三维动静态培养软骨源性微组织的细胞行为及软骨形成能力

doi:10.12307/2024.191

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 4022-4026.doi: 10.12307/2024.191

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

三维动静态培养软骨源性微组织的细胞行为及软骨形成能力

刘伟1，2，蒋洪宇2，陈嘉杰2，高宇阳2，管延军2，贾志博2，焦颖1，华真1，蒋格涵2，何莹2，汪爱媛2，彭江2，亓建洪1

1山东第一医科大学(山东省医学科学院)运动医学与康复学院，山东省泰安市 271000；2解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所，北京市 100853

收稿日期:2023-07-18 接受日期:2023-08-16 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 亓建洪，博士，教授，山东第一医科大学(山东省医学科学院)运动医学与康复学院，山东省泰安市 271000 彭江，博士，研究员，解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所，北京市 100853
作者简介:刘伟，女，1996年生，山东省济宁市人，汉族，山东第一医科大学(山东省医学科学院)在读硕士，主要从事软骨损伤和组织工程修复研究。
基金资助:
国家重点研发计划课题(2022YFB3804303)，项目分课题负责人：汪爱媛

Behavior of cartilage-derived microtissue and ability of cartilage formation in three-dimensional dynamic and static culture conditions

Liu Wei1, 2, Jiang Hongyu2, Chen Jiajie2, Gao Yuyang2, Guan Yanjun2, Jia Zhibo2, Jiao Ying1, Hua Zhen1, Jiang Gehan2, He Ying2, Wang Aiyuan2, Peng Jiang2, Qi Jianhong1

1School of Sports Medicine and Rehabilitation, Shandong First Medical University (Shandong Academy of Medical Sciences), Tai’an 271000, Shandong Province, China; 2Institute of Orthopedics, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Received:2023-07-18 Accepted:2023-08-16 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Qi Jianhong, PhD, Professor, School of Sports Medicine and Rehabilitation, Shandong First Medical University (Shandong Academy of Medical Sciences), Tai’an 271000, Shandong Province, China Peng Jiang, PhD, Researcher, Institute of Orthopedics, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Liu Wei, Master candidate, School of Sports Medicine and Rehabilitation, Shandong First Medical University (Shandong Academy of Medical Sciences), Tai’an 271000, Shandong Province, China; Institute of Orthopedics, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
National Key Research and Development Project, No. 2022YFB3804303 (to WAY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

三维培养技术：已广泛应用于组织工程细胞及组织的培养，除通过低黏附孔板实现三维静态培养外，还可通过不同类型的生物反应器实现多种方式的三维动态培养。相比于二维平面培养，三维空间培养可以提供更多的营养物质并能很好地模拟生物体内微环境。
软骨源性微组织：微组织是由一种或多种细胞类型组成的具有靶器官结构功能特性的微小细胞团块。由关节软骨经过脱细胞、物理粉碎和尺寸筛选等过程制备的软骨源性微载体结合细胞培养形成软骨源性微组织，具有良好的生物活性和成软骨能力。

背景：与传统二维培养相比，三维培养软骨微组织具有更大的优势，但仍需进一步探索更有利的三维培养方式。

目的：评价2种三维培养方式下微组织的细胞行为及促软骨形成能力。
方法：通过化学脱细胞方法和组织粉碎方法制备软骨源性微载体，采用DNA定量和核染色验证脱细胞是否成功，通过组织学染色观察脱细胞前后基质保留情况，采用扫描电子显微镜和CCK-8方法对微载体进行表征；通过三维静态培养法和三维动态培养法将软骨源性微载体与人脂肪间充质干细胞结合构建软骨源性微组织，利用扫描电子显微镜、活死染色、RT-qPCR等手段检测两组微组织的细胞活力及成软骨能力。

结果与结论：①成功制备软骨源性微载体，与脱细胞前相比，脱细胞后DNA含量显著降低(P < 0.001)；扫描电子显微镜观察微载体表面有胶原包绕，保持天然软骨细胞外基质特征；CCK-8法检测表明微载体无细胞毒性且能够促进细胞增殖；②扫描电子显微镜及活死染色结果显示，相比三维静态组，三维动态组微组织细胞具有更舒展的形态，细胞与细胞间、细胞与基质间、基质与基质间形成广泛的连接；③RT-qPCR结果表明两组微组织SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达在培养7 d或14 d时均增高；14 d时三维动态组各基因相对表达量均显著高于三维静态组(P < 0.05)；21 d时三维静态组各基因表达均显著高于三维动态组(P < 0.001)；④结果表明，与三维静态培养微组织相比，三维动态培养微组织可在更短时间实现软骨相关基因的高表达，显示出更好的细胞活性和成软骨能力。

https://orcid.org/0009-0003-8006-3668 (刘伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 关节软骨损伤, 组织工程, 人脂肪间充质干细胞, 微组织, 三维动态培养

Abstract: BACKGROUND: Compared with traditional two-dimensional culture, three-dimensional microtissue culture can show greater advantages. However, more favorable cultivation methods in three-dimensional culture still need to be further explored.
OBJECTIVE: To evaluate the cell behavior of microtissue and its ability to promote cartilage formation under two three-dimensional culture methods.
METHODS: Cartilage-derived microcarriers were prepared by chemical decellularization and tissue crushing. DNA quantification and nuclear staining were used to verify the success of decellularization, and histological staining was used to observe the matrix retention before and after decellularization. The microcarriers were characterized by scanning electron microscopy and CCK-8 assay. Cartilage-derived microtissues were constructed by combining cartilage-derived microcarriers with human adipose mesenchymal stem cells through three-dimensional static culture and three-dimensional dynamic culture methods. The cell viability and chondrogenic ability of the two groups of microtissues were detected by scanning electron microscopy, live and dead staining, and RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cartilage-derived microcarriers were successfully prepared. Compared with before decellularization, the DNA content significantly decreased after decellularization (P < 0.001). Scanning electron microscope observation showed that the surface of the microcarrier was surrounded by collagen, maintaining the characteristics of the natural extracellular matrix of cartilage cells. CCK-8 assay indicated that microcarriers had no cytotoxicity and could promote cell proliferation. (2) Scanning electron microscopy and live and dead staining results showed that compared with the three-dimensional static group, the three-dimensional dynamic group had a more extended morphology of microtissue cells, and extensive connections between cells and cells, between cells and matrix, and between matrix. (3) The results of RT-qPCR showed that the expressions of SOX9, proteoglycan, and type II collagen in microtissues of both groups were increased at 7 or 14 days. The relative expression levels of each gene in the three-dimensional dynamic group were significantly higher than those in the three-dimensional static group at 14 days (P < 0.05). At 21 days, the three-dimensional static group had significantly higher gene expression compared with the three-diomensional dynamic group (P < 0.001). (4) The results showed that compared with three-dimensional static culture microtissue, three-dimensional dynamic culture microtissue could achieve higher expression of chondrogen-related genes in a shorter time, showing better cell viability and chondrogenic ability.

Key words: articular cartilage injury, tissue engineering, human adipose mesenchymal stem cell, microtissue, three-dimensional dynamic culture

中图分类号:

刘伟, 蒋洪宇, 陈嘉杰, 高宇阳, 管延军, 贾志博, 焦颖, 华真, 蒋格涵, 何莹, 汪爱媛, 彭江, 亓建洪. 三维动静态培养软骨源性微组织的细胞行为及软骨形成能力[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4022-4026.

Liu Wei, Jiang Hongyu, Chen Jiajie, Gao Yuyang, Guan Yanjun, Jia Zhibo, Jiao Ying, Hua Zhen, Jiang Gehan, He Ying, Wang Aiyuan, Peng Jiang, Qi Jianhong. Behavior of cartilage-derived microtissue and ability of cartilage formation in three-dimensional dynamic and static culture conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 4022-4026.

图/表（结果） 6

2.1 软骨脱细胞前后DNA含量及基质保留情况软骨片脱细胞处理后，细胞成分被去除，DNA定量检测显示与脱细胞前相比，脱细胞后DNA含量显著降低(P < 0.001)，见图1A。DAPI染色可见脱细胞后几乎无细胞核蓝色荧光，见图1B。通过苏木精-伊红染色、阿尔新蓝染色、番红O染色分别对脱细胞前后软骨形态和基质进行观察，发现脱细胞后核成分明显减少，细胞外基质成分得以很好的保留，见图1C-E。

2.2 软骨源性微载体微观形貌观察扫描电镜显示微载体表面大量胶原纤维包绕，脱细胞处理留下大量孔隙结构，见图2。

2.3 软骨源性微载体细胞毒性实验 CCK-8结果显示，与空白对照组相比，在第1，3，5天时软骨源性微载体浸提液处理组未表现出细胞毒性，且表达更明显的促增殖作用(P < 0.01)，见图3。

2.4 两组软骨源性微组织的形貌比较两组微组织在光镜下显示出不同的表观形貌，培养3 d时，三维静态组微组织聚合成球，表面细胞包裹；三维动态组微组织与微组织相互聚合，光镜下可观察到微载体结构，见图4A。两组微组织扫描电镜下显示出不同的微观形貌，培养3 d时，三维静态微组织表面细胞紧密连接，梭形细胞形态不明显，微组织表面有死细胞或代谢产物等粘贴表面；三维动态微组织表面细胞形态可清晰辨认并得到很好的舒展，细胞与细胞间、细胞与基质间已建立广泛连接，见图4B。

2.5 两组软骨源性微组织的活死染色结果两组微组织Live/Dead 染色结果显示，脂肪间充质干细胞均可黏附在微载体表面。三维动态微组织细胞形态舒展，呈梭状或星状贴附于微载体表面；而三维静态微组织细胞不呈现明显形态。两组微组织表面细胞均匀大量分布，第1，3，5天的死细胞数量均较少，三维动态微组织组表现出更显著的细胞与基质间连接，并能观察到明显的微组织与微组织间相互融合的状态，见图5。

2.6 两组软骨源性微组织的qRT-PCR检测结果两组微组织诱导分化过程中均在7，14，21 d时间点高表达SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因，见图6。分化培养7 d时，三维静态组微组织SOX9、蛋白聚糖基因明显高表达于三维动态组(P < 0.001)；分化培养14 d时，三维动态组微组织SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因均表达最高，显著高于三维静态组(P < 0.05)；分化培养21 d时，三维静态组微组织各基因表达高于三维动态组(P < 0.001)。

参考文献

[1] KWON H, BROWN WE, LEE CA, et al. Surgical and tissue engineering strategies for articular cartilage and meniscus repair. Nat Rev Rheumatol. 2019;15(9):550-570.
[2] CHEN FH, ROUSCHE KT, TUAN RS. Technology Insight: adult stem cells in cartilage regeneration and tissue engineering. Nat Clin Pract Rheumatol. 2006;2(7):373-382.
[3] GRACEFFA V, VINATIER C, GUICHEUX J, et al. Chasing Chimeras - The elusive stable chondrogenic phenotype. Biomaterials. 2019;192:199-225.
[4] CAMP CL, STUART MJ, KRYCH AJ. Current concepts of articular cartilage restoration techniques in the knee. Sports Health. 2014;6(3):265-273.
[5] KUANG B, YANG Y, LIN H. Infiltration and In-Tissue Polymerization of Photocross-Linked Hydrogel for Effective Fixation of Implants into Cartilage-An In Vitro Study. ACS Omega. 2019;4(20):18540-18544.
[6] BUNPETCH V, ZHANG ZY, ZHANG X, et al. Strategies for MSC expansion and MSC-based microtissue for bone regeneration. Biomaterials. 2019;196:67-79.
[7] BARTHOLD JE, MARTIN BM, SRIDHAR SL, et al. Recellularization and Integration of Dense Extracellular Matrix by Percolation of Tissue Microparticles. Adv Funct Mater. 2021;31(35):2103355.
[8] SCHWARZ S, KOERBER L, ELSAESSER AF, et al. Decellularized cartilage matrix as a novel biomatrix for cartilage tissue-engineering applications. Tissue Eng Part A. 2012;18(21-22):2195-2209.
[9] ZHOU S, ZHANG S, JIANG Q. Extracellular Matrix-based Materials for Bone Regeneration// Racing for the Surface. Cham: Springer, 2020:489-533.
[10] JENSEN C, TENG Y. Is It Time to Start Transitioning From 2D to 3D Cell Culture? Front Mol Biosci. 2020;7:33.
[11] CHEN R, FENG T, CHENG S, et al. Evaluating the defect targeting effects and osteogenesis promoting capacity of exosomes from 2D-and 3D-cultured human adipose-derived stem cells. Nano Today. 2023;49:101789.
[12] WANG S, YANG L, CAI B, et al. Injectable hybrid inorganic nanoscaffold as rapid stem cell assembly template for cartilage repair. Natl Sci Rev. 2022;9(4):nwac037.
[13] AGRAWAL P, PRAMANIK K, BISWAS A, et al. In vitro cartilage construct generation from silk fibroin- chitosan porous scaffold and umbilical cord blood derived human mesenchymal stem cells in dynamic culture condition. J Biomed Mater Res A. 2018;106(2):397-407.
[14] SULAIMAN S, CHOWDHURY SR, FAUZI MB, et al. 3D Culture of MSCs on a Gelatin Microsphere in a Dynamic Culture System Enhances Chondrogenesis. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2688.
[15] WANG B, LIU W, LI JJ, et al. A low dose cell therapy system for treating osteoarthritis: In vivo study and in vitro mechanistic investigations. Bioact Mater. 2021;7:478-490.
[16] KUDVA AK, DIKINA AD, LUYTEN FP, et al. Gelatin microspheres releasing transforming growth factor drive in vitro chondrogenesis of human periosteum derived cells in micromass culture. Acta Biomater. 2019;90:287-299.
[17] TANDON N, MAROLT D, CIMETTA E, et al. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnol Adv. 2013;31(7):1020-1031.
[18] YU H, YOU Z, YAN X, et al. TGase-Enhanced Microtissue Assembly in 3D-Printed-Template-Scaffold (3D-MAPS) for Large Tissue Defect Reparation. Adv Healthc Mater. 2020;9(18):e2000531.
[19] BUCKWALTER JA, MANKIN HJ. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instr Course Lect. 1998;47:477-486.
[20] MAČIULAITIS J, REKŠTYTĖ S, ŪSAS A, et al. Characterization of tissue engineered cartilage products: Recent developments in advanced therapy. Pharmacol Res. 2016;113(Pt B):823-832.
[21] ROJEK KO, ĆWIKLIŃSKA M, KUCZAK J, et al. Microfluidic Formulation of Topological Hydrogels for Microtissue Engineering. Chem Rev. 2022;122(22):16839-16909.
[22] NEGORO T, TAKAGAKI Y, OKURA H, et al. Trends in clinical trials for articular cartilage repair by cell therapy. NPJ Regen Med. 2018;3:17.
[23] KIM YS, MAJID M, MELCHIORRI AJ, et al. Applications of decellularized extracellular matrix in bone and cartilage tissue engineering. Bioeng Transl Med. 2018;4(1):83-95.
[24] ZHANG C, XIE B, ZOU Y, et al. Zero-dimensional, one-dimensional, two-dimensional and three-dimensional biomaterials for cell fate regulation. Adv Drug Deliv Rev. 2018;132:33-56.
[25] YIN X, MEAD BE, SAFAEE H, et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 2016;18(1):25-38.
[26] QIAN X, JACOB F, SONG MM, et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nat Protoc. 2018;13(3):565-580.
[27] SHANG F, YU Y, LIU S, et al. Advancing application of mesenchymal stem cell-based bone tissue regeneration. Bioact Mater. 2020;6(3):666-683.
[28] SWARTZ MA, FLEURY ME. Interstitial flow and its effects in soft tissues. Annu Rev Biomed Eng. 2007;9:229-256.
[29] ZHU J, YANG S, QI Y, et al. Stem cell-homing hydrogel-based miR-29b-5p delivery promotes cartilage regeneration by suppressing senescence in an osteoarthritis rat model. Sci Adv. 2022;8(13):eabk0011.
[30] HODGKINSON T, KELLY DC, CURTIN CM, et al. Mechanosignalling in cartilage: an emerging target for the treatment of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2022;18(2):67-84.
[31] SANI M, HOSSEINIE R, LATIFI M, et al. Engineered artificial articular cartilage made of decellularized extracellular matrix by mechanical and IGF-1 stimulation. Biomater Adv. 2022;139:213019.
[32] DING SL, ZHAO XY, XIONG W, et al. Cartilage Lacuna-Inspired Microcarriers Drive Hyaline Neocartilage Regeneration. Adv Mater. 2023;35(30):e2212114.

引言

关节软骨损伤的有效修复一直是骨科临床亟待解决的难题。目前，临床上根据损伤的程度、时间及患者年龄等因素，考虑通过关节腔注射镇痛类药物、干细胞移植治疗、组织工程支架植入及关节置换等多种处理方式修复软骨损伤[1-2]，但修复软骨的再生组织类型、机械性能及整合能力均存在不同程度的限制[3]，如自体软骨细胞植入后常产生纤维软骨替代物，与透明软骨相比其机械性能较差[4]；部分组织工程支架植入后与天然软骨组织的生物力学性质不匹配，在负重时易导致应力集中，从而影响支架构成的新软骨与周围天然软骨的整合并损伤周围组织[5]。随着组织工程技术的发展，关节软骨修复技术中微组织的应用逐渐发挥着重要的作用，将微组织组装成理想的结构，植入后可以建立细胞连接和有效的物质交换，有利于细胞增殖、分化和功能表型的维持[6]。为模拟软骨特异性基质，脱细胞软骨构建软骨源性微组织可以支持间充质干细胞的软骨发生[7-9]，并且能够为种子细胞提供早期的修复微环境及适当的力学性能，是微组织中具有潜力的来源之一。
与传统二维微组织培养相比，三维微组织培养表现出更大的优势。二维环境中培养忽略了微组织中细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用，获取时需要物理分离贴壁层从而产生了不必要的机械损伤。而在三维培养过程中，可以更好地模拟组织样微环境并维持间充质干细胞的潜能[10]，微组织内氧气和营养流动增加，细胞-细胞和细胞-基质相互作用增加[11]，这对软骨的形成和再生至关重要[12]，因此探索更有利于促进微组织软骨形成的三维培养方式对改进微组织培养策略及提高修复效果有重要意义。目前的研究中，三维培养方式主要包括复合聚合物支架培养[13]、微球静态培养[14]、生物反应器动态培养等方式[15-16]，其中微球静态培养可获取高密度的细胞聚集体，对于软骨再生发挥重要作用[16]，而生物反应器动态培养中搅拌旋转式生物反应器是最具成本效益的生物处理系统之一[15]，它可以有效增加营养供应并稀释代谢物[17]，已显示出细胞增殖和细胞外基质合成速率的增加[18]。该实验将利用软骨源性微载体负载人源脂肪间充质干细胞构建软骨源性微组织，对比微球静态培养、搅拌旋转式生物反应器动态培养方式对软骨形成的影响，以寻求一种有希望的方法进一步改善微组织修复效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备表征及体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年6月在解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料人脂肪间充质干细胞(赛业生物科技有限公司)；TypleExpress(Gibco，美国)；磷酸盐缓冲液(CORNING，美国)；MSCM培养基(ScienceCell，美国；人脂肪间充质干细胞成软骨诱导培养基(赛业，美国)；组织研磨机(QIAGEN，Tissue Lyserll)；酶标仪(BioTek，EPOCH TAKE3)；体式显微镜(Nikon，SMZ25)；生物旋转反应器(华龛，FTUS 16-01)。
1.4 实验方法
1.4.1 软骨源性微载体的制备市场获取新鲜猪膝关节，无菌环境下打开膝关节腔，手术刀获取股骨滑车处透明软骨片，PBS清洗3次。使用0.1 mmol/L Tris-HCl在37 ℃下处理软骨片12 h，然后使用1% SDS在37 ℃下处理48 h，最后PBS清洗3次去除残留的DNA酶。通过组织粉碎机粉碎去细胞软骨片，过筛获取直径为150-300 μm的微载体，60Co消毒后4 ℃下保存。
1.4.2 去细胞软骨DNA残留和基质保留评价通过DNA定量及DAPI染色检测脱细胞效果。取脱细胞前后软骨片，PBS清洗3遍，按照DNA提取试剂盒及酶标仪于520 nm波长处检测样本吸光度值，通过绘制增殖曲线计算DNA含量。脱细胞前后软骨冰冻切片后固定，加适量DAPI染液，避光下染色12 min后PBS清洗3遍，镜下观察。脱细胞前后软骨冰冻切片常规固定后，按照苏木精-伊红染色、阿尔新蓝染色、番红O染色试剂盒说明进行操作，镜下观察脱细胞前后的基质保留情况。
1.4.3 软骨源性微载体的形貌和毒性实验取适量微载体，PBS清洗3次，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水后临界点干燥，真空喷溅铂金离子，利用扫描电子显微镜观察微载体的表面形态。取60Co消毒后的微载体与含体积分数5%血清的MSCM完全培养基按照0.2 g/mL的质量浓度进行浸泡，置于37 ℃条件下浸泡72 h，收集浸提液。将人脂肪间充质干细胞以每孔3×103个的细胞密度接种于96孔板中，各孔加MSCM完全培养基100 μL，培养1 d后，实验组培养基更换为浸提液，空白对照组继续使用MSCM完全培养基培养，分别在培养1，3，5 d进行CCK-8实验，使用酶标仪于450 nm波长处检测样本吸光度值，评估其细胞毒性。
1.4.4 不同三维培养方式的软骨源性微组织构建将人脂肪间充质干细胞消化计数后种在低黏附96孔板(3×103细胞/孔)及低黏附6孔板(4×105细胞/孔)中，设置2×104细胞/mg微载体浓度。三维静态培养组于低黏附96孔板中使用MSCM完全培养基静态培养3 d，然后参照说明书使用OriCell®人脂肪间充质干细胞成软骨诱导培养基静态培养21 d，隔天半换液。三维动态培养组于低黏附6孔板中使用MSCM完全培养基动态培养3 d，然后使用OriCell®人脂肪间充质干细胞成软骨诱导培养基动态培养21 d，隔天半换液。三维动态培养组中生物旋转反应器运转阶段包括负载细胞阶段及扩增分化阶段，负载细胞阶段运转模式为20 r/min运行1 min，0 r/min运行30 min为1个循环，共进行48个循环；扩增分化阶段运转模式为40 r/min。
两组均在不同取材时间停止微组织诱导及设备运行。
1.4.5 细胞的微观形貌 2种培养方式的微组织培养3 d后，PBS清洗3次，2.5%戊二醛固定2 h，梯度乙醇脱水后临界点干燥，真空喷溅铂金离子，利用扫描电子显微镜观察微组织的细胞微观形态和与微载体的贴附连接情况。
1.4.6 细胞活性实验利用细胞Live/Dead 染色评价微组织中细胞的活性。取培养 1，3，5 d的2种微组织，按照试剂盒说明书方法进行Live/Dead 染色，室温避光孵育20 min后，使用体式显微镜观察。

1.4.7 软骨形成相关基因检测取诱导培养0，7，14，21 d的2种软骨源性微组织，按照RNA 提取试剂盒说明书提取样本RNA，按照反转录试剂盒方法，采用20 μL体系进行反转录，将反转录所得cDNA 进行qRT-PCR，检测各组微组织成软骨相关基因表达。成软骨相关基因包括软骨特异性基因SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖。扩增反应条件为95 ℃预变性 30 s，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复 40个循环。目的基因表达水平使用同一样本 GAPDH内参基因标准化，用 2-ΔΔCt 法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标软骨源性微载体的评价及表征，2种不同培养方式培养的软骨源性微组织的细胞活性、形貌等细胞行为及成软骨能力。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0 进行统计学分析并绘图，计量资料以x±s表示，组间比较采用 t 检验或单因素方差分析 (ANOVA)，P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山东第一医科大学生物统计学专家审核。

讨论

关节软骨是一种无血管无神经的组织，自我修复和再生能力有限[19]，而软骨组织工程技术作为最有希望的有效再生关节软骨的技术之一[20]，已形成大批组织工程软骨产品。微组织是近年来组织工程技术的一个新的分支，通常是指种子细胞在细胞-细胞或细胞-细胞外基质作用下聚集形成的微小组织。与传统的细胞单层培养相比，细胞以特定的方式培养成三维微观结构，其微观结构与天然组织相似[21]。目前临床试验中使用的一个例子是Chondrospheres®，是由自体软骨细胞构建的直径为500-800 μm的球体[22]，在缺损处注射后可自然附着在软骨缺损处。Chondrosphere®已于2017年7月获得EMA的批准，并作为Spherox上市[22]。该实验所制备的2种微组织既具备天然软骨细胞外基质的成分，能够提供良好的细胞黏附[23]，同时又具有优良的生物活性及成软骨能力，为后期的临床转化提供了必要条件。
与三维静态培养相比，三维动态培养细胞和组织具有的优势主要表现在：①可使细胞具有建立仿生层次结构的能力，从而有助于更好地维持干性和活力[24]；②通过动态三维实现悬浮培养，从而提供了氧和营养物的扩散，支持三维组织的生长和扩
张[25]；③为细胞和组织提供更稳定的微环境，与体内生活环境更相似。YU等[18]将微组织在旋转生物反应器中动态培养，细胞增殖黏附能力及细胞外基质合成增强。WANG等[15]将细胞培养于三维明胶微球中，在搅拌式生物反应器培养下可促进早期软骨的形成及相关通路的激活。该研究三维动态组所使用的生物旋转反应器摒弃了以往生物反应器的大体积、不同空间仅能设置同一条件培养及体积较大导致的培养基使用成本过高等劣势[26]，通过小型设备、设置不同条件及较少培养基等特点实现了软骨源性微组织的三维动态培养，且相对于静态组操作更简单，有效减少了操作过程的污染。三维动态组微组织扫描电镜及Live/Dead 染色也显示出细胞能保持更好的活力，能够有效减少可能产生的坏死核心以及代谢产物不能及时排出等现象。
另外，成本有效和方便是实现临床转化的重要因素[27]，微组织在体外培养构建时间的长短也被考虑在动物体内实验及临床试验研究中，较短的体外培养构建时间有利于提高临床应用的效率和成本。而三维动态培养的微组织能够在培养14 d时实现软骨相关基因的最高表达，且高于三维静态微组织培养21 d时SOX9、Ⅱ型胶原基因的最高表达，即在培养14 d时收获三维动态培养微组织具有更明显的应用优势。
众所周知，大多数细胞存在于复杂的三维微环境中，其中存在的影响因素包括细胞间相互作用、细胞-细胞外基质相互作用、生化因素和流体流动诱导的剪切应力等[28]，适宜的微环境是提高修复效果的必要条件[29]。而维持细胞外基质沉积和重塑稳态平衡的重要组成部分是适当的机械力[30]，是微环境中不可或缺的因素之一。SANI等[31]在提供动态力学刺激的生物反应器中培养出高质量人工软骨，发现力学刺激对细胞活力和增殖没有不良影响，并促进了Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，产生更多排列的纤维。DING等[32]设计了具有机械转导条件的多孔微载体并在三维培养环境下重塑了细胞外基质，诱导了软骨微组织的再生。通过观察发现，该实验三维动态组培养环境中细胞间和细胞与基质间能够快速发生连接和聚合，这可能与三维动态组能够提供适当的机械力，形成更有利于修复软骨的微环境有关，动态培养过程中促进成软骨基因表达的机制还有待进一步验证。此外，该实验缺少进一步的体内验证，三维动态培养的微组织能否在体内形成关节软骨样透明软骨需要后续实验继续探索。
综上所述，该研究证实了通过三维动态培养的软骨源性微组织相比于三维静态培养具有更好的细胞活性，操作简单，能有效减少操作过程的污染，且促进软骨形成能力更好，在机械和生物效能2个维度提供了更适宜软骨再生的微环境，有望为实验及临床研究构建微组织提供更有效的方式，为深入研究修复软骨损伤的微组织奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

三维动静态培养软骨源性微组织的细胞行为及软骨形成能力

Behavior of cartilage-derived microtissue and ability of cartilage formation in three-dimensional dynamic and static culture conditions

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[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	陈凯佳, 刘景云, 曹宁, 孙建波, 周燕, 梅建国, 任强. 组织工程技术在股骨头坏死治疗中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1450-1456.
[3]	梅静怡, 刘江, 肖聪, 刘鹏, 周浩浩, 林展翼. 组织工程血管构建过程中平滑肌细胞增殖变化及代谢模式[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1043-1049.
[4]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[5]	陈小芳, 郑国爽, 李茂源, 于炜婷. 可注射海藻酸钠水凝胶的制备及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 789-794.
[6]	王嘉旎, 陈俊宇. 金属离子促血管生成机制及在骨组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 804-812.
[7]	沈子青, 夏天, 单一波, 朱睿君, 万昊鑫, 丁浩, 潘枢, 赵军. 负载外泌体水凝胶修饰3D打印支架构建血管化的气道替代物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 697-705.
[8]	朱礼威, 王江玥, 白丁. 纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在不同骨缺损环境中应用的价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 753-758.
[9]	杨雨晴, 陈志宇. 早期短暂M1巨噬细胞在骨组织工程中的作用及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 594-601.
[10]	孔祥宇, 王兴, 裴志伟, 常家乐, 李斯琴, 郝廷, 何万雄, 张葆鑫, 贾燕飞. 生物支架材料及打印技术修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 479-485.
[11]	徐静, 吕慧欣, 鲍鑫, 张逸, 王一涵, 周延民. 近红外光响应水凝胶在组织工程领域的应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 486-492.
[12]	谷明西, 王常成, 田丰德, 安宁, 郝瑞胡, 郭林. 丝素蛋白/明胶/壳聚糖三维多孔软骨组织支架的制备及体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 366-372.
[13]	王新民, 闫文凯, 宋亚辉, 刘飞. 自体富白细胞-血小板纤维蛋白凝胶与腘绳肌腱修复创伤性髌骨脱位[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 404-410.
[14]	毕玉杰, 马笃军, 彭力平, 周紫琼, 赵静, 朱厚均, 钟秋辉, 杨玉鑫. 中医药联合医用水凝胶治疗疾病的策略及意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 419-425.
[15]	王欣怡, 谢宪瑞, 陈玉杰, 王晓宇, 徐小青, 沈怿弘, 莫秀梅. 软组织和硬组织再生过程中的电纺纳米纤维支架[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 426-432.