细胞无毒性作用；过氧化氢组细胞数量减少，死细胞数量明显增多；黑磷+过氧化氢组较过氧化氢干预组活细胞数量增多、死细胞数量明显减少，见图2D，说明黑磷量子点在氧化应激环境下对髓核细胞具有保护作用。

2.2.2 黑磷量子点调控氧化应激导致的髓核细胞线粒体膜电位降低线粒体膜电位下降标志着细胞凋亡的早期。通过JC-1荧光探针检测髓核细胞线粒体膜电位，结果显示，过氧化氢组线粒体膜电位较空白组降低(P < 0.01)，黑磷+过氧化氢组线粒体膜电位较过氧化氢组升高(P < 0.05)，而空白组及黑磷组线粒体膜电位无差异(P > 0.05)，见图3A、C。
2.2.3 黑磷量子点对细胞内活性氧清除效果 DCHF-DA荧光染料可被细胞内活性氧氧化，形成具有绿色荧光的2’，7’二氯荧光素。根据荧光强度定量分析结果，发现过氧化氢组绿色荧光强度最高，黑磷+过氧化氢组绿色荧光强度显著降低，而空白组与黑磷组绿色荧光强度极低，见图3B、D。这些结果表明，黑磷量子点可以保护细胞免受过氧化氢诱导的细胞内氧化应激。

2.2.4 黑磷量子点促进Nrf2核转移及其下游酶谱 RT-qPCR检测结果显示，与空白组比较，50，100，200 μmol/L的过氧化氢增加了髓核细胞内血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的mRNA水平(P < 0.05)，当过氧化氢浓度达到400 μmol/L以上时，髓核细胞内血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的mRNA水平显著下降(P < 0.05)，见图4A、B，说明在该浓度过氧化氢下髓核细胞内Nrf2通路活性下降，其下游的Ⅱ期解毒酶基因表达下降。Nrf2的核转位是Nrf2/ARE信号通路激活的标志[34]。实验提取了细胞核蛋白以检测Nrf2的激活，如图4C-F所示，与空白组相比，细胞毒性浓度的过氧化氢干预显著抑制了Nrf2蛋白的核转位，血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的蛋白表达也被过氧化氢处理显著抑制；然而，与单独过氧化氢处理相比，黑磷量子点与过氧化氢共同处理后细胞中的Nrf2蛋白核转位显著增加，血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的蛋白表达也显著增加。这些结果表明，黑磷量子点有助于Nrf2核转位，提高Ⅱ期解毒酶的表达。

2.2.5 黑磷量子点通过激活Nrf2通路抑制核因子κB炎症通路核因子κB通路是椎间盘退变中被激活的经典炎症通路之一[21]，有文献报道，Nrf2通路对核因子κB通路存在抑制作用[12，19-20]。
为了证实Nrf2对核因子κB的抑制作用，检测了空白组、过氧化氢组、黑磷+过氧化氢组及黑磷+过氧化氢+ML385组中p65的核转位水平，结果表明，过氧化氢组p65核转位水平高于空白组(P < 0.01)，但与过氧化氢组相比，黑磷+过氧化氢干预后p65核转位水平降低(P < 0.01)；然而，Nrf2特异性抑制剂ML385阻断了黑磷量子点对核因子κB的抑制作用(P < 0.01)，见图5A、C。
2.2.6 黑磷量子点影响髓核细胞炎症因子及髓核退变相关分子表达 Western Blot检测结果表明，与空白组比较，过氧化氢组相白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等炎症细胞因子的蛋白表达显著增加(P < 0.05)，基质金属蛋白酶13的蛋白表达也显著增加(P < 0.01)，而细胞外基质成分Ⅱ型胶原的蛋白表达显著减少(P < 0.01)，黑磷量子点的加入逆转了上述趋势，见图5B及图5D-G。

2.2.7 各组髓核细胞免疫荧光染色结果通过细胞免疫荧光染色进一步验证黑磷量子点在髓核细胞氧化应激的条件下对Nrf2通路下游Ⅱ期解毒酶血红素加氧酶1及细胞外基质成分Ⅱ型胶原表达的影响。结果显示，黑磷组血红素加氧酶1、Ⅱ型胶原表达量与空白组相比无明显差异(P > 0.05)，过氧化氢组血红素加氧酶1、Ⅱ型胶原表达量较空白组下降(P < 0.01)，而黑磷+过氧化氢组血红素加氧酶1、Ⅱ型胶原表达量高于过氧化氢组(P < 0.01)，见图6，7。

2.3 黑磷量子点动物体内实验结果
2.3.1 实验动物数量分析 30只大鼠全部进入结果分析。
2.3.2 影像学评估结果如图8A、F所示，穿刺组术后4，8周的椎间盘高度明显低于假手术组(P < 0.01)，黑磷+穿刺组后4，8周的椎间盘高度明显高于穿刺组(P < 0.01)。MRI也能可靠地反映椎间盘的再生，T2加权信号较高，表明髓核含水量较高。根据改进的汤姆逊分类法，MRI图像根据T2加权信号强度被分类为Ⅰ-Ⅳ级[35]。术后4，8周，穿刺组T2加权信号显著低于假手术组(P < 0.01)，黑磷+穿刺组髓核T2加权信号均高于穿刺组(P < 0.05，P < 0.01)，见图8B、G。说明黑磷量子点的加入起到了延缓椎间盘退变的效果。
2.3.3 组织学评价结果苏木精-伊红和番红固绿染色结果见图8D、E、H所示，不论是在术后4周还是8周，相较于假手术组，穿刺组椎间盘髓核组织胶原含量减少，髓核和纤维环之间的边界模糊；与穿刺组相比，黑磷+穿刺组椎间盘组织的变性和结构损伤均有所改善，髓核和纤维环之间有明确的边界，髓核组织的胶原含量有所提高；术后4周和8周，黑磷+穿刺组的组织学评分显著高于穿刺组(P < 0.05)，但低于假手术组(P < 0.05)。
免疫组化染色结果显示，术后4，8周，穿刺组大鼠椎间盘组织内血红素加氧酶1表达量较假手术组降低，黑磷+穿刺组大鼠椎间盘组织内血红素加氧酶1表达量高于穿刺组，见图8C、8I。证明黑磷量子点在体内促进了Nrf2通路的激活，起到了抗氧化应激作用。

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引言

椎间盘退行性变是下腰痛最常见的病因之一[1]。椎间盘位于相邻椎体之间，由髓核、纤维环和软骨终板3个部分组成。髓核组织位于上下相邻两软骨终板之间，并被纤维环包围。髓核细胞外基质中含有Ⅱ型胶原和蛋白多糖等弹性成分[2]，是椎间盘能够承受各种机械应力的主要功能成分[3]。在髓核退变的过程中，衰老的髓核细胞显著增多，髓核组织内细胞外基质含量也显著下降，进一步导致髓核组织功能障碍以及椎间盘退行性变[4-5]。
大量证据证明，退变髓核组织中存在氧化应激[6-8]。成年人椎间盘没有血管形成，与外界物质交换主要通过终板的渗透作用，但椎间盘细胞仍然通过氧化磷酸化来供能，而活性氧是主要的副产物[9]。当活性氧生成和抗氧化防御之间的动态平衡在某些病理条件下被破坏时，就会发生氧化应激损伤，然后导致椎间盘退变[10-11]。因此，对抗氧化应激，减少髓核细胞的死亡被认为是减缓甚至逆转椎间盘退变的关键。
Nrf2是一种细胞抗氧化应激调节因子，控制一系列抗氧化应激解毒酶基因的表达，对细胞的氧化应激和蛋白毒性应激具有适应性保护作用[12]。在活性氧存在的情况下，Nrf2由细胞质转入细胞核中，与抗氧化反应元件ARE结合，促进醌氧化还原酶和血红素加氧酶1等Ⅱ期解毒酶的表达[12-14]。虽然Nrf2通路通受氧化剂或亲电子试剂激活，但在过度氧化应激的条件下Nrf2通路活性反而被抑制。抗氧化剂不仅可以直接清除活性氧，还可以恢复Nrf2通路活性，减缓氧化应激损伤[6，15-18]。此外，Nrf2通路还被证明对炎症具有一定的抑制作用，且Nrf2通路对炎症的抑制与对核转录因子κB通路的调控作用相关[12，19-20]，而核因子κB通路在椎间盘退变中起着重要的作用[21]。
黑磷是一种新型二维材料，是磷单质中最稳定的同素异形体，具有良好的生物相容性，降解产物为无毒的磷酸盐和膦酸盐[22-23]，因此被广泛应用于生物医学领域[24-27]。此外有研究表明，黑磷纳米材料还具有抗炎和免疫调节作用，抑制促炎因子表达、促进抗炎因子释放[26]。然而，很少有研究关注黑磷量子点通过对抗氧化应激对椎间盘退变的治疗作用及潜在的机制。
此次研究拟通过体内外实验，探究黑磷量子点通过抗氧化应激减轻椎间盘局部炎症，并延缓椎间盘退变的功效。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料表征，体外大鼠髓核细胞细胞实验，大鼠体内随机对照实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年2-10月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性SD大鼠30只，SPF级，6-8月龄，体质量(300±50) g，每5只大鼠合笼饲养，饲养环境为室温、相对湿度50%-60%，用于体内动物实验；雄性SD大鼠4只，SPF级，3月龄，体质量200-250 g，用于体外实验髓核细胞分离与培养。大鼠均购自苏州大学实验动物中心，许可证号：SCXK (苏)2022-0008)。实验方案已通过苏州大学动物伦理委员会批准，批准号：SUDA20220106A01。
1.3.2 主要药物与试剂黑磷晶体粉末(南京先丰纳米材料科技有限公司)；JC-1荧光探针试剂盒、DCFH-DA荧光探针试剂盒(中国北京索莱宝科技有限公司)；F12-DMEM培养基、胎牛血清、双抗混合液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；Trizol溶液、40 g/L多聚甲醛固定液(上海碧云天有限公司)；CCK-8试剂盒(中国南京优宝生物公司)；Nrf2特异性抑制剂ML385(美国MedChem Express公司)；反转录试剂盒(日本Takara公司)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；甲醛溶液、EDTA脱钙溶液(中国上海源叶生物有限公司)；Nrf2抗体、血红素加氧酶11抗体、醌氧化还原酶抗体、LaminB抗体、β-Actin抗体、P65抗体、肿瘤坏死因子α抗体、白细胞介素1β抗体、基质金属蛋白酶13抗体、Ⅱ型胶原抗体(美国Abcam公司)。
1.3.3 主要仪器超声细胞破碎仪(中国南京赛飞有限公司)；透射电子显微镜(美国FEI公司)；细胞培养箱(新加坡四高科技有限公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；X射线机(美国GE)；核磁共振仪器(美国GE-HDx1.5T)；石蜡包埋机、切片机(德国Leica公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 黑磷量子点制备将30 mg散装黑磷粉末分散在30 mL N-甲基吡咯烷酮中，避光条件下在冰浴中用超声细胞破碎仪以200 W的功率连续超声处理15 h。之后7 000 r/min离心20 min，得到含有黑磷量子点的上清液；将上清液13 000 r/min离心45 min，用去离子水反复冲洗沉淀物3次，以除去N-甲基吡咯烷酮，得到黑磷量子点的水分散液。黑磷量子点在制备、储存及后续体内外实验中全程避光。
1.4.2 黑磷量子点表征使用透射电子显微镜在200 kV电压下拍摄黑磷量子点图像。将含有50 μg 黑磷量子点的溶液0.1 mL与0.1 mL去离子水在玻璃片上混合，静置5 min，在785 nm的激光激发下，使用拉曼显微光谱仪进行黑磷量子点拉曼光谱检测。随后将含有50 μg 黑磷量子点和3 μg 过氧化氢的溶液各0.1 mL在玻璃片上混合，5 min后，在785 nm的激光激发下使用拉曼显微光谱仪进行拉曼光谱检测。
1.4.3 髓核细胞的分离与培养参照课题组先前研究中的髓核细胞分离与培养方法[28-30]。取4只SD大鼠，通过腹腔注射过量3%戊巴比妥钠执行安乐死，然后在无菌条件下分离大鼠尾椎；将大鼠髓核组织分离至无菌离心管中，用0.1%的Ⅱ型胶原酶在37 ℃下消化4 h，其间每30 min观察一次，并摇晃离心管以促进Ⅱ型胶原降解；消化结束后，用70 μm无菌细胞过滤器过滤多余的组织碎片，通过离心法去除胶原酶，加入F12-DMEM完全培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中。每72 h更换一次培养基。
1.4.4 体外细胞实验
CCK-8实验：①首先评估了不同浓度过氧化氢对髓核细胞的毒性作用。向96孔板每孔加入100 μL髓核细胞，细胞浓度为5×107 L-1，待细胞贴壁后，分别加入由F12-DMEM培养基配置的过氧化氢溶液100 μL，使96孔板每孔内最终过氧化氢浓度分别为 0，50，100，200，400，800 μmol/L，避光条件下培养24 h。根据试剂盒说明书，按1∶10的比例混合CCK-8溶液和F12-DMEM培养基，配置成CCK-8工作液。培养24 h，吸去96孔板内培养基后，使用无菌PBS洗涤3次，每孔滴加100 μL的CCK-8工作液，移至培养箱中避光孵育2 h，用酶标仪测定吸光度值，波长设为450 nm。②通过CCK-8实验验证黑磷量子点的生物相容性。向96孔板每孔中加入100 μL髓核细胞，细胞浓度为5×107 L-1，细胞贴壁后，将培养基更换为含不同质量浓度(0，100，200，400，800 μg/mL)黑磷量子点的F12-DMEM培养基，避光培养24 h。采用CCK-8试剂盒测定细胞增殖情况。③评估黑磷量子点在氧化应激环境下恢复髓核细胞增殖活性的能力。先向96孔板中每孔加入100 μL髓核细胞，细胞浓度为5×107 L-1，待细胞贴壁后，更换为新鲜的F12-DMEM培养基、含400 μmol/L过氧化氢的F12-DMEM培养基及含不同质量浓度(100，200，400，800 μg/mL)黑磷量子点+400 μmol/L过氧化氢F12-DMEM培养基，避光培养24 h。采用CCK-8 试剂盒测定细胞增殖情况。
细胞活/死染色：通过髓核细胞活/死染色测定黑磷量子点生物相容性。24孔板的每孔接种1×104个髓核细胞，贴壁后分4组培养，分别更换为新鲜的F12-DMEM培养基(空白组)、含200 μg/mL 黑磷量子点的F12-DMEM培养基、含400 μmol/L过氧化氢的F12-DMEM培养基及含200 μg/mL 黑磷量子点+400 μmol/L过氧化氢的F12-DMEM培养基，1 mL/孔，移至细胞培养箱中培养4 d。将5 µL钙黄绿素和20 µL溴乙啡锭二聚体-1加入10 mL PBS配置成活/死细胞染液，在室温环境下对上述细胞进行染色，荧光显微镜下观察拍照。绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞。
细胞内活性氧检测：24孔板的每孔接种1×104个髓核细胞，贴壁后的分组及处理同细胞活/死染色，移至细胞培养箱中培养24 h。将DCHF-DA荧光探针与无菌PBS配制成5 μmol/L的溶液，随后与各组细胞于37 ℃孵育30 min，用PBS洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察与拍摄。
线粒体膜电位测定：24孔板的每孔接种1×104个髓核细胞，贴壁后的分组及处理同细胞活/死染色，移至细胞培养箱中培养24 h。加入10 μL JC-1试剂，在37 ℃下孵育15-20 min，用PBS洗涤细胞2次，荧光显微镜下观察与拍摄。
qRT-PCR检测：通过qRT-PCR检测评估不同浓度过氧化氢对髓核细胞血红素加氧酶1、醌氧化还原酶的mRNA表达的影响。向6孔板中每孔接种1×106个髓核细胞，待细胞贴壁后，分别加入由F12-DMEM培养基配置的过氧化氢溶液，最终过氧化氢浓度分别为 0，50，100，200，400，800 μmol/L，培养24 h。每孔细胞沉淀加入1 mL的Trizol充分裂解，提取RNA并测定RNA浓度。通过反转录反应获得cDNA。反应结束后进行

qRT-PCR分析，反应条件设置为：95 ℃反应30 s，95 ℃反应5 s，60 ℃退火30 s，重复40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

Western Blot检测：6孔板中每孔接种1×106个髓核细胞，待细胞贴壁后，分别加入新鲜的F12-DMEM培养基(空白组)、含400 μmol/L过氧化氢的F12-DMEM培养基及含200 μg/mL 黑磷量子点+400 μmol/L过氧化氢的F12-DMEM培养基，1 mL/孔，培养24 h，检测血红素加氧酶1、醌氧化还原酶、肿瘤坏死因α、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原的蛋白表达。在上述分组的基础上，增加过氧化氢+黑磷量子点+ML385组，ML385的浓度为5 μmol/L，培养24 h，检测p65蛋白的表达。培养结束后，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白，使用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白。通过BCA法测定蛋白的浓度。通过电泳、转膜、封闭后孵育一抗(1∶400)过夜，室温下用HRP标记驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育90 min，洗膜，使用增强化学发光试剂显影，最后使用ImageJ软件进行定量分析。
细胞免疫荧光染色：细胞分组与处理同细胞活/死染色。培养24 h后，室温下用40 g/L多聚甲醛固定，并用0.3%Triton-X100打孔，用5%BSA阻断后，与一抗(兔抗鼠血红素加氧酶1抗体、Ⅱ型胶原抗体，1∶400)在4 ℃下孵育过夜；孵育后用洗涤，再将细胞与Alex Fluor 594标记驴抗兔IgG二抗(1∶400)在室温下孵育2 h。随后在室温下用鬼笔环肽和DAPI染色，然后使用共焦显微镜观察。使用ImageJ软件进行血红素加氧酶1与Ⅱ型胶原半定量荧光强度分析。
1.4.5 体内动物实验
椎间盘退变造模与分组干预：采用随机数字表法将30只SD大鼠分为假手术组、穿刺组与穿刺+黑磷组，每组10只。腹腔内注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉大鼠，对大鼠尾部进行消毒，假手术组单纯刺破尾部椎间盘位置的皮肤，不对椎间盘进行穿刺；穿刺组与穿刺+黑磷组用21 G针头依次穿刺尾椎Co7-10节段以诱导变性，为了确保造成创伤，使用针穿刺椎间盘中心，旋转5 s，然后保持30 s的位置；穿刺后，向穿刺+黑磷组每个椎间盘注射20 µL的黑磷量子点分散液(200 μg/mL)，向穿刺组每个椎间盘注射20 μL的无菌PBS。术后将大鼠置于温暖通风处饲养。
影像学评估：在术后4，8周，每个时间点每组随机取5只大鼠进行X射线摄片与MRI扫描。对于X射线片，由不了解实验分组且经验丰富的放射科医生测量椎间盘高度并计算椎间盘高度指数，将实验干预的椎间盘与正常椎间盘的椎间盘高度指数值相比，得到椎间盘的椎间盘高度指数变化率，椎间盘高度指数变化率数值越高，代表实验干预的椎间盘高度越接近正常椎间盘，椎间盘退变程度越低。通过MRI扫描大鼠鼠尾获得鼠尾椎间盘矢状位T2加权信号图像，根据改良的Thomson分类，将鼠尾椎间盘T2加权图像信号强度分为Ⅰ-Ⅳ级，Ⅰ级，正常；Ⅱ级，信号强度轻微降低，但高信号区域明显变窄；Ⅲ级，信号密度中度降低；Ⅳ级，信号严重降低)，并由经验丰富的放射科医生进行评估。

组织学染色与评估：在术后4，8周，进行影像学检测后，腹腔注射过量3%戊巴比妥钠处死大鼠，从鼠尾取出相应节段椎间盘，于体积分数10%甲醛中浸泡48 h，之后于10%EDTA中脱钙30 d。将椎间盘组织嵌入石蜡块中切成5 µm组织切片，包含上下终板、纤维环和髓核，分别进行苏木精-伊红、番红固绿染色与免疫组化染色。对于苏木精-伊红、番红固绿染色，根据MASUDA等[31]的研究进行组织学分级，组织学分级具体标准如表2所示，分数越高表明椎间盘退变越严重。切片经过抗原修复后，放入体积分数3%过氧化氢溶液中，室温下避光孵育25 min；用PBS在脱色摇床上将切片洗涤3次，将切片置于3%BSA溶液中室温下封闭30 min；加入一抗(兔抗鼠血红素加氧酶1抗体，1∶200)在4 ℃下孵育过夜，然后加入HRP标记的驴抗兔特异性二抗(稀释比例1∶400)，在室温下孵育50 min；加入DAB对切片进行染色，并用苏木精反染细胞核；最后，对切片进行干燥、封固后在显微镜下对切片进行观察、拍照。利用Image J软件对血红素加氧酶1免疫组化结果进行定量分析。

1.5 主要观察指标黑磷量子点的表征、生物相容性以及对细胞内活性氧清除能力；黑磷量子点对髓核细胞Nrf2/ARE通路相关基因及蛋白表达的影响；黑磷量子点对髓核细胞炎症因子表达的影响；黑磷量子点在体内延缓椎间盘退变的作用。
1.6 统计学分析数据结果表示为x±s。使用Origin 9.1软件进行统计学分析及绘图。组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05时表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经苏州大学附属第一医院生物统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变的机制尚且有待阐明，但可以确定的一点是，椎间盘退变与髓核细胞遭受氧化应激密切相关[6，36-38]。由于椎间盘自身的结构与代谢特点，活性氧在髓核组织中普遍存在[9]，且活性氧在体内髓核细胞中主要以过氧化氢的形式产生[39]。氧化应激传统上被认为是有害的，但事实上正常细胞中活性氧的受控产生有助于调节信号通路，活性氧可作为重要的信号分子来调节细胞分裂、炎症、免疫功能、自噬和应激反应等过程[40]。然而，不受控制的活性氧产生会导致氧化应激，从而损害细胞功能，在髓核组织中的氧化应激最终会导致髓核细胞衰老、死亡，减少髓核组织细胞外基质，最终导致椎间盘退变以及下腰痛。
此次实验成功制得了淡黄色半透明的黑磷量子点分散液，其性状与典型黑磷量子点分散液性状一致[32]。透射电子显微镜与拉曼光谱证实成功制备了黑磷量子点，加入过氧化氢后黑磷量子点拉曼光谱特征性峰值下降，表明黑磷量子点在与过氧化氢的反应中被消耗[24]，这一现象证明了黑磷量子点具有清除过氧化氢的能力。此次实验将黑磷晶体粉末制备成黑磷量子点，是因为黑磷量子点具有更大的反应面积，对过氧化氢的清除效率更高。
在体外实验中，活/死染色与CCK-8实验结果表明，黑磷量子点的生物相容性良好，具有低细胞毒性，这是黑磷量子点能够广泛应用于生物医学领域的基础。而且黑磷量子点还逆转了过氧化氢诱导的髓核细胞增殖活性下降。此外，还通过CCK-8实验确定了后续实验中过氧化氢以及黑磷量子点的干预浓度，超过400 μmol/L的过氧化氢将细胞存活率降低值50%以下，故选取400 μmol/L浓度的过氧化氢用于后续实验；黑磷量子点质量浓度超过200 μg/mL后细胞增殖活性没有显著升高，所以选择了200 μg/mL的黑磷量子点用于后续实验。
为了进一步验证黑磷量子点对细胞增殖活性产生保护作用的机制，进行了后续的DCFH-DA荧光探针实验与线粒体膜电位测定实验。DCFH-DA荧光探针实验结果证明，黑磷量子点对过氧化氢诱导产生的细胞内活性氧具有清除作用，而单纯黑磷干预下髓核细胞内活性氧与空白组无异。黑磷量子点具有一定还原性，这是其拥有抗氧化应激能力的基础，黑磷作为磷单质中最稳定的同素异形体，可在消除各类活性氧分子[41]，同时反应生成物为无毒的磷酸盐和膦酸盐[22-23]，不会对细胞产生毒性作用。尽管有研究发现，黑磷纳米材料在近红外甚至可见光照射下会促进活性氧的产生[42]，但避光条件下黑磷纳米材料却具有良好的抗氧化性，能够有效清除细胞内外的活性氧[24，26]。椎间盘在体内处于封闭环境，无特殊干扰的情况下不会受到近红外及可见光的干扰，因此选择了黑磷量子点治疗椎间盘退变。此次实验中黑磷量子点从制备、储存到体内外实验干预过程中全程避光。氧化应激会导致线粒体功能障碍，线粒体功能障碍不仅会促进细胞凋亡，还会通过增加活性氧的产生进一步加重氧化应激，形成恶性循环，这一机制在椎间盘退变中发挥重要作用[11，43-44]。线粒体膜电位下降是线粒体功能障碍的表现，此次实验中黑磷量子点的单独干预没有对髓核细胞线粒体膜电位产生影响，并且逆转了过氧化氢导致的线粒体膜电位下降。综上所述，黑磷量子点能够在对抗髓核细胞氧化应激的同时，减轻髓核细胞的线粒体功能障碍，并维持髓核细胞的增殖活性。
Nrf2/ARE信号通路在防御氧化应激损伤方面发挥着不可或缺的作用[45]，因此，通过分析Nrf2以及下游靶基因血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的mRNA和蛋白表达水平，可以进一步探究黑磷量子点在分子机制层面上对髓核细胞氧化应激的影响。先前的研究发现，亚细胞毒性浓度的致氧化应激因素(如过氧化氢、叔丁基过氧化氢、阿霉素)对髓核细胞中Nrf2/ARE通路有一定的激活作用，但当上述致氧化应激因素的浓度过高时，Nrf2/ARE通路反而受到显著抑制，细胞抗氧化能力进一步下降，从而产生恶性循环[6，15，18，46]。
而还原性药物的加入不仅可以降低细胞外微环境中活性氧的浓度，Nrf2信号通路也一定程度上被激活[15]。此次实验发现，与空白组相比，低浓度的过氧化氢能够激活Nrf2/ARE通路，表现为Nrf2下游靶基因血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的mRNA表达水平增加；但当过氧化氢浓度达到400 μmol/L时，血红素加氧酶1和醌氧化还原酶的mRNA表达水平显著下降，低于空白组，表明Nrf2/ARE通路受到了抑制。上述现象很可能是由于：在过高的过氧化氢浓度(400 μmol/L)下，髓核细胞整体的活性下降，细胞内各类蛋白质功能都受到了抑制，其中也包括了维持Nrf2核转位及其下游基因表达所必需的各种酶与生物活性分子。Western Blot检测结果表明，单纯的过氧化氢干预抑制了髓核细胞内Nrf2的核转位，并抑制了Nrf2下游的Ⅱ期解毒酶血红素加氧酶1、醌氧化还原酶的表达，而黑磷量子点的加入逆转了上述趋势。结合qRT-PCR实验与Western Blot检测结果，作者认为这是由高浓度过氧化氢导致了Nrf2通路活性的下降，而黑磷量子点可以将过氧化氢浓度降低至亚细胞毒性浓度，进而恢复Nrf2信号通路的活性，增加血红素加氧酶1、醌氧化还原酶等Ⅱ期解毒酶表达，增强髓核细胞的抗氧化能力。
黑磷量子点不仅可减轻细胞氧化应激损伤，还可以通过其抗氧化作用调控髓核细胞的炎症反应。核因子κB信号通路参与调控细胞炎症反应，在氧化应激导致椎间盘退变的过程中起到了重要作用[47]，过量的活性氧可以通过核因子κB通路诱导髓核细胞的无菌性炎症及细胞外基质的分解代谢[48]。此次实验通过Western blot检测验证了黑磷量子点能够抑制核因子κB信号通路活性，下调其下游炎症因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的表达，并且恢复了髓核细胞中细胞外基的合成-分解代谢失衡，表现为基质金属蛋白酶13表达的减少及Ⅱ型胶原表达的增加。为了进一步探究黑磷量子点调控髓核细胞炎症反应的分子机制，采用Nrf2特异性抑制剂ML385来验证Nrf2与核因子κB信号通路之间的相互作用，结果显示，黑磷对核因子κB通路的抑制作用被Nrf2特异性抑制剂ML385削弱，说明作为抗氧化基因的主要调节器，Nrf2通路参与了黑磷量子点对椎间盘退变过程中无菌性炎症的调控。
为了进一步验证黑磷量子点在体内的治疗效果，选取大鼠尾椎穿刺退变模型进行进一步的研究。在注射黑磷量子点治疗4周及8周后，穿刺+黑磷组椎间盘高度指数变化率、MRI评分、组织学评分均优于穿刺组，表明黑磷量子点在体内对于退变的椎间盘有一定的治疗效果，增加了髓核组织细胞外基质弹性成分，维持了髓核组织形状。免疫组化染色证明了黑磷量子点在体内可以促进Nrf2通路的激活，起到抗氧化应激的作用，并增加细胞外基质弹性成分Ⅱ型胶原的表达。HOU等[24]的研究对黑磷在小鼠体内的安全性进行了系统性评估，对小鼠静脉注射黑磷纳米材料后，小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏均未发现损伤，血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶均未发现异常，表明黑磷纳米材料在拥有良好抗氧化能力的同时还具有良好的生物安全性。
实验尚有一些不足之处：①单纯的黑磷量子点溶液在短时间内尚能发挥一定的治疗作用，但由于其降解较快难以长期、稳定地发挥作用。近年来，组织工程学技术在椎间盘退行性变治疗中的作用受到广泛关注[49]，在后续进一步的实验中，可以采用水凝胶微球[28]、功能化多孔微球包裹等方法使黑磷量子点具有缓释作用[29]，延长黑磷的治疗作用时间，改善长期治疗效果。②此外，大鼠椎间盘针刺退变模型与人椎间盘退变的病理过程存在一定差异。
综上所述，实验使用了具有高生物安全性、良好抗氧化性的新型材料黑磷量子点，来调控椎间盘退变过程中氧化应激和无菌性炎症的双重病理环境，在体内外实验中证明了黑磷量子点能够通过调控髓核细胞Nrf-2通路减轻椎间盘所受氧化应激损伤，最终延缓大鼠椎间盘组织退变，在证明黑磷量子点具有良好抗氧化性生物效应的同时，也为椎间盘退变的治疗提供了新的策略。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

黑磷调控氧化应激-炎症级联效应延缓椎间盘退变的机制

Mechanism of black phosphorus regulating oxidative stress-inflammation cascade in retarding intervertebral disc degeneration

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