补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制

doi:10.12307/2024.188

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 3974-3980.doi: 10.12307/2024.188

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补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制

郭泽华1，2，李兆勇2，陈龙2，段嘉豪1，2，蒋浩波1，2，陈光学1，2，苏友贤1，2，刘恩旭1，2，杨少锋2

1湖南中医药大学，湖南省长沙市 410208；2湖南中医药大学第一附属医院，湖南省长沙市 410007

收稿日期:2023-07-10 接受日期:2023-08-09 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 杨少锋，博士，主任医师，湖南中医药大学第一附属医院，湖南省长沙市 410007
作者简介:郭泽华，男，1997年生，湖南省郴州市人，汉族，在读硕士，主要从事脊柱与脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82174402)，项目负责人：杨少锋；湖南省自然科学基金(2023JJ40504)，项目负责人：李兆勇；长沙市自然科学基金(kq2208203)，项目负责人：李兆勇；湖南中医药大学校级科研基金与联合基金(2021XJJJ041)，项目负责人：陈龙

Action mechanism of Bushenhuoxue decoction on promoting nucleus pulposus-like differentiation of adipose-derived stem cells

Guo Zehua1, 2, Li Zhaoyong2, Chen Long2, Duan Jiahao1, 2, Jiang Haobo1, 2, Chen Guangxue1, 2, Su Youxian1, 2, Liu Enxu1, 2, Yang Shaofeng2

1Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan Province, China; 2First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China

Received:2023-07-10 Accepted:2023-08-09 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Yang Shaofeng, PhD, Chief physician, First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China
About author:Guo Zehua, Master candidate, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan Province, China; First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82174402 (to YSF); Hunan Provincial Natural Science Foundation, No. 2023JJ40504 (to LZY); Changsha Natural Science Foundation, No. kq2208203 (to LZY); Hunan University of Chinese Medicine School-Level Scientific Research Fund and Joint Fund, No. 2021XJJ041 (to CL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

间充质干细胞：在一定条件下能够分化为椎间盘细胞，同时分泌多种营养因子，促进组织稳态以及免疫调节，这些特性对于促进椎间盘组织修复具有重要意义。
细胞共培养：采用Transwell小室将2种细胞进行非接触式共培养，小室允许细胞培养液及细胞因子在上、下两层之间进行交换，并且能够防止大分子物质通过，可方便观察细胞的生长状态及检测相关蛋白的表达水平。

背景：干细胞移植是防治椎间盘退变的新思路，但移植后的干细胞如何顺利存活、增殖、分化，并恢复髓核细胞功能，是目前亟需克服的重点和难点。

目的：探讨补肾活血方对脂肪间充质干细胞存活、增殖、类髓核分化的影响。
方法：采用Transwell小室构建人脂肪间充质干细胞和人退变髓核细胞共培养模型。实验分为对照组、模型组、含药血清组、无药血清组，除对照组外，其余各组均用50 μmol/L叔丁基过氧化氢干预24 h，然后含药血清组和无药血清组分别予以含体积分数20%补肾活血方含药血清或无药血清的DMEM低糖完全培养液干预48 h，取下层脂肪间充质干细胞，甲苯胺蓝染色法观察蛋白聚糖合成水平，Real-Time PCR法检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的mRNA表达，Western blot法检测SOX9的蛋白表达，乳酸脱氢酶法检测细胞毒性，流式细胞术检测细胞活性氧水平，β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。

结果与结论：①与对照组相比，模型组坏死脱落细胞比例增加，甲苯胺蓝染色变浅，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白表达水平下降(P < 0.05)；与模型组相比，补肾活血方含药血清可显著减轻细胞损伤并促进Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白表达(P < 0.05)，但无药血清组改善不明显(P > 0.05)；②与对照组相比，模型组细胞毒性、活性氧水平、细胞衰老水平显著增加；与模型组相比，补肾活血方干预后共培养体系微环境得到明显改善(P < 0.05)，无药血清对共培养体系微环境改善作用不明显(P > 0.05)；③结果表明，补肾活血方可以促进脂肪间充质干细胞存活、增殖、类髓核分化。

https://orcid.org/0009-0003-8944-6411(郭泽华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪间充质干细胞, 髓核细胞, 共培养, 椎间盘退变, 补肾活血方, 氧化损伤

Abstract: BACKGROUND: Stem cell transplantation is a new way to prevent and cure intervertebral disc degeneration. However, whether the transplanted stem cells can survive, proliferate, differentiate, and restore the function of nucleus pulposus cells after transplantation, is the key and difficult point to overcome.
OBJECTIVE: To explore the effects of Bushenhuoxue decoction on survival, proliferation, and nucleus pulposus-like differentiation of adipose-derived stem cells.
METHODS: A Transwell chamber was used to construct a co-culture model of human adipose-derived stem cells and human degenerative nucleus pulposus cells. The experiment was divided into control group, model group, drug-containing serum group, and drug-free serum group. Except for the control group, the co-culture system of other groups was treated with 50 μmol/L tert-butyl hydrogen peroxide for 24 hours. The drug-containing serum group and drug-free serum group were treated with DMEM low-glucose complete culture medium containing drug-containing serum of Bushenhuoxue decoction or drug-free serum with 20% volume fraction for 48 hours. The sublayer adipose-derived stem cells were taken. Toluidine blue staining was used to detect proteoglycan synthesis levels. Real-time PCR method was used to detect mRNA expression of type II collagen, proteoglycan and SRY-box transcription factor 9. The protein expression of SOX9 was detected by western blot assay. Lactate dehydrogenase assay was used to detect cytotoxicity. Flow cytometry was used to detect reactive oxygen species, and β-galactosidase staining was used to detect cell senescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the proportion of necrotic cells in the model group increased; toluidine blue staining became lighter, and the expression levels of type II collagen, proteoglycan, SOX9 mRNA and SOX9 protein decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the drug-containing serum of Bushenhuoxue decoction could significantly reduce cell injury and promote the expression of type II collagen, proteoglycan, SOX9 mRNA, and SOX9 protein (P < 0.05), but the improvement in the drug-free serum group was not significant (P > 0.05). (2) Compared with the control group, the contents of cytotoxicity, reactive oxygen species, and cell senescence in the model group were significantly increased. Compared with the model group, the microenvironment of the coculture system was significantly improved by drug-containing serum of Bushenhuoxue decoction (P < 0.05), while drug-free serum had no significant effect on the microenvironment of the co-culture system (P > 0.05). (3) The results show that Bushenhuoxue decoction can promote the survival, proliferation, and nucleus pulposus-like differentiation of adipose-derived stem cells.

Key words: adipose-derived stem cell, nucleus pulposus cell, co-culture, intervertebral disc degeneration, Bushenhuoxue decoction, oxidative damage

中图分类号:

郭泽华, 李兆勇, 陈龙, 段嘉豪, 蒋浩波, 陈光学, 苏友贤, 刘恩旭, 杨少锋. 补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3974-3980.

Guo Zehua, Li Zhaoyong, Chen Long, Duan Jiahao, Jiang Haobo, Chen Guangxue, Su Youxian, Liu Enxu, Yang Shaofeng. Action mechanism of Bushenhuoxue decoction on promoting nucleus pulposus-like differentiation of adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 3974-3980.

图/表（结果） 9

2.1 退变髓核细胞及ADSCs鉴定结果髓核细胞呈现多角形、短梭形等形态，见图1A；甲苯胺蓝染色将髓核细胞中蛋白聚糖染成蓝色，越靠近胞核处染色越深，见图1B。流式细胞术鉴定第2代ADSCs表面CD34阳性率为1.81%，CD45阳性率为1.02%，CD90阳性率为99.93%，CD105阳性率为97.78%，见图1C-G，符合间充质干细胞表面抗原的分布标准(CD90和CD105阳性率≥95%；CD34和CD45阳性
率≤2%)。

2.2 T-BHP浓度及补肾活血方含药血清体积分数筛选随着T-BHP浓度的增加，髓核细胞和ADSCs的细胞活力均显著下降(P < 0.05)，T-BHP干预髓核细胞的IC50为44.49 μmol/L，见图2A，B，T-BHP干预ADSCs的IC50为48.27 μmol/L，见图2D-E。当补肾活血方含药血清体积分数为20%时，髓核细胞的细胞活力最佳(P < 0.05)，见图2C，各体积分数补肾活血方含药血清对ADSCs的细胞活力无显著差异，见图2F。因此，最终选择50 μmol/L的T-BHP、体积分数20%补肾活血方含药血清进行后续实验。

2.3 各组ADSCs形态变化如图3所示，对照组ADSCs形态转变为多角形和短梭形，提示与髓核细胞共培养后，ADSCs的形态与类软骨样细胞逐渐接近。与对照组相比，经T-BHP干预后，模型组细胞明显皱缩，部分细胞死亡后脱落；与模型组相比，含药血清组的细胞形态明显改善，但无药血清组细胞形态改善不明显。

2.4 各组ADSCs甲苯胺蓝染色结果如图4所示，对照组细胞形态以多角形和短梭形为主，蛋白聚糖被染为蓝色，且越靠近细胞核染色越深，提示与髓核细胞共培养后，ADSCs可合成和分泌蛋白聚糖，表达类软骨细胞功能。与对照组相比，模型组细胞染色不明显；与模型组相比，经补肾活血方含药血清处理后，这一情况得到改善，但无药血清组改善不明显。

2.5 各组ADSCs中相关mRNA表达水平如图5所示，与对照组相比，模型组中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达显著降低 (P < 0.000 1)；与模型组相比，补肾活血方含药血清组可显著促进Ⅱ型胶原(P < 0.01)、蛋白聚糖(P < 0.000 1)、SOX9 (P < 0.000 1) mRNA表达，而无药血清干预后相关mRNA表达无明显改变 (P > 0.05)。

2.6 各组ADSCs中SOX9蛋白表达水平如图6所示，与对照组相比，模型组SOX9蛋白表达显著降低(P < 0.000 1)；与模型组相比，补肾活血方含药血清可显著促进SOX9蛋白表达(P < 0.05)，而无药血清干预后蛋白表达下降情况无明显改变(P > 0.05)。

2.7 各组ADSCs的细胞毒性、活性氧含量、细胞衰老检测结果如图7所示，与对照组相比，模型组乳酸脱氢酶释放量明显增加(P < 0.000 1)；与模型组相比，补肾活血方含药血清可显著抑制乳酸脱氢酶释放(P < 0.000 1)，但无药血清组与模型组乳酸脱氢酶释放量无明显差异(P > 0.05)。

流式细胞术结果显示，与对照组相比，模型组细胞内活性氧水平明显升高(P < 0.000 1)；与模型组相比，补肾活血方含药血清组活性氧水平显著下降(P < 0.000 1)，但无药血清组与模型组无明显差异(P > 0.05)，见图8。

衰老相关β-半乳糖苷酶染色结果表明，与对照组相比，模型组β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比显著增加；与模型组相比，补肾活血方含药血清组阳性细胞百分比显著降低，但无药血清处理后无明显改变，见图9。

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引言

腰椎间盘突出症为临床常见疾病，其发病率高，不仅严重影响患者的生活质量，而且造成了巨大的社会及医疗负担[1]。椎间盘退变是腰椎间盘突出症的主要病理基础之一[2]，与遗传、机械负荷、感染、营养、衰老、昼夜节律等因素有关，其典型表现为髓核细胞衰老和死亡增加，以及细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成减少[3-4]。椎间盘髓核组织主要由髓核细胞和细胞外基质组成，其中细胞外基质主要由髓核细胞合成和分泌，因此，髓核细胞数量减少、功能异常在椎间盘退变中发挥着重要的作用[5]。大量研究表明，椎间盘退变与氧化应激关系密切[6-8]。当氧化应激发生时，椎间盘内的活性氧生成、代谢失衡，活性氧过度堆积，使得细胞外基质的稳态被破坏，引起炎症反应，导致椎间盘细胞坏死凋亡[9]。临床对于椎间盘退变的治疗主要包括保守治疗及外科手术治疗，仅能减轻患者症状，而不是从根本上逆转椎间盘退变的病理改变[10]。干细胞疗法是椎间盘退变治疗领域的新思路[11]，其中脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)因来源丰富、易于获取、无免疫排斥等优势成为干细胞移植种子细胞的理想选择[12]。与髓核细胞共培养后，ADSCs的细胞形态和基因表达水平均出现明显改变，表现出类髓核分化效应[13]，但移植后的干细胞如何顺利存活、增殖、分化，并恢复髓核细胞功能，从而更有利于延缓椎间盘退变，是干细胞移植治疗椎间盘退变亟需克服的难点[14]。
中医学将椎间盘退变归属于腰痛病或痹证范畴，人至中年，元气渐衰、五脏不荣是腰痛病的根本病因[15]；此外，创伤、劳损形成血瘀实邪为常见诱因[16]，故肾气亏虚、脉络瘀阻是椎间盘退变的基本病机。补肾活血法是肾虚血瘀型椎间盘退变的基本治法，补肾活血中药可显著降低椎间盘源性腰痛患者的疼痛评分及复发率[17]。根据古方青娥丸加减而来的补肾活血方由杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙、木瓜组成，该方可通过Wnt信号通路促进髓核细胞增殖和细胞外基质合成[18]。
该实验拟在体外构建ADSCs和髓核细胞共培养氧化损伤模型，模拟体内退变椎间盘内微环境，并用补肾活血方含药血清进行干预，研究补肾活血方促进ADSCs存活、增殖、类髓核分化及恢复髓核细胞功能的作用，以期为临床治疗椎间盘退变提供新思路及实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞共培养实验。实验数据满足正态性分布和方差齐性，用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD检验；不满足正态性分布和方差齐性，采用Wilcoxon秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2023-02-01/05-30在湖南中医药大学医学院血管生物学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级健康4-6周龄雄性SD大鼠10只，体质量200 g左右，由湖南中医药大学实验动物中心代购，质量合格证编号：ZS-202211220012。实验方案经湖南中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号为LLBH-202111250003。
1.3.2 实验试剂及仪器叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide，T-BHP)溶液、TESCA 缓冲液、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma)；0.25%胰蛋白酶溶液、特级胎牛血清、DMEM低糖培养基、PBS(武汉普诺赛)；CD34 antibody-PE、CD45 antibody-PE、CD90 antibody-PE、CD105 antibody-PE(赛默飞世尔)；CCK-8试剂盒、乳酸脱氢酶比色法测试盒(武汉伊莱瑞特)；Transwell细胞培养小室(孔径0.4 μm，美国康宁)；甲苯胺蓝染色液、胶原酶Ⅰ(北京索莱宝)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、10%SDS溶液、HRP山羊抗兔二抗(中国Abiowell)；SOX9一抗(美国Proteintech)；Trizol(美国Thermo)；mRNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪)；PCR引物由北京擎科设计合成；β-半乳糖苷酶染色试剂盒、活性氧试剂盒(碧云天)；荧光定量RCP仪(美国Thermo)；多功能酶标分析仪(深圳汇松)；台式冷冻离心机(湖南湘仪)；流式细胞仪(Beckman)；超净工作台(北京亚泰隆)。
1.4 方法
1.4.1 退变髓核细胞、ADSCs的提取及体外培养选取湖南中医药大学第一附属医院脊柱科收治的符合手术指征的腰椎间盘突出症患者1例，经患者知情同意，于术中摘取L4/5节段、Pfirrmann退变分级为Ⅲ级的髓核组织、皮下脂肪组织标本进行实验(研究经湖南中医药大学第一附属医院医学研究伦理委员会批准，伦理号HN-LL-KY-2022-033-01)。术中摘取髓核组织后，生理盐水清洗2遍以去除血迹，迅速将组织转移至实验室。在无菌工作台内，髓核组织经PBS充分漂洗后剪碎至1 mm3小块，在0.1%Ⅱ型胶原酶消化液中37 ℃消化60 min；消化液1 000 r/min离心5 min，用含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM低糖完全培养液重悬细胞。所得细胞充分混匀后接种于25 cm2常规细胞培养瓶，置于体积分数5% CO2、37 ℃培养箱培养，整个过程严格无菌操作。此后密切关注细胞生长情况，当细胞汇合至80%-90%时，消化进行传代培养。脂肪组织以0.2%Ⅰ型胶原酶消化液37 ℃消化30-45 min，余操作基本同髓核组织。选取第2，3代 ADSCs、髓核细胞进行后续实验。

1.4.2 补肾活血方含药血清、无药血清制备补肾活血方由杜仲15 g、补骨脂10 g、怀牛膝10 g、丹参12 g、威灵仙10 g、木瓜9 g组成，所用中药由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，蒸馏法浓缩药物至1.5 g/mL。采用随机数字表法将10只雄性SD大鼠随机分为补肾活血方组、对照组，每组5只。补肾活血方中药汤剂参考人体剂量(66 g/d)，并按人(60 kg)和大鼠(200 g)体表面积折算有效剂量，大鼠3倍有效剂量约为7.35 g/(kg·d)，故补肾活血方组大鼠灌胃补肾活血方2.8 mL/d，对照组大鼠灌胃生理盐水2.8 mL/d，每天分2次给药，共灌胃1周，末次给药1 h后，无菌条件下腹腔麻醉，经腹主动脉采血，4 ℃静置2 h后3 500 r/min离心20 min，取上层血清56 ℃灭活30 min，过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

1.4.3 CCK-8法检测细胞活性分别取对数期生长的髓核细胞、ADSCs，消化接种至96孔板，细胞浓度为5×107 L-1，每孔100 μL，根据T-BHP浓度(0，25，50，100，250，500 μmol/L)共设置6组，每组设置5个复孔，分别用T-BHP干预2种细胞24 h后加入CCK-8工作液，1-4 h后用酶标仪在450 nm波长处读数。
为了检测补肾活血方含药血清的最佳体积分数，分别将对数期生长的髓核细胞、ADSCs按上述方法接种至96孔板内，根据补肾活血方含药血清体积分数(0%，5%，10%，20%，30%，40%)共设置6组，每组设置5个复孔，分别用含药血清干预2种细胞48 h后加入CCK-8工作液，1-4 h后用酶标仪在450 nm波长处读数。
1.4.4 退变髓核细胞和ADSCs共培养体系的构建和实验分组采用孔径0.4 μm的Transwell小室建立细胞共培养体系，第3代髓核细胞置于Transwell上室，ADSCs置于Transwell下室。上室及下室均接种300 μL细胞，细胞浓度均为1.5×108 L-1，待上室及下室细胞均融合至80%-90%后(约48 h)，进一步给予相应处理。细胞分组如下：①对照组：正常共培养24 h，随后换液继续培养48 h；②模型组：加入含50 μmol/L T-BHP的DMEM低糖完全培养液同时处理上下室细胞24 h，随后更换DMEM低糖完全培养液培养48 h；③无药血清组：加入含50 μmol/L T-BHP的DMEM低糖完全培养液同时处理上下室细胞24 h，随后更换含体积分数20%无药血清(对照组大鼠血清)的DMEM低糖完全培养液干预48 h；④含药血清组：加入含50 μmol/L T-BHP的DMEM低糖完全培养液同时处理上下室细胞24 h，随后更换含体积分数20%补肾活血方含药血清(补肾活血方组大鼠血清)的DMEM低糖完全培养液干预48 h。各组细胞处理完毕后，取下层ADSCs进行检测。
1.4.5 甲苯胺蓝染色各组ADSCs处理结束后，弃上清液，PBS清洗2次，每次1 min；加入适量的甲苯胺蓝染色液染色5 min，加入等量蒸馏水轻轻吹打，静置15 min；蒸馏水清洗2次，每次30 s，最后加入适量蒸馏水完全浸没细胞，显微镜下观察。

1.4.6 RT-PCR法检测ADSCs中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达各组ADSCs处理结束后，收集细胞，使用Trizol法提取各组细胞的总RNA，按照反转录试剂盒将1 μg RNA反转录成cDNA，根据荧光定量PCR试剂盒扩增。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt算法计算各组ADSCs的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和SOX9 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

1.4.7 Western blot法检测ADSCs中SOX9蛋白表达各组ADSCs处理结束后，收集细胞，RIPA提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白样品浓度。每组取等质量蛋白上样，将蛋白于10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，一抗4 ℃孵育过夜，HRP山羊抗兔二抗室温孵育90 min，洗膜，ECL显色曝光。利用Image J软件分析条带灰度值。
1.4.8 比色法检测ADSCs的乳酸脱氢酶水平各组ADSCs处理结束后，取上清液，按照乳酸脱氢酶比色法测试盒说明书进行操作，最后使用酶标仪在450 nm处测量吸光度值，计算各组乳酸脱氢酶释放情况。
1.4.9 流式细胞术检测ADSCs内活性氧水平按照1∶1 000的比例用基础培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L，各组ADSCs处理结束后，去除细胞培养液，加入稀释好的DCFH-DA充分盖住细胞，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用基础培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，胰酶消化2 min，收集细胞，流式细胞仪检测细胞内活性氧水平。
1.4.10 染色法检测ADSCs中β-半乳糖苷酶水平各组ADSCs处理结束后，去除细胞培养液，PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min；吸除细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min；吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃细胞培养箱内孵育过夜，用保鲜膜封住6孔板防止蒸发，普通光学显微镜下观察并拍照。
1.5 主要观察指标 ①不同浓度T-BHP对髓核细胞和ADSCs活力的影响，不同体积分数补肾活血方含药血清对髓核细胞和ADSCs活力的影响；②各干预组ADSCs形态变化、甲苯胺蓝染色结果；③各干预组ADSCs中SOX9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达水平以及SOX9的蛋白表达水平；④各干预组ADSCs中乳酸脱氢酶、活性氧、β-半乳糖苷酶水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件分析数据，并使用GraphPad Prism 8制作统计图。实验数据满足正态性分布和方差齐性，用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD检验；不满足正态性分布和方差齐性，采用Wilcoxon秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经湖南中医药大学第一附属医院生物统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变作为人类直立行走的代价之一，其发生发展严重影响着患者的生活质量。中医药治疗椎间盘退变类疾病具有经济实惠、不良反应小、患者接受程度高、临床疗效较好等优势。在一项对气滞血瘀型腰椎间盘突出症患者的临床疗效观察中，相比单纯口服西药，中药能更有效地减轻患者腰腿酸痛、腰部板硬、局部压痛等症状，且能更好地改善患者腰部功能[19]。赵旭涛等[20]研究表明，寒湿痹阻型腰椎间盘突出症患者口服中药结合中药熏洗后，与单纯服用非类固醇类抗炎药相比，C-反应蛋白以及肿瘤坏死因子α、目测类比评分均显著下降，JOA评分上升，提示中药治疗可抑制机体炎症反应，具有较好的临床疗效。中医将椎间盘退变归属于“腰痛病” “痹证”范畴，中医有关该病记载较多，疼痛是其重要临床症状。《素问·脉要精微论》有云：“腰者肾之府，转摇不能，肾将惫矣。”《诸病源候论》有云：“肾气不足，受风邪之所为也，劳伤则肾虚，虚则受于风冷，风冷与正气交争，故腰脚痛。”可见该病发生与肝肾不足、机体虚弱密切相关，不荣则痛。此外，《素问·痹论》记载：“衡络之脉，令人腰痛不可俯仰，仰则恐仆，得之举重伤腰。”《诸病源候论·腰痛不得挽仰候》记载：“劳损于肾，动伤经络，又为风冷所侵，血气搏击，故腰痛也。”《景岳全书·腰痛》记载:“跌仆伤而腰痛者，此伤在筋骨而血脉凝滞。”外伤劳损形成瘀血实邪，血瘀而不通，不通则痛。总之，椎间盘退变疾病多属本虚标实，其中肾脏虚损、无以濡养是内因，外伤、劳损致血瘀则为外因，故肾虚血瘀为本病病机，补肾活血为其基本治法[21]。补肾活血方根据《太平惠民和剂局方》中的青娥丸化裁而来，该方由杜仲15 g、补骨脂10 g、怀牛膝10 g、丹参12 g、威灵仙10 g、木瓜9 g组成，全方补肾强骨以治本，活血通络以治标。前期研究表明，补肾活血方通过Wnt信号通路调节髓核细胞增殖和细胞外基质重塑以缓解椎间盘退变的发展[18]。此次研究通过在体外构建退变髓核细胞和ADSCs共培养氧化损伤模型，模拟体内退变椎间盘内微环境，旨在进一步探索和发掘补肾活血方联合ADSCs治疗椎间盘退变的作用机制，为中医药联合干细胞移植在临床中治疗椎间盘退变提供实验依据。
椎间盘组织中的胶原主要为Ⅰ型和Ⅱ型胶原，其中绝大部分为Ⅱ型胶原，当椎间盘发生退变时，细胞外基质合成代谢减弱，分解代谢增强，表现为Ⅰ型胶原比例增加、Ⅱ型胶原比例下降，同时蛋白聚糖含量显著减少，细胞外基质慢性过度分解，导致髓核吸收承受外力的功能下降而易于损伤[22]。髓核细胞作为椎间盘的主要细胞之一，在维持椎间盘完整性和稳定性方面发挥了重要的作用，其坏死和凋亡均可导致椎间盘退变[23]。因此，恢复髓核细胞功能是修复受损椎间盘、抑制退变的有效治疗方法。通过甲苯胺蓝染色实验也证实了补肾活血方能促进共培养体系中ADSCs的蛋白聚糖表达。SOX9作为软骨细胞的重要调节因子[24]，影响着细胞内蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达[25]。当PI3K/Akt信号通路被激活时，大鼠髓核细胞内SOX9的表达增加，从而诱导大鼠髓核细胞中蛋白聚糖基因的表达水平增加，而当PI3K/Akt信号通路被抑制时，SOX9表达和转录活性降低，导致蛋白聚糖表达水平下降[26]。SOX9还在间充质干细胞分化过程中发挥重要作用，SOX9能加速骨髓间充质干细胞的软骨分化和软骨细胞生长[27]，SOX9和转化生长因子β1联合作用可加速脐带间充质干细胞的软骨形成[28]。越来越多的研究发现，活性氧及氧化应激引起的椎间盘细胞损伤在椎间盘退变过程中扮演着重要角色[29-32]。当活性氧的产生及清除失衡时，活性氧在退变椎间盘中过量产生并累积导致氧化应激，此外，活性氧可作为信号分子激活炎症信号通路，从而导致髓核细胞衰老、死亡，最终加速椎间盘退变的发展[32-33]。近年来，干细胞移植治疗椎间盘退变越来越受到学者们的青睐[34]。ZHANG等[35]运用间充质干细胞和水凝胶联合注射治疗山羊中重度椎间盘退变，可改善椎间盘组织形态，恢复了近10%椎间盘高度。NORIEGA等[36]对24例保守治疗无效的慢性腰痛患者进行的一项随机对照试验，结果显示间充质干细胞治疗患者功能指标明显改善，42个月后随访发现间充质干细胞在改善椎间盘含水量、延缓椎间盘退变等方面远期疗效可靠。由于髓核组织内没有血管，显著降低了细胞移植后发生免疫反应的风
险[37]，来源于髓核、骨髓、脂肪、脐带、尿液的干细胞均被应用于干细胞防治椎间盘退变领域，其中ADSCs因来源丰富、易于获取、增殖能力强等特点，已然成为细胞移植的理想种子细胞[38]。研究发现，将ADSCs联合抗氧化剂注入到小鼠椎间盘后，细胞增殖活性显著增加，细胞外基质Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9表达上调，小鼠椎间盘退变得到明显改善[39]。但移植后的ADSCs必须面对氧化应激损伤、炎症反应、pH值降低、过度机械负荷和代谢紊乱等恶劣微环境[40]，其移植后如何长期存活、增殖分化、恢复髓核细胞功能等问题，制约了干细胞的应用。
研究结果显示，ADSCs和髓核细胞体外共培养之后，ADSCs形态逐渐转变为短梭形或多角形，细胞开始表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA和SOX9蛋白，提示ADSCs表现出类髓核分化的趋势。使用T-BHP干预后，Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的mRNA表达和SOX9的蛋白表达被抑制，乳酸脱氢酶、活性氧的释放和β-半乳糖苷酶阳性细胞百分比增多，提示共培养体系中细胞通过释放乳酸脱氢酶和活性氧发生细胞氧化损伤。在使用补肾活血方含药血清干预后，ADSCs中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9的mRNA表达水平和SOX9的蛋白表达水平显著上升，ADSCs表现出类髓核分化趋势，ADSCs的乳酸脱氢酶和活性氧释放量显著降低，减缓细胞衰老和死亡。
综上所述，经与髓核细胞共培养之后，ADSCs开始表现出类髓核分化趋势，补肾活血方可以促进ADSCs存活、增殖、类髓核分化，为中医药协同干细胞治疗椎间盘退变提供一定的实验基础。然而，此次研究仍存在一定的局限性，包括未能对补肾活血方减轻共培养体系氧化损伤是否具有时间依赖性进行探索，也未对补肾活血方发挥作用的机制进行探讨，且缺乏动物实验模型验证，值得进一步深入研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

补肾活血方促进脂肪间充质干细胞类髓核分化的作用机制

Action mechanism of Bushenhuoxue decoction on promoting nucleus pulposus-like differentiation of adipose-derived stem cells

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