低氧和氧化应激对不同来源间充质干细胞旁分泌的差异性影响

doi:10.12307/2024.140

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 3024-3030.doi: 10.12307/2024.140

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

低氧和氧化应激对不同来源间充质干细胞旁分泌的差异性影响

潘筱颖1，2，许永德3，刘志强4，邢晓雯4，杨勇2

1长春中医药大学，吉林省长春市 130117；2长春中医药大学附属医院泌尿外科，吉林省长春市 130021；3首都医科大学附属北京友谊医院，北京市 100000；4军事科学院军事医学科学院，北京市 100000

收稿日期:2023-02-22 接受日期:2023-04-14 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-26
通讯作者: 杨勇，博士研究生，主任医师，长春中医药大学附属医院泌尿外科，吉林省长春市 130021 邢晓雯，军事科学院军事医学科学院，北京市 100000
作者简介:潘筱颖，女，1990年生，安徽省无为县人，汉族，2013年北京中医药大学东方学院毕业，主治医师，主要从事干细胞研究、泌尿外科疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(8197051689)，项目负责人：刘志强

Differential effects of hypoxia and oxidative stress on paracrine of mesenchymal stem cells from different sources

Pan Xiaoying1, 2, Xu Yongde3, Liu Zhiqiang4, Xing Xiaowen4, Yang Yong2

1Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China; 2Department of Urology, Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130021, Jilin Province, China; 3Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100000, China; 4Institute of Military Medicine, Academy of Military Sciences, Beijing 100000, China

Received:2023-02-22 Accepted:2023-04-14 Online:2024-07-08 Published:2023-09-26
Contact: Yang Yong, Doctoral candidate, Chief physician, Department of Urology, Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130021, Jilin Province, China Xing Xiaowen, Institute of Military Medicine, Academy of Military Sciences, Beijing 100000, China
About author:Pan Xiaoying, Attending physician, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, Jilin Province, China; Department of Urology, Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130021, Jilin Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 8197051689 (to LZQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

氧化应激：是指体内氧化与抗氧化失衡的一种状态，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量活性氧，直接损伤细胞。

旁分泌功能：是指干细胞表达、分泌、合成的多种生物活性分子对靶细胞产生的生物学作用，是调节微环境稳态和应答外界不良刺激的重要机制。

背景：间充质干细胞的生物学行为受所处生存微环境的影响，微环境条件预处理是调控间充质干细胞功能的重要手段。

目的：对比氧化应激和低氧条件下脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞旁分泌功能的差异，为治疗不同疾病选择适当的间充质干细胞预处理方式提供理论依据。
方法：培养脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞，分别加入不同浓度的H2O2或不同体积分数的O2干预，检测细胞形态、增殖、活力和旁分泌因子表达。
结果与结论：①普通培养环境下，脐带间充质干细胞中脑源性神经营养因子和转化生长因子β的表达水平显著高于脂肪间充质干细胞，而脂肪间充质干细胞中基质细胞衍生因子1α和肿瘤坏死因子刺激因子6的表达水平显著高于脐带间充质干细胞；②中低浓度水

平(≤100 μmol/L)H2O2对2种间充质干细胞活力的影响无显著差异，但H2O2浓度从50 μmol/L增至100 μmol/L使脐带间充质干细胞中血管内皮生长因子表达水平显著增高，脂肪间充质干细胞中碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1α和白细胞介素10表达水平均显著升高；③体积分数1% O2促进2种间充质干细胞增殖；体积分数1% O2干预24 h后，2种间充质干细胞中基因表达水平均有升高，但脂肪间充质干细胞中血管内皮生长因子、白细胞介素10和肿瘤坏死因子刺激因子6的表达水平显著高于脐带间充质干细胞；④结果提示：低氧和氧化应激预处理可提高间充质干细胞旁分泌功能，但2种间充质干细胞对低氧和氧化应激的响应不同，治疗疾病可选择适合的间充质干细胞预处理方式进一步提升其治疗潜力。

https://orcid.org/0009-0003-9786-6715 (潘筱颖)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脐带间充质干细胞, 脂肪间充质干细胞, 旁分泌, 氧化应激, 低氧

Abstract: BACKGROUND: The biological behavior of mesenchymal stem cells is influenced by the survival microenvironment. Pre-treatment of the microenvironment is an important means of regulating the function of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To compare the differences in paracrine function of umbilical cord mesenchymal stem cells and adipose mesenchymal stem cells under oxidative stress and hypoxia, and to provide a theoretical basis for selecting appropriate pretreatment of mesenchymal stem cells to treat different diseases.
METHODS: Umbilical cord mesenchymal stem cells and adipose mesenchymal stem cells were cultured by H2O2 or O2 oxygen, respectively, and cell morphology, proliferation, viability and paracrine factor expression were examined.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression levels of brain-derived neurotrophic factor and transforming growth factor-β were higher in umbilical cord mesenchymal stem cells than in adipose mesenchymal stem cells under a normal culture environment, while the expressions of stromal cell-derived factor-1α and tumor necrosis factor stimulating factor-6 in the adipose mesenchymal stem cells were significantly higher than those in the umbilical cord mesenchymal stem cells. (2) There was no significant difference in the effect of low and moderate levels (≤ 100 μmol/L) of H2O2 on the viability of the two mesenchymal stem cells. However, increasing the H2O2 concentration from 50 μmol/L to 100 μmol/L resulted in a distinct increase in vascular endothelial growth factor expression in umbilical cord mesenchymal stem cells. The expression of basic fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, stromal cell-derived factor-1α and interleukin-10 in adipose mesenchymal stem cells was greatly increased by increasing H2O2 concentration in this range. (3) 1% O2 hypoxia promoted mesenchymal stem cell proliferation. After 24 hours of culture in 1% O2, gene expression levels were elevated in both mesenchymal stem cells, but the expression levels of vascular endothelial growth factor, interleukin-10 and tumor necrosis factor stimulating factor-6 were significantly higher in adipose mesenchymal stem cells than in umbilical cord mesenchymal stem cells. (4) It is concluded that hypoxia and oxidative stress preconditioning enhances the paracrine function of mesenchymal stem cells. However, mesenchymal stem cells respond differently to hypoxia and oxidative stress. Treating diseases can choose suitable mesenchymal stem cells for appropriate pretreatment to further enhance their therapeutic potential.

Key words: umbilical cord mesenchymal stem cell, adipose mesenchymal stem cell, paracrine, oxidative stress, hypoxia

中图分类号:

潘筱颖, 许永德, 刘志强, 邢晓雯, 杨勇. 低氧和氧化应激对不同来源间充质干细胞旁分泌的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3024-3030.

Pan Xiaoying, Xu Yongde, Liu Zhiqiang, Xing Xiaowen, Yang Yong. Differential effects of hypoxia and oxidative stress on paracrine of mesenchymal stem cells from different sources[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 3024-3030.

图/表（结果） 8

2.1 细胞形态学鉴定结果正常培养48 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞形态，图1可见脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞均贴壁生长，成纤维细胞样，大小均一，细胞形态基本相同，多呈纺锤形或不规则三角形，平行排列或漩涡状生长。但脐带间充质干细胞体积明显更大，是脂肪干细胞的3倍左右。

2.2 表面标志物鉴定结果流式检测第3-5代脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞的表面标志物，结果显示：脐带间充质干细胞的表面抗原CD90和CD73阳性率为96.5%，98.2%，CD31和CD45阳性率仅为0.63%，4.1%，见图2A；脂肪间充质干细胞的表面抗原CD90和CD73阳性率为95.3%，98.6%，CD31和CD45阳性率仅为0.7%，0.75%，见图2B。2种间充质干细胞在免疫表型上无明显差异。

2.3 蛋白分泌量的差异酶联免疫吸附实验检测正常培养3 d的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞培养液中BDNF、VEGF、SDF-1α、IL-10和TGF-β蛋白分泌量。图3结果显示，VEGF和IL-10的分泌量两组无明显差异(P > 0.05)，BDNF、SDF-1α和TGF-β的分泌量两组差异极为显著(P < 0.001)，脐带间充质干细胞分泌的BDNF和TGF-β更多，而脂肪间充质干细胞分泌的SDF-1α更多。与IL-10和VEGF相比，脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞培养液中BDNF、SDF-1α和TGF-β蛋白分泌量更高。

2.4 基因表达量的差异比较正常培养3 d的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的基因表达差异，发现两者均表达bFGF、VEGF、BDNF、SDF-1α、IL-10和TSG-6，见图4。脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞在bFGF、VEGF、SDF-1α和IL-10表达上均无明显差异(P > 0.05)。脐带间充质干细胞BDNF的表达(4.482±2.093)是脂肪间充质干细胞(1.001±0.150)的4倍左右，但TSG-6的表达(0.052±0.039)仅为脂肪间充质干细胞(1.008±0.187)的1/20。

2.5 氧化应激条件对脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞的影响
2.5.1 不同浓度H2O2对细胞活力的影响为了比较H2O2对间充质干细胞活力的影响，以不加H2O2的细胞为对照，在细胞内加入不同浓度H2O2处理24 h后，CCK-8检测细胞活力，发现H2O2降低了间充质干细胞活力，见图5。但在≤100 μmol/L中低浓度范围内，H2O2对间充质干细胞活力影响较小；50-100 μmol/L中浓度范围内，2种间充质干细胞活力均高于60%，而且中低浓度时，2种间充质干细胞活力没有明显差异(P > 0.05)。> 100 μmol/L的高浓度H2O2对间充质干细胞毒性较大，尤其是对脐带间充质干细胞毒性较大，200 μmol/L浓度时脐带间充质干细胞活力仅为27%左右。

2.5.2 不同浓度H2O2对基因表达的影响 H2O2可以提高间充质干细胞中bFGF、VEGF、BDNF、SDF-1α、IL-10和TSG-6的表达水平，见图6。但H2O2浓度由50 μmol/L升高至100 μmol/L，脐带间充质干细胞中bFGF、BDNF、SDF-1α、IL-10和TSG-6的表达都没有明显变化(P > 0.05)，只有VEGF的表达升高(P < 0.001)，脂肪间充质干细胞中BDNF、VEGF、TSG-6的表达都没有明显变化(P > 0.05)，脂肪间充质干细胞中bFGF、IL-10和SDF-1α的表达升高(P < 0.01)。当H2O2浓度为50 μmol/L时，脐带间充质干细胞中bFGF升高约1.7倍，但脂肪间充质干细胞中bFGF表达降低；而且脐间充质干细胞中IL-10表达升高约4倍，但脂肪间充质干细胞中IL-10表达仅升高约1.3倍。当H2O2浓度为100 μmol/L时，脐带间充质干细胞中bFGF和SDF-1α的表达与50 μmol/L浓度时基本一致，但脂肪间充质干细胞中bFGF升高约3倍，SDF-1α升高4倍多。

2.6 低氧对脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞的影响
2.6.1 低氧对2种间充质干细胞增殖的影响图7结果显示，与体积分数21%O2培养相比，体积分数1%O2培养促进2种间充质干细胞增殖。脂肪间充质干细胞在培养12 h后增殖水平显著提升(P < 0.001)，但脐带间充质干细胞在培养24 h后差异明显(P < 0.001)。在低氧培养48 h后，脐带间充质干细胞的增殖速度显著高于脂肪间充质干细胞(P < 0.001)。

2.6.2 低氧对2种间充质干细胞基因表达的影响与体积分数21%O2培养24 h相比较，体积分数1%O2培养24 h后，2种间充质干细胞中bFGF、VEGF、BDNG、SDF-1α、IL-10和TSG-6的基因表达水平均有升高，见图8，其中bFGF的表达均提高2倍左右，BDNF和SDF-1α的表达均提高1.5倍左右。但脂肪间充质干细胞中VEGF、IL-10和TSG-6的表达升高更显著(P < 0.001)，分别升高约9倍、4倍和3倍。

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引言

间充质干细胞是一类起源于中胚层的成体干细胞，可以从不同组织中分离得到，如骨髓[1]、脂肪[2]、脐带[3]、牙髓等[4]，都具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为脂肪细胞、神经细胞、软骨细胞、肌肉细胞、骨细胞等[5]。由于脐带间充质干细胞来源于新生儿废弃的脐带，脂肪间充质干细胞多数来源于抽脂术后废弃的脂肪，相较于其他组织来源的间充质干细胞，取材容易、增殖迅速、低免疫原性、无严重伦理问题，更有临床前景。早期研究认为间充质干细胞的损伤修复机制可能是移植细胞分化产生的新细胞代替受损细胞，但干细胞在移植后无法长期存活[6-8]。近年越来越多的研究表明干细胞旁分泌功能可能在组织修复再生中起关键作用[9-10]。目前国内外多项动物实验已证明脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞可以通过分泌多种旁分泌因子治疗糖尿病[11]、阿尔茨海默症[12]、骨性关节炎[13]、脊髓损伤等[14]。脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞具有强大的旁分泌功能，能够表达、合成、分泌多种生物活性因子，不仅可以通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1等调节细胞增殖、迁移、分化[15-16]，还可以通过白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子刺激因子6(tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6)等免疫因子调节代谢、炎症和细胞凋亡[17-18]，还可以通过干细胞因子、基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α，SDF-1α)等因子影响干细胞归巢，调节靶组织的功能与修复[19]。但不同组织来源间充质干细胞的旁分泌功能仍有较大差异[20]。培养微环境对间充质干细胞的旁分泌功能也有显著影响[21]，通过调节培养条件可以获得具有优异功能的间充质干细胞。氧气体积分数是影响间充质干细胞的一个重要因素，正常体外培养间充质干细胞的氧气体积分数远高于体内氧气体积分数。低氧微环境促使间充质干细胞高表达低氧诱导因子，激活抗凋亡基因，上调趋化因子受体，增强间充质干细胞的归巢能力[22]。低氧培养可以减缓间充质干细胞衰老，促进多种生长因子表达[23]。体内移植治疗时受损组织还会伴随炎症、缺血、高糖等复杂病理微环境，产生大量活性氧，使损伤区域处于氧化应激状态，严重影响干细胞移植后的存活率和旁分泌功能。但较低浓度的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)可激活间充质干细胞旁分泌更多细胞因子，参与损伤区域的修复。因此，比较不同来源间充质干细胞在正常培养、低氧培养和氧化应激时旁分泌功能的差异具有重要意义。
该实验将系统比较脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在细胞形态学、免疫表型、蛋白和基因表达上的差异，并建立氧化应激模型和低氧模型，比较两种细胞在不同微环境下的细胞活力、基因表达和蛋白表达变化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计间充质干细胞形态观察和旁分泌功能对比实验。
1.2 时间及地点 2021年10月至2022年9月在军事科学院军事医学研究院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞脐带间充质干细胞(货号HUXUC-01001)和脂肪间充质干细胞(货号HUXMD-01001)购自赛业(广州)生物科技有限公司，由军事科学院军事医学研究院冻存传代培养。
1.3.2 实验试剂 DMEM低糖培养基、DMEM/F12培养基(美国Gibco)；胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶消化液(美国Biological Industries)；bFGF、VEGF、BDNF的ELISA试剂盒(美国BioLegend)；CD31-FITC、CD45-APC、CD73-PE、CD90-APC(美国Bioscience)；CCK-8(北京碧云天)；H2O2(中国国药集团)；反转录试剂盒(北京全式金生物)；qPCR试剂盒(北京GenStar)。
1.3.3 实验仪器细胞培养箱(美国Thermo Scientific)；低氧培养箱(中国华仪宁创)；倒置荧光显微镜(日本Nikon)；台式冷冻离心机(德国Eppendorf)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson)；多功能酶标仪(瑞士TECAN)；分光光度计(德国IMPLEN)；普通PCR仪(美国Bio-rad)；荧光定量PCR仪(美国Angilent Technologies)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养脐带间充质干细胞的培养条件为含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养基，而脂肪间充质干细胞的培养条件为含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM低糖培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，两三天更换1次培养基，细胞长至80%-90%融合时，0.25%胰酶消化，以1∶3的比例传代培养。
1.4.2 表面标志物检测收集生长状态良好的第3-5代脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞，0.25%胰酶消化离心后，PBS洗2次，细胞计数后将细胞悬液移至EP管中，每管细胞数为106个，5%BSA封闭15 min，在EP管中分别加入5 μL的CD31、CD45、CD90、CD73抗体，冰上避光孵育30 min，1 500 r/min离心5 min，PBS重悬后移至流式管中，流式细胞仪上机检测。

1.4.3 酶联免疫吸附实验将10代以内的脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞正常培养3 d后，收集细胞培养液。参照试剂盒说明操作，即用包被缓冲液将抗体稀释至10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃过夜后，洗涤液洗4次，每孔加200 μL检测稀释液A，500 r/min摇床孵育1 h，加洗涤液洗4次，每孔加100 μL标准品和样品，室温300 r/min摇床孵育2 h，洗涤液洗5次，每孔加100 μL的TMB底物溶液，避光孵育15 min，每孔加100 μL停止液停止反应。酶标仪上机检测450 nm处的吸光度值。

1.4.4 氧化应激模型选取生长状态良好的10代以内的脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞以2×104/孔的密度接种于6孔板，细胞完全贴壁后，分别加入终浓度为50，100 μmol/L的H2O2，在37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养24 h。以不加H2O2培养的细胞作为对照组。
1.4.5 低氧模型选取生长状态良好的10代以内的脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞以2×104/孔的密度接种于6孔板，细胞完全贴壁后，置于37 ℃、体积分数1%O2、体积分数5%CO2、体积分数94%N2的饱和湿度培养箱中培养24 h，以体积分数21%O2培养的细胞作为对照组。

1.4.6 RT-qPCR检测收集正常培养、预处理的脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞，加1 mL的Trizol裂解细胞10 min，再加200 μL三氯甲烷冰浴10 min，14 000 r/min离心15 min，吸取上清至新EP管，加1.5倍异丙醇颠倒混匀，室温静置10 min，14 000 r/min离心15 min，弃上清，加1 mL的体积分数75%乙醇，14 000 r/min离心15 min，弃乙醇，14 000 r/min空离15 min，晾干，加适量无菌无酶水，用分光光度计测量浓度后，取1 μg的RNA建立反转录体系，按反转录试剂盒的条件将RNA反转录为cDNA，将得到的cDNA用实时荧光定量PCR试剂盒检测mRNA水平，每个样品设3个复孔，反应条件为：95 ℃ 10 min以活化DNA酶，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40个循环为扩增和分析。以actin作为内参基因，2-ΔΔCT法计算目的基因的表达量。基因引物序列见表1。

1.4.7 氧化应激对细胞活力的影响选取生长状态良好的10代以内的脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞，0.25%胰酶消化离心后重悬计数，按1×108 L-1的细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，设3个复孔。待细胞完全贴壁，分别加入0，25，50，75，100，150，200 μmol/L的H2O2继续培养24 h，PBS洗2遍，更换含10%CCK-8试剂的培养基，继续培养2 h，酶标仪在450 nm处测定吸光度值。根据公式计算细胞活力(%)=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。
1.4.8 低氧对细胞活力的影响选取生长状态良好的10代以内的脐带间充质干细胞与脂肪间充质干细胞，0.25%胰酶消化离心后重悬计数，按1×108 L-1的细胞浓度接种于96孔板，每孔100 μL，设3个复孔。待细胞完全贴壁，再将细胞置于37 ℃、体积分数1%O2、5%CO2、94%N2的饱和湿度培养箱中培养0，12，24，48 h，以正常培养(37 ℃、体积分数5%CO2、21%O2)的细胞为对照，分别在相应时间点更换含10%CCK-8试剂的培养基，继续培养2 h，酶标仪在450 nm处测定吸光度值，根据1.4.7公式计算细胞活力。
1.5 主要观察指标细胞活力、蛋白分泌量、基因表达量。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行统计学分析及作图。实验数据用x±s表示。同一O2或H2O2浓度下两种细胞比较用t检验，同种细胞不同浓度O2或H2O2多组间比较用ANOVA检验，组间两两比较采用LSD法。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义，P < 0.001为差异有极显著性意义。文章统计学方法已经通过中国人民解放军军事科学院军事医学研究院统计学专家审核。

讨论

人脐带来源间充质干细胞和人脂肪来源间充质干细胞有相似的形态学特征、免疫表型以及基因和蛋白表达，但二者存在差异。在细胞形态方面，2种间充质干细胞虽然都呈纤维样贴壁生长，但人脐带间充质干细胞明显体积更大。细胞体积大小决定细胞器和细胞内的运输空间，影响细胞增殖、分化、凋亡等，一般来说，体积越大，细胞生物合成能力越强大，新陈代谢效率越高，分子运输效率也越高[24]。脐带间充质干细胞体积更大可能与其来源于脐带有关，它需要更高的运输效率来维持胎儿的生长发育。还有研究表明铺展面积较大的间充质干细胞成骨分化能力更强[25]，而体积更小的间充质干细胞更易保持干细胞的干性[26]，间充质干细胞在体外长期培养时体积增大代表细胞逐渐衰老[27]。
按国际细胞治疗学会的标准，间充质干细胞表达特征性表面抗原CD105、CD73、CD90，不表达CD45、CD31[28]，这与实验结果一致。但目前缺乏特征性的表面标志物区分来源不同的间充质干细胞[29]。
体外普通培养的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在旁分泌因子表达上存在差异。ELISA和RT-qPCR检测结果都显示脐带间充质干细胞分泌BDNF水平显著高于脂肪间充质干细胞。BDNF作为一种重要的神经营养因子，调节神经元增殖和分化[30]。高表达BDNF的脐带间充质干细胞可以治疗多种神经损伤性疾病[31-33]。脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞的VEGF、IL-10蛋白分泌量无明显差异，但脐带间充质干细胞分泌的TGF-β更多，脂肪间充质干细胞分泌的SDF-1α更多。TGF-β可以通过激活TGF-β/Smad通路加速间充质干细胞成骨分化[34]，促进骨组织再生[35]。TGF-β抑制或者促进炎症，这取决于是否存在白细胞介素6这样的促炎因子[36]。
SDF-1/CXCR4轴可以将干细胞按SDF-1浓度梯度募集至损伤区域[37-38]。因此，初步认为脂肪间充质干细胞更适合靶向治疗局部损伤，脐带间充质干细胞更适合局部给药治疗神经损伤或骨损伤。尾静脉注射近红外荧光探针标记的脂肪间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭疗效显著，体内追踪发现脂肪间充质干细胞向损伤的肝脏归巢[39]。局部注射脐带间充质干细胞修复脊髓损伤的效果显著高于静脉注射[40]。
体外培养环境和体内微环境存在巨大差异，且间充质干细胞的生物学行为受所处生存微环境的影响较大。体内组织中的氧气体积分数在3%-11%之间，显著低于传统体外培养时的氧气体积分数，且损伤组织的氧气体积分数比正常组织更低[41]。低氧会促使间充质干细胞激活HIF-1α，诱导SDF-1受体CXCR4和CXCR7高表达，从而提高体外靶向能力[42-43]。低氧刺激间充质干细胞旁分泌更多生长因子，增强组织修复能力[44]。因此该研究用体积分数1%O2模拟间充质干细胞在体内的低氧微环境，同样发现低氧不仅促进间充质干细胞增殖，还促使间充质干细胞中多种细胞因子表达上调，但不同间充质干细胞对低氧环境的响应并不相同。脂肪间充质干细胞中抗炎因子IL-10、TSG-6和生长因子VEGF的表达上调更显著。IL-10作为一种具有抗细胞凋亡特性的抗炎因子，提高间充质干细胞移植后的存活率[45]。TSG-6通过与趋化因子CXCL8直接作用抑制中性粒细胞迁移[46]，是影响间充质干细胞免疫调节特性的关键因素[47]。因此，低氧环境显著提升间充质干细胞的治疗潜力，低氧预处理脂肪间充质干细胞可以用来治疗各种炎性疾病和缺血性疾病。
氧化应激是指体内氧化和抗氧化失衡的状态。损伤区域炎症、缺血、缺氧等因素都会导致氧化应激状态[48]，释放过量活性氧，直接损伤蛋白质、核酸、脂质，致使细胞凋亡[49]。该研究用H2O2模拟氧化应激状态，发现H2O2浓度与间充质干细胞活性直接相关：中低浓度H2O2对间充质干细胞毒性较小，但高浓度H2O2对间充质干细胞毒性较大。利用低浓度H2O2预处理可以增强间充质干细胞抗氧化应激能力，提升移植后干细胞存活率 [50-51]。但这种适应性保护的具体机制尚不清楚，可能是由于H2O2浓度低时，低量活性氧激活细胞自身抗氧化机制；H2O2浓度高时，过量的活性氧激活细胞凋亡的信号通路 [52]。该研究发现H2O2可以提高间充质干细胞旁分泌因子表达，但2种间充质干细胞对50，100 μmol/L H2O2的响应不一致。随着H2O2浓度升高，脂肪间充质干细胞中的生长因子bFGF、炎症因子IL-10和趋化因子SDF-1α表达也升高，但脐带间充质干细胞中仅有VEGF表达升高。bFGF是一种具有血管生成和神经营养作用的多效因子[53-54]，过表达bFGF的脂肪间充质干细胞可以激活PI3K/Akt通路，促进微血管生成，减少内皮细胞凋亡 [55]。VEGF作为一种促血管生成因子，是运动神经元必需的营养因子[56]，还可与bFGF协同作用[57]，促进微血管生成和伤口愈合[58]。因此，体外50 μmol/L H2O2预处理脐带间充质干细胞或100 μmol/L H2O2预处理脂肪间充质干细胞都能更好地发挥旁分泌功能，治疗长期氧化应激引起的多种疾病，如心血管疾病、糖尿病、慢性炎症等。
正常培养时，脐带间充质干细胞中BDNF相对表达量显著高于脂肪间充质干细胞，而脂肪间充质干细胞中TSG-6相对表达量显著高于脐带间充质干细胞。50 μmol/L H2O2处理后，2种间充质干细胞中BDNF的上调倍数差异不明显，但H2O2处理后的脐带间充质干细胞中BDNF绝对表达量仍显著高于脂肪间充质干细胞；100 μmol/L H2O2处理后，2种间充质干细胞中TSG-6的上调倍数差异不明显，但H2O2处理后脂肪间充质干细胞中TSG-6绝对表达量仍显著高于脐带间充质干细胞。同样，体积分数1%O2处理后，脐带间充质干细胞中BDNF绝对表达量仍显著高于脂肪间充质干细胞。因此，脐带间充质干细胞可能更适合用于神经损伤修复或神经退行性疾病，脂肪间充质干细胞可能更适合用于炎性疾病或免疫性疾病。
正常培养的脐带间充质干细胞和脂肪间充质干细胞旁分泌功能相似，但仍存在差异。脐带间充质干细胞神经修复能力更强，而脂肪间充质干细胞靶向能力和免疫调节作用更强。这2种间充质干细胞进行H2O2和低氧预处理后，旁分泌因子表达均升高，但它们对H2O2和低氧2种微环境的响应有明显差异。脐带间充质干细胞对H2O2更敏感，50 μmol/L H2O2即可提升旁分泌因子表达，脂肪间充质干细胞则需要100 μmol/L H2O2预处理。因此，初步认为在治疗长期氧化应激引起的疾病时可以选择较低浓度的H2O2预处理脐带间充质干细胞或较高浓度的H2O2预处理脂肪间充质干细胞，增强间充质干细胞在损伤区域的治疗作用。脂肪间充质干细胞对低氧变化更敏感，可显著提升生长因子和抗炎因子的表达，初步认为低氧预处理的脂肪间充质干细胞可以用来治疗各种缺血性疾病和炎性疾病。
预处理可以进一步增强间充质干细胞的治疗潜力，因此，在应用2种间充质干细胞之前，可以针对性选择不同间充质干细胞进行H2O2或低氧预处理。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低氧和氧化应激对不同来源间充质干细胞旁分泌的差异性影响

Differential effects of hypoxia and oxidative stress on paracrine of mesenchymal stem cells from different sources

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