环状RNA参与自身免疫性肝炎小鼠肝损伤的相关性分析

doi:10.12307/2024.271

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2152-2158.doi: 10.12307/2024.271

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环状RNA参与自身免疫性肝炎小鼠肝损伤的相关性分析

侯艺文，刘莹，李竹蓉，陈晨，李振城，刘杨

山西中医药大学基础医学院，山西省晋中市 030619

收稿日期:2023-01-31 接受日期:2023-03-12 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 刘杨，教授，山西中医药大学基础医学院，山西省晋中市 030619
作者简介:侯艺文，女，1997年生，安徽省宿州市人，汉族，硕士，主要从事自身免疫性肝炎的中西医结合治疗方面的研究。
基金资助:
风湿免疫性疾病中西医结合基础研究项目(2023XKJS-03)，项目参与人：刘杨；中西医结合防治风湿免疫病山西省科技创新人才重点团队项目(202204051002033)，项目参与人：刘杨；山西中医药大学科技创新项目(2022TD2003)，项目负责人：刘杨；山西省重点国别科技合作项目(202104041101013)，项目负责人：刘杨；山西省高等学校科技创新项目(2020L0423)，项目负责人：刘杨；山西中医药大学科技创新能力培育计划(2020PY-JC-07)，项目负责人：刘杨

Correlation analysis of circular RNAs involved in liver injury in mice with autoimmune hepatitis

Hou Yiwen, Liu Ying, Li Zhurong, Chen Chen, Li Zhencheng, Liu Yang

School of Basic Medical Sciences, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China

Received:2023-01-31 Accepted:2023-03-12 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Liu Yang, Professor, School of Basic Medical Sciences, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
About author:Hou Yiwen, Master, School of Basic Medical Sciences, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
Supported by:
Basic Research Program of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Rheumatic immune Diseases, No. 2023XKJS-03 (to LY [project participant]); Key Team Program of Shanxi Scientific and Technological Innovation Talents for Prevention of Integrated Chinese and Western Medicine, No. 202204051002033 (to LY [project participant]); Science and Technology Innovation Project of Shanxi University of Chinese Medicine, No. 2022TD2003 (to LY); Key Science and Technology Cooperation Project of Shanxi Province, No. 202104041101013 (to LY); Science and Technology Innovation Project of Higher Education Institutions in Shanxi Province, No. 2020L0423 (to LY); Science and Technology Innovation Capacity Cultivation Program of Shanxi University of Chinese Medicine, No. 2020PY-JC-07 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

环状RNA(CircRNAs)：是一种特殊的非编码RNA，广泛存在于不同的细胞中，有关CircRNAs的研究已成为RNA研究领域的一个新热点。与传统线性RNA不同，CircRNAs是通过反向剪接形成的闭合RNA分子，正是由于这种封闭的结构，CircRNAs能抵抗RNA酶的降解并在细胞质中稳定表达。
谷丙转氨酶和谷草转氨酶：谷丙转氨酶又称丙氨酸转氨酶，谷草转氨酶又称天门冬氨酸转氨酶，二者是反映肝脏功能的一项重要指标，主要存在于肝细胞中，当肝脏受到损伤以后，肝细胞膜受到破坏，转氨酶会从肝细胞内释放到血清，引起血清转氨酶升高。

背景：自身免疫性肝炎的发病机制尚未明确阐明，环状RNA(CircRNAs)是RNA领域的一个研究热点，参与了许多自身免疫性疾病的发病，但CircRNAs在自身免疫性肝炎中的作用尚不清楚。

目的：探讨CircRNAs与刀豆蛋白A诱导自身免疫性肝炎小鼠肝损伤的关系。
方法：对前期微阵列技术筛选出差异表达的CircRNAs谱进行生物信息学分析，包括基因本体论(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，探讨上述差异表达基因潜在的生物学功能。采用随机数字表法将12只C57BL/6小鼠分为正常组和模型组，每组6只，模型组通过尾静脉注射刀豆蛋白A建立自身免疫性肝炎模型，造模12 h后处死小鼠，提取小鼠肝脏及外周血，利用qRT-PCR技术验证部分CircRNAs的表达水平，通过比色法检测小鼠血清中肝损伤指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平，通过微孔板法检测小鼠肝脏中氧化应激指标丙二醛和NO的水平，并将肝损伤指标和氧化应激水平的相关性进行分析。

结果与结论：①GO分析结果显示，表达上调CircRNAs的靶基因参与的生物过程主要为“SNARE复合装配的调节”(P=0.004)等，分子功能主要为“金属离子结合”(P=0.000 29)等，主要富集在“CORVET 复合体”(P=0.075)等细胞组分；表达下调circRNAs的靶基因参与的生物过程主要为“胰液分泌的负调节”(P=0.000 42)等，分子功能主要为“转录激活因子活性”(P=0.025)等，主要富集在“膜外组分”(P=0.006)等细胞组分；②KEGG富集分析结果显示，表达上调CircRNAs的靶基因主要富集于“碱基切除修复”(P=0.026)等信号通路；③与正常组比较，模型组小鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶及肝组织中丙二醛和NO的水平升高(P < 0.01)，mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577的表达升高(P < 0.05)；④Spearman相关分析显示，mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577的表达与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、丙二醛、NO存在正相关关系；⑤结果显示，CircRNAs的差异表达与自身免疫性肝炎小鼠肝损伤过程具有相关性，其中mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577有望成为自身免疫性肝炎诊断的生物标志物及治疗靶点。

https://orcid.org/0000-0001-8422-2775(侯艺文)；https://orcid.org/0000-0002-6627-5002(刘杨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肝损伤, 自身免疫性肝炎, 刀豆蛋白A, 环状RNA(CircRNAs), 相关分析

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of autoimmune hepatitis has not been clearly elucidated. Circular RNA (CircRNA) is a research hotspot in the field of RNA and is involved in the pathogenesis of many autoimmune diseases. However, the role of CircRNA in autoimmune hepatitis remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the relationship between CircRNA (CircRNA) and concanavalin A induced liver injury in mice with autoimmune hepatitis.
METHODS: Bioinformatics analysis was performed on CircRNA profiles selected by previous microarray technology, including gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses, so as to explore the potential biological functions of these differentially expressed genes. Twelve C57BL/6 mice were randomized into normal group and model group (n=6 per group). Autoimmune hepatitis model was established by tail vein injection of concanavalin A in the model group. Mice were killed at 12 hours after modeling to extract mouse liver and peripheral blood. The expression levels of CircRNAs were verified by qRT-PCR. Serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels were detected by colorimetric method. The levels of oxidative stress indexes malondialdehyde and nitric oxide in mouse liver were detected by microplate method. The correlation between oxidative stress level and liver injury index was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of GO analysis showed that the target genes with up-regulated CircRNAs expression were mainly involved in the biological processes of SNARE complex assembly regulation (P=0.004), their molecular functions were mainly metal ion binding (P=0.000 29), and the cell components were mainly enriched in CORVET complex (P=0.075). The biological processes involved in the down-regulated circRNAs target genes were mainly “negative regulation of pancreatic secretion” (P=0.000 42), the molecular functions were mainly “transcriptional activator activity” (P=0.025), and the cell components were mainly enriched in “extracellular components” (P=0.006). KEGG results showed that the target genes with up-regulated CircRNAs expression were mainly enriched in the "base excision-repair" signaling pathways (P=0.026). Compared with the normal group, serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase levels and the levels of malondialdehyde and nitric oxide in mouse liver in the model group were significantly increased (P < 0.01). Compared with the normal group, the expression of two selected CircRNAs (mmu-circ-0001520 and mmu-circ-0001577) was increased in the model group (P < 0.05). Spearman correlation analysis showed that the expression of mmu-circ-0001520 and mmu-circ-0001577 was positively correlated with alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, malondialdehyde and nitric oxide. To conclude, the differential expression of CircRNAs is correlated with liver injury in autoimmune hepatitis mice. mmu-circ-0001520 and mmu-circ-0001577 are expected to be diagnostic biomarkers and therapeutic targets for autoimmune hepatitis.

Key words: liver injury, autoimmune hepatitis, concanavalin A, circular RNAs (CircRNAs), correlation analysis

中图分类号:

侯艺文, 刘莹, 李竹蓉, 陈晨, 李振城, 刘杨. 环状RNA参与自身免疫性肝炎小鼠肝损伤的相关性分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2152-2158.

Hou Yiwen, Liu Ying, Li Zhurong, Chen Chen, Li Zhencheng, Liu Yang. Correlation analysis of circular RNAs involved in liver injury in mice with autoimmune hepatitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2152-2158.

图/表（结果） 6

2.1 CircRNAs靶基因预测和GO富集根据P值从小到大排列，选择前30个GO条目绘制条形图，见图1。GO的富集结果显示，在P < 0.05时，差异表达的CircRNAs可以被阐释为140个GO条目，其中19项细胞组分、28项分子功能和93项生物过程；在错误发现率≤0.05的条件下，差异表达的CircRNAs可以被阐释为59个GO项。图中按P值的升序排列列出了每个类别的前10个GO项，表达上调CircRNAs的靶基因的生物过程主要为“SNARE复合装配的调节”等，分子功能主要为“金属离子结合”等，细胞组分主要为“CORVET 复合体”等；表达下调CircRNAs的靶基因的生物过程主要为“胰液分泌的负调节”等，分子功能主要为“转录激活因子活性”等，细胞组分主要为“膜外组分”等。

2.2 KEGG富集通路分析上调的CircRNAs靶基因共富集于19条信号通路，前18条路径以P值的升序排列，绘制得出气泡图，见图2。图中颜色越绿表示其富集意义越高。其中前3条路径依次为：“碱基切除修复”信号通路、“Hedgehog” 信号通路和“金黄色葡萄球菌感染”信号通路。

2.3 两组小鼠肝损伤指标检测结果氧化应激是急性肝损伤发生发展过程中的共同病理生理机制。肝损伤发生后，肝细胞功能受损可引起氧化应激；而持续或高强度的氧化应激将进一步增加肝细胞死亡的风险，进而导致肝脏疾病加重。实验结果显示，与正常组相比，模型组血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶及肝组织中丙二醛和NO的水平升高(P < 0.05)，见表2，结果表明刀豆蛋白A可以诱导氧化应激反应、引起肝损伤指标增加。

2.4 CircRNAs的qRT-PCR验证结果为了验证微阵列结果的可靠性，实验以|FC|≥2.0，P≤0.05为的阈值选择了差异表达最显著的2个CircRNAs，用qRT-PCR法进行扩增。结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肝组织中mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577相对表达水平均增加(P < 0.05)，见图3。qRT-PCR检测到的含量变化趋势与芯片筛选结果一致，说明微阵列筛选结果是可靠的，满足之后分析条件。

2.5 相关性分析结果将选取的CircRNAs(mmu-circ-0001520、mmu-circ-0001577)和肝损伤指标做相关分析，结果显示，mmu-circ-0001520与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、NO、丙二醛存在正相关关系，mmu-circ-0001577与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、NO、丙二醛存在正相关关系，见图4。

进一步的分析显示，mmu-circ-0001520与谷丙转氨酶(r=0.927，P=0.007)、谷草转氨酶(r=0.904，P=0.013)、NO(r=0.880，P=0.025)存在线性正相关关系；mmu-circ-0001577与谷草转氨酶(r=0.967，P=0.001)、NO(r=0.865，P=0.026)存在线性正相关关系。mmu-circ-0001577与丙二醛(r=0.807，P=0.052)，mmu-circ-0001520与谷丙转氨酶(r=0.807，P=0.052)、丙二醛(相关系数r=0.795，P=0.058)与其他指标的变化趋势也具有一致性，但没有显著的线性相关关系。

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引言

自身免疫性肝炎是自身免疫性肝病中的一种主要类型，表现为针对肝细胞自身免疫反应所介导的肝脏实质炎症，其血清学表现为自身抗体、免疫球蛋白G和血清转氨酶水平升高，组织学上表现为界面型肝炎和浆细胞浸润。自身免疫性肝炎的发病率和流行率在全球范围内呈上升趋势，男女比例约为1∶4[1-3]，其发病与遗传、环境因素及免疫耐受异常等有关。有研究表明，自身免疫性肝炎患者中有自身免疫性疾病家族史的占40%[4]；同时，遗传易感个体在环境因素的作用下会出现免疫反应的异常，进而导致自身免疫介导的肝细胞损伤。因为缺乏完善的治疗方案，自身免疫性肝炎通常会进展为肝硬化、肝衰竭，甚至导致死亡[5]。因此，明确自身免疫性肝炎的发病机制有助于研发新的治疗方案，从而提高患者的生活质量。然而到目前为止，自身免疫性肝炎的确切发病机制尚未被阐明。
环状RNA(Circular RNAs，CircRNAs)是一种特殊的非编码RNA，广泛存在于不同的细胞中。与传统线性RNA不同，CircRNAs是通过反向剪接形成的闭合RNA分子[6]，其独特的结构和对RNA衰变机制的抗性使得它成为很多疾病的潜在治疗靶标和生物标志物，有关CircRNAs的研究已经成为RNA领域的研究新热点。CircRNAs的研究多采用表达谱基因芯片技术来筛选差异表达的CircRNAs，在阐明不同疾病的发病机制中取得了重大进展，在肝病方面，有研究报道了CircRNAs与非酒精性脂肪性肝炎、肝癌及肝再生机制之间的关系[7]；在自身免疫性疾病方面，CircRNAs参与了系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等发病[8]。CircRNAs参与了免疫细胞的发育及免疫调节，在多种免疫性疾病中以组织特异性和发病机制相关方式表达，但CircRNAs的表达与自身免疫性肝炎的发生发展之间的关系尚未报道。
此次实验针对前期基因芯片筛查刀豆蛋白A诱导自身免疫性肝炎小鼠模型的肝脏差异表达CircRNAs进行功能分析和实验验证[9]，发现CircRNAs在自身免疫性肝炎发病中具有潜在作用，mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577与自身免疫性肝炎的发生发展密切相关，有望作为自身免疫性肝炎的防治新靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照分组动物实验，用t检验进行统计学分析，采用Spearman相关分析法计算差异表达基因表达与肝损伤的相关性。
1.2 时间及地点实验于2021年6-9月在山西中医药大学科研楼进行。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性C57BL/6小鼠12只，SPF级，6周龄，体质量(20±2) g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。小鼠在塑料笼子中常规饲养，6只/笼，12 h光照/暗循环，室温(23±2)℃、湿度(55±5)%。小鼠在实验室经1周适应性饲养后即可开始实验。实验经山西中医药大学伦理委员会批准(2019LL41)。
1.3.2 主要试剂刀豆蛋白A(批号：C8110.北京索莱宝科技股份有限公司)；UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(批号：B511321.生工生物)；谷草转氨酶(批号：C009-2-1)、谷丙转氨酶(批号：C010-2-1)、NO(批号：S0021S)和丙二醛(批号：A003-1-2)试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 CircRNAs靶基因预测和GO、KEGG富集通路分析课题组前期已使用微阵列杂交和数据分析技术对CircRNAs进行分析[9]。通过用安捷伦扫描仪完成对原始数据的扫描和基本分析，然后使用分位数算法对原始数据进行标准化，并对标准化数据进行过滤。通过对小鼠肝脏样品做标记、微阵列杂交和洗涤后以便进行后续分析。此次实验对前期实验中所获得的表达上调和表达下调的差异表达CircRNAs进行基因本体论(Gene Ontology，GO)的生物过程、分子功能、细胞组分富集分析和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析(P≤0.05)，对符合的项目进行筛选，根据富集基因的校正P值来排序，选取排名在前的数据采用Spearman相关分析法进行相关分析。

1.4.2 实验分组与动物模型的建立给予常规普通饲料适应性喂养1周后，采用随机数字表法将C57BL/6小鼠分为正常组和模型组，每组6只。模型组小鼠通过尾静脉注射刀豆蛋白A(15 mg/kg)建立自身免疫性肝炎模型，正常组小鼠尾静脉注射等量的生理盐水。造模12 h后，肝脏表面粗糙变硬且有点状及片状坏死，肝损伤指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性升高证明造模成功。造模12 h后摘除小鼠眼球取血，腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)后颈椎脱臼法处死全部小鼠，无菌条件下收集肝脏组织，放于-80 ℃冰箱备用。

1.4.3 部分差异表达的CircRNAs的验证

(1)qRT-PCR验证：以|FC|≥2.0，P≤0.05为阈值选择了差异表达最显著的2个CircRNAs，通过qRT-PCR技术进行验证。RNA抽提操作步骤详见 UNIQ-10 柱式 Trizol 总RNA抽提试剂盒。反转录cDNA第一链合成，RNA按照1 500 ng反转。将稀释10倍的cDNA样品作为模板上机进行荧光定量PCR检测。反转录反应条件：37 ℃×15 min，1个循环；85 ℃×5 s，1个循环。取2 μL反转录产物与Real-time PCR 试剂盒相关试剂混合后进行PCR扩增，反应条件：95 ℃×30 s，1个循环；95 ℃×5 s，60 ℃×34 s，40个循环。根据检测结果，采用2-ΔΔCt相对定量计算公式计算出各样品目的基因的相对表达量。qRT-PCR引物序列由生工生物工程股份有限公司合成，如表1所示。

(2)肝损伤指标的验证：肝损伤程度通过谷丙转氨酶、谷草转氨酶、NO，丙二醛等指标来反映。分别取小鼠肝组织及血清，血清离心后取上清测转氨酶指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶，然后将小鼠肝组织与生理盐水混合研磨为10%组织匀浆，检测氧化应激指标NO与丙二醛。
转氨酶水平测定：小鼠外周血采集后静置30 min，1 000×g离心15 min后收集血清；随后在96孔板测定孔内依次加入已经提前预热的基质液20 μL，取各实验小鼠血清5 μL与之混合，对照孔依次加入预热的基质液20 μL，轻轻混匀，将96孔板置于37 ℃培养箱孵育30 min；取出96孔板，各实验孔均加入2，4-二硝基苯肼20 μL，混匀后在37 ℃培养箱孵育20 min；取出96孔测定板，各测定孔分别依次加入0.4 mol/L NaOH溶液200 μL，轻轻振荡混匀，室温条件下静置15 min以终止反应，用酶标仪在510 nm波长下测得各实验孔的吸光度值。根据公式，查标准曲线，得出各小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平。
丙二醛水平测定：取小鼠肝组织，生理盐水清洗，滤纸吸干；将组织剪成小块放入离心管并加入裂解液，冰上裂解40 min，期间将组织超声破碎；裂解后的组织在4 ℃条件下14 000 r/min离心15 min，离心后吸取上清待测；用BCA法检测蛋白浓度；稀释并制备10%肝组织匀浆，并按照试剂盒说明书往离心管里加样；离心管旋涡混匀后，95 ℃水浴40 min；取出离心管流水冷却，4 000 r/min离心10 min；取96孔测定板，取上清0.2 mL种板，在波长532 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值；根据公式计算丙二醛水平。
NO浓度测定：首先制备10%肝组织匀浆，然后取出NO检测试剂盒，使其恢复到室温；将10%肝组织匀浆离心，取上清50 μL加入96孔板；随后根据说明书依次加入试剂一50 μL和加入试剂二50 μL，使用酶标仪540 nm测吸光度值，并根据标准品曲线计算出肝组织中NO的浓度。
(3)相关分析：将2个差异表达的CircRNAs(mmu-circ-0001520、mmu-circ-0001577)和肝损伤指标做相关分析。
1.5 主要观察指标两组小鼠CircRNAs的表达水平，血清中肝损伤指标谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平，肝脏中氧化应激指标丙二醛和NO的水平，以及肝损伤指标和氧化应激水平的相关性。
1.6 统计学分析用SPSS 25.0统计软件对实验数据进行统计与分析，用独立样本t检验来分析差异表达的CircRNAs及肝损伤指标，所得数据以x±s形式表示。用Spearman相关分析法计算差异表达基因的表达与肝损伤的相关性。P < 0.05时差异有显著性意义。该文统计学方法已经刘杨专家审核。

讨论

自身免疫性肝炎是一种针对肝细胞的自身免疫反应所介导的肝脏实质炎症，是导致肝纤维化的重要原因之一，若不及时治疗可导致肝硬化甚至肝衰竭[10]。自身免疫性肝炎在全球范围内均有发病，以欧美国家的女性为主，近年来在中国的发病率有逐年增加的趋势[11]，主流学术观点认为遗传、后天环境、自身免疫及宿主易感性等因素共同参与了其发病过程，机制可能是T细胞功能的失衡，诱发机体自身免疫攻击，产生肝脏炎症坏死[12-15]。然而，有关自身免疫性肝炎的发病机制一直未被明确阐明。
CircRNAs是一种含有共价闭环的非编码RNA，5ʹ端无帽子结构，3ʹ端无多聚腺苷酸尾部，CircRNAs参与了免疫细胞的发育及免疫调节的多个阶段，通过调控DNA甲基化、免疫反应和炎症反应等多种生物学过程，在多种自身免疫性疾病的发生发展中取得了诸多成果[16-18]。CircRNAs不仅可以作为诊断人类自身免疫性疾病的生物标志物，还可以代表疾病的活动性或严重程度[19]。近年来，由于高通量RNA测序和生物信息学分析的快速发展，CircRNAs在阐明许多免疫性疾病和肝病的发病机制上均取得了重大进展，但CircRNAs在自身免疫性肝炎中的作用鲜有报道，因此，通过研究CircRNAs与自身免疫性肝炎的发生发展的关系，有利于推进自身免疫性肝炎发病机制的研究进程。circRNAs还可以通过充当miRNA海绵来调节许多生物过程[20]，课题组前期研究发现自身免疫性肝炎的发病机制可能与MMU_CIRC_0001520/MMU-miR-193B-3p/MAPK 10轴有关[9]。此次实验发现，自身免疫性肝炎的发病过程复杂，差异表达的CircRNAs参与了自身免疫性肝炎的发病机制。
与其他类型的肝炎相比，自身免疫性肝炎的研究进展相对缓慢。1992年，TIEGS等[21]使用刀豆蛋白A建立了T细胞介导的小鼠急性肝损伤模型，这是一种典型的和公认的用于研究自身免疫性肝炎小鼠模型，该模型的建立推进了自身免疫性肝炎的基础研究。此次实验采用刀豆蛋白A诱导的肝损伤模型，共发现了27种差异表达的CircRNAs，并用qRT-PCR技术对所选择的2个CircRNAs(mmu-circ-0001520、mmu-circ-0001577)的结果进行验证。为了进一步研究这些差异表达的CircRNAs在自身免疫性肝炎中的调节作用，实验对结果进行了GO和KEGG分析。GO的富集结果显示，在P < 0.05时，上调的差异表达基因的调节过程主要与“金属离子结合”有关。金属失衡可引起氧化应激反应，氧化应激反应参与了自身免疫性肝炎的病理过程，因此，保持微量金属离子稳态在自身免疫性肝炎等炎症疾病的治疗中起着关键作用。有研究指出，自身免疫性肝炎患者血清中的铁离子浓度比正常人低，细胞内的铁螯合剂可以降低RNA的氧化损伤，延长肝炎患者的生命周期[22]。一些多酚类抗氧化剂如槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯具有结合活性金属(如铁和铜)的能力，它们可以通过结合铁或铜渗透到肝细胞，调节细胞内金属水平，进而对病毒的复制产生影响。因此，利用具有抗氧化能力的分子，以线粒体为靶点，或能够通过结合金属减轻炎症感染，可以作为自身免疫性肝炎金标准疗法的补充。下调的CircRNAs参与的生物过程主要有“钠离子跨膜转运蛋白活性的负调控”，它反映出T细胞介导自身免疫性疾病早期的显著活动[23]，这些靶点与“膜外成分”等关系密切，并且具备“转录激活因子活性”等功能。一些转录激活因子如STAT 3在肝脏炎症和免疫反应中起着重要作用，并在小鼠模型中得到证实[24]，其中，生物过程中的“细胞分化”和“细胞内蛋白质转运”与不止一个差异表达的CircRNAs相关，在自身免疫性肝炎的发生中有着重要作用[25]。蛋白质运输的正常部署对激活上游和下游重要信号通路方面具有潜在的作用，包括细胞增殖分化、炎症蛋白合成、细胞迁移和基因表达调控等，从更广泛的意义上讲，所有这些信号网络构成了细胞功能的微调平衡，这种平衡的失调会对细胞功能产生不良的影响，有可能导致疾病的进展[26]。此外，“RNA 结合”和“相同的蛋白质结合”也与一些差异表达的CircRNAs调控密切相关。RNA结合蛋白(RBPs)是控制CircRNAs生物学(剪接、稳定性等)的重要转录调节因子，CircRNAs的主要功能机制也包括调控基因剪接或转录、翻译、与蛋白质相互作用等[27]。KEGG富集结果揭示了某些上调的关键信号通路可能与自身免疫性肝炎有重要联系。KEGG富集结果提示，碱基切除修复信号通路与Hedgehog信号通路可能与自身免疫性肝炎有重要联系。有研究发现，碱基切除修复蛋白之间的相互作用可预测肝病患者的总生存期[28]。非酒精性脂肪病疾病后期发展与自身免疫性肝炎相似，可导致纤维化和肝功能衰竭。有证据证实了非酒精性脂肪病与碱基切除修复信号通路有关联，碱基切除修复信号通路的活性在非酒精性脂肪病患者和动物模型中不同程度降低[29-30]。Hedgehog信号通路在成人健康肝脏中不活跃，但在急性和慢性肝损伤期间会被激活，从而调节修复过程和疾病进展[31]。健康的肝脏表达低水平的Hedgehog配体，肝损伤发生时会增强几种常驻细胞(包括肝细胞、肝星状细胞和自然杀伤T细胞)产生Hedgehog配体，这对肝组织修复很重要[32]。目前，Hedgehog通路激活已被证明与非酒精性脂肪性肝炎发病密切相关，并促进非酒精性脂肪性肝炎的纤维化的发展[33]。此次实验也通过生物信息分析阐释了Hedgehog信号通路与自身免疫性肝炎的发生发展密切相关，这进一步印证了Hedgehog信号通路在肝病中发挥了重要作用。此外，Hedgehog信号已被证明可以激活核因子κB[34]，核因子κB在自身免疫性疾病的生理病理中具有重要作用[35-36]，如氧化应激主要与核因子κB信号通路相关。调节核因子κB通路可以不同程度治愈多种自身免疫性疾病[37-38]。综上，此次实验可能为自身免疫性肝炎的发病提供新的视角和靶点，同时为临床研究新药抗肝纤维化和保护肝功能提供更多的实验和理论依据。
自身免疫性肝炎患者肝功能指标血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著高于正常人，并且在疾病的进展中会产生氧化应激反应，提示患者肝功能受损严重[39]。此次实验采用刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤模拟自身免疫性肝炎发病过程，结果显示：相对于正常组，模型组谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平显著增加，氧化应激指标(丙二醛、NO)水平增加，提示造模成功。将mmu-circ-0001520、mmu-circ-0001577和肝损伤指标进行相关分析，结果显示：mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577与谷丙转氨酶、谷草转氨酶、NO、丙二醛存在正相关关系。由此可见，CircRNAs的差异表达与自身免疫性肝炎肝损伤具有相关关系，为mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577作为自身免疫性肝炎防治研究的新靶点提供实验室依据。目前，自身免疫性肝炎诊疗策略的总目标是将血清学指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶等恢复到正常水平，改善肝功能指标及肝脏织学的异常，延缓自身免疫性肝炎的肝纤维化进程，从而提升患者的生活质量[40]。但目前没有治疗自身免疫性肝炎的特效药，常见的标准药物治疗往往也带来了严重的不良反应[41]，因此只有明确自身免疫性肝炎的发病机制，才能有助于自身免疫性肝炎药物的研发。CircRNAs因为其独特的结构及稳定性，在诊断多种自身免疫性疾病中均取得了诸多进展，并已被证明在多种免疫性疾病的发生过程中以组织特异性和发病机制相关方式表达[42]。因此，通过分析差异表达的CircRNAs，可帮助进一步了解自身免疫性肝炎发病的分子机制，mmu-circ-0001520和mmu-circ-0001577有望成为自身免疫性肝炎疾病诊断的生物标志物及治疗靶点。
总之，随着对CircRNAs生物学功能了解的深入，有关CircRNAs的研究已成为RNA研究领域的一个新热点。该文用刀豆蛋白A诱导的小鼠模型检测了与自身免疫性肝炎相关的CircRNAs表达谱，揭示了CircRNAs在细胞金属离子代谢、肝损伤过程中蛋白表达的调控以及参与碱基切除修复信号通路与Hedgehog信号通路中的潜在作用，并探讨了 mmu-circ-0001520、mmu-circ-0001577和肝损伤指标的相关关系。通过今后对CircRNAs的分子机制以及对自身免疫性肝炎的发病机制研究等基础研究的深入，以期为临床诊断寻找新的生物学标志物并对自身免疫性肝炎的靶向治疗研究提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

环状RNA参与自身免疫性肝炎小鼠肝损伤的相关性分析

Correlation analysis of circular RNAs involved in liver injury in mice with autoimmune hepatitis

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