脂肪间充质干细胞复合多孔壳聚糖微球修复大鼠肝损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1562

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 716-722.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1562

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脂肪间充质干细胞复合多孔壳聚糖微球修复大鼠肝损伤

黄坤^1，2，3，刘承利^1，2，韩公海^3，4，刘锐^1，2，陈伟伟^1，2，丁晓³，汤贺³，彭江³

¹安徽医科大学空军临床学院，安徽省合肥市 230032；²中国人民解放军空军总医院，北京市 100142；³中国人民解放军总医院全军骨科研究所，北京市 100853；⁴昆明医科大学，云南省昆明市 650500

修回日期:2018-11-01 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 刘承利，博士，教授，硕士生导师，副主任医师，安徽医科大学空军临床学院，北京市 100142；中国人民解放军空军总医院，北京市 100142
作者简介:黄坤，男，1992年生，安徽省淮北市人，汉族，安徽医科大学在读硕士，主要从事肝脏组织工程方面的研究。
基金资助:
解放军总医院转化医学项目(2016TM-020)，项目负责人：彭江

Repair of liver injury in rats by adipose-derived mesenchymal stem cells combined with porous chitosan microspheres

Huang Kun^{1, 2, 3}, Liu Chengli^{1, 2}, Han Gonghai^{3, 4}, Liu Rui^{1, 2}, Chen Weiwei^{1, 2}, Ding Xiao³, Tang He³, Peng Jiang³

¹Clinical Medical College of Air Force, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; ²Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China; ³PLA Institute of Orthopedics, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; ⁴Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China

Revised:2018-11-01 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Liu Chengli, MD, Professor, Master’s supervisor, Associate chief physician, Clinical Medical College of Air Force, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China
About author:Huang Kun, Master candidate, Clinical Medical College of Air Force, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China; Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China; PLA Institute of Orthopedics, PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
the Translational Medical Project of the PLA General Hospital, No. 2016TM-020 (to PJ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪间充质干细胞-多孔壳聚糖微球：将脂肪间充质干细胞与多孔壳聚糖微球在离心管内37 ℃复合2 h后转入6孔板内培养。
SD大鼠肝损伤模型：将四氯化碳与橄榄油按照1∶9配制成10%四氯化碳溶液注入SD大鼠左下腹腔内。四氯化碳在肝脏代谢过程中，经酶系统作用后引起肝细胞膜脂质的过氧化，导致细胞膜、细胞器的结构破坏，肝细胞变性坏死或肝细胞通透性增强，细胞质内转氨酶渗出，使血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、胆碱酯酶、乳酸脱氢酶活性升高，这些指标在一定范围内能反映肝细胞的损伤程度，病理观察可见肝脏脂肪化、纤维化、水肿样变性和肝细胞坏死等。

摘要
背景：随着干细胞治疗及组织工程的发展，利用生物相容性好的生物高分子材料结合脂肪间充质干细胞构建肝脏组织工程微单元成为治疗肝脏疾病的新策略。
目的：探讨脂肪间充质干细胞复合多孔壳聚糖微球对急性肝损伤的修复能力。
方法：将SD乳鼠脂肪间充质干细胞与多孔壳聚糖微球在体外复合培养，分别在培养第1，3，5天观察细胞在微球上增殖情况。取36只SD大鼠(北京市维通利华实验技术有限公司提供)，随机分为3组(n=12)：空白对照组，腹腔注射生理盐水；急性肝损伤组，腹腔注射10%四氯化碳-橄榄油；脂肪间充质干细胞-多孔壳聚糖微球组，腹腔注射10%四氯化碳-橄榄油，于注射后第1天通过手术将脂肪间充质干细胞-多孔壳聚糖微球平铺于肝脏表面。分别于注射后第1，2，3，7天进行大体、血清学及组织学评价。
结果与结论：①脂肪间充质干细胞与多孔壳聚糖微球复合后第1，3，5天，经过活/死染色观察到细胞可在微球上正常生长(死细胞数量远远少于活细胞数量)，且细胞在不断增殖；②注射后第1，2，3，7天，脂肪间充质干细胞-多孔壳聚糖微球组的大体形态、肝功能及组织学评价均优于急性肝损伤组，从第3天开始脂肪间充质干细胞-多孔壳聚糖微球组与空白对照组已无明显差异；③结果表明，将脂肪间充质干细胞-多孔壳聚糖微球移植入肝脏表面可加速肝损伤的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9689-7155(黄坤)

关键词: 肝损伤, 脂肪间充质干细胞, 壳聚糖, 四氯化碳, 肝功能, 肝脏修复

Abstract:

BACKGROUND: With the development of stem cell therapy and tissue engineering, adipose-derived mesenchymal stem cells combined with biocompatible scaffolds have been introduced to constructing liver tissue engineering micro-units as a new strategy for the treatment of liver diseases.
OBJECTIVE: To investigate the repairing ability of adipose-derived mesenchymal stem cells combined with porous chitosan microspheres on acute liver injury.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells from neonatal Sprague-Dawley rats and porous chitosan microspheres were co-cultured in vitro to observe the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells on the microspheres on the 1^st, 3^rd and 5^th days. Thirty-six Sprague-Dawley rats (provided by Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. in China) were randomly divided into three groups (n=12 per group): control group was intraperitoneally injected with normal saline; acute liver injury group was intraperitoneally administered with 10% carbon tetrachloride-olive oil; and cell-microsphere group was intraperitoneally given 10% carbon tetrachloride-olive oil and then adipose-derived mesenchymal stem cells-porous chitosan microspheres were implanted into the liver surface on the 1^st day after injection. Gross, serological and histological evaluations were performed on the 1^st, 2^nd, 3^rd and 7^th days.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived mesenchymal stem cells-porous chitosan microspheres were stained with live/dead staining on the 1^st, 3^rd and 5^th days. The cells grew normally on the microspheres as the number of dead cells was much less than that of living cells, and the cells proliferated continuously over time. The gross score, liver function score and histological score of the cell-microsphere group were higher than those of the acute liver injury group on the 1^st, 2^nd, 3^rd and 7^th days. There was no significant difference between the cell-microsphere group and control group since the 3^rdday. All these experimental findings indicate that adipose-derived mesenchymal stem cells-porous chitosan microspheres implanted onto the liver surface can accelerate the repair of liver injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Diseases, Carbon Tetrachloride, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Chitosan, Tissue Engineering

中图分类号:

黄坤，刘承利，韩公海，刘锐，陈伟伟，丁晓，汤贺，彭江. 脂肪间充质干细胞复合多孔壳聚糖微球修复大鼠肝损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 716-722.

Huang Kun, Liu Chengli, Han Gonghai, Liu Rui, Chen Weiwei, Ding Xiao, Tang He, Peng Jiang. Repair of liver injury in rats by adipose-derived mesenchymal stem cells combined with porous chitosan microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 716-722.

图/表（结果） 2

2.1 ADSCs的形态 接种2 h后细胞开始大量贴壁，12 h内完成贴壁，然后开始大量增殖，24 h细胞增殖可达80%。PBS洗掉未贴壁细胞，在显微镜下观察到ADSCs贴壁生长，呈梭形，并逐渐融合，见图1A。在进行稳定传代后，可观察到细胞形态和生长速度没有明显改变，见图1B。

2.2 ADSCs成脂、成骨、成软骨三系诱导分化 成脂诱导3 d后细胞回缩成多角形形态，细胞内可见少量脂滴，随着诱导时间的延长脂滴逐渐增多并相互融合，诱导完成后油红O染色可见细胞内脂滴成红色，见图2A。成骨诱导3 d后细胞逐渐成长梭形，10 d左右细胞变为多边形并可见少量钙结节沉积。诱导21 d后茜素红染色可见橘红色钙结节，见图2B。成软骨诱导3 d后出现肉眼可见的团块，14 d后细胞团渐成透明状，诱导28 d后经阿利新蓝染色可见软骨组织内酸性黏多糖，见图2C。

2.3 ADSCs在多孔壳聚糖微球上的活/死染色结果 多孔壳聚糖微球无明显的细胞毒作用，ADSCs可在微球上贴附生长及增殖，用共聚焦显微镜进行扫描时，可在不同深度的层面观察到微球内部仍有活细胞，但细胞数量较少，见图3。复合第1天干细胞形态由圆形转为长梭形贴附在微球表面，第3天ADSCs贴附在微球上具有明显的增殖趋势，第5天ADSCs在微球上细胞数量明显增加。

2.4 ADSCs-多孔壳聚糖微球对肝损伤大鼠血清肝功能指标的影响 谷丙转氨酶、谷草转氨酶作为肝细胞内酶，在氨基酸的合成与分解代谢中起着非常重要的作用，是诊断肝细胞受损程度最敏感的指标。正常情况下，血清中两种酶的活性很低。在肝细胞损伤时，细胞膜通透性增加，谷丙转氨酶、谷草转氨酶释放入血，血清酶活性显著升高，并且反映肝细胞受损程度。ADSCs-多孔壳聚糖微球对肝损伤大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活力的影响，见图4。结果显示，大鼠在治疗第3天时肝功能恢复至接近正常水平(P > 0.05)，急性肝损伤组肝功能与空白对照组差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 ADSCs-多孔壳聚糖微球移植入肝脏表面后组织形态学变化 正常对照组大鼠腹腔内无腹水，肝脏表面鲜红，肝包膜完整，大网膜和肝脏表面无明显粘连，见图5A。注射四氯化碳后SD大鼠腹腔内积水超过5 mL，肝脏表面由红变灰白色，肝包膜破损明显，大网膜与肝脏表面有一定的粘连，见图5B。治疗3 d后取出大鼠肝脏，观察到ADSCs-多孔壳聚糖微球仍贴附在肝脏表面，见图5C。

正常对照组肝脏经苏木精-伊红染色后可观察到肝细胞排列整齐，结构完整，胞质丰富，肝细胞核清晰，大而圆，无明显肿胀及脂肪变性，肝小叶内及汇管区无炎症细胞浸润，未见肝细胞坏死变性及异常，见图6A，B。

急性肝损伤组注射10%四氯化碳-橄榄油24 h，可以观察到肝细胞排列紊乱，肝细胞有明显的坏死，肝细胞弥漫性水肿，肝小叶内有明显的坏死灶，炎细胞浸润严重，细胞核大小不一，有浓缩及破碎的核，组织形态证明造模成功，见图6C，D；在第2天时，ADSCs-多孔壳聚糖微球组肝细胞坏死数较多，存在着大小不一的脂肪空泡样变化，但较急性肝损伤组有一定的改善，见图6E，F，急性肝损伤组肝细胞仍有坏死，炎细胞浸润较严重，见图6G，H。在第3天时，ADSCs-多孔壳聚糖微球组肝窦内仍有出血，但无明显的炎细胞浸润，较急性肝损伤组有明显改善，见图6I，J，急性肝损伤组仍有少量的脂肪变性，见图6K，L。在第7天时，ADSCs-多孔壳聚糖微球组肝细胞排列相对整齐，胞质均匀清晰，只有部分细胞坏死，少量的空泡现象，见图6M，N，比急性肝损伤组肝脏修复效果好，见图6O，P。肝功能及病理学切片结果表明ADSCs-多孔壳聚糖微球对大鼠急性肝损伤有明显的修复作用。

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引言

病毒、毒品、毒素或乙醇等引起的肝脏损伤，可能会导致肝性脑病、肝肾综合征、感染及多功能器官衰竭，严重者会出现急性肝衰竭^[1]。肝脏损伤随着病程进展，肝实质细胞广泛坏死，肝组织再生能力下降，进展为终末期肝病，其合成、解毒、排泄以及生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现凝血机制障碍及黄疸、肝性脑病、腹水等主要表现。肝脏本身具有一定的再生能力，但当发生较为严重的肝细胞坏死，其再生能力受创，临床上采用的保肝治疗周期长，在治疗过程中病情有可能进一步恶化。因此，抑制肝损伤时肝细胞进一步坏死，促进肝再生，缩短其疗程成为目前临床及实验室研究热点。

近年来，干细胞作为生物疗法被广泛应用于多种疾病的治疗中。间充质干细胞是最早被发现的具有贴壁生长特性、由中胚层间充质衍生而来的一组干细胞。间充质干细胞可以从骨髓、脐带、脐血和脂肪组织中分离得到，其在体内和体外均可分化为多种细胞类型，已有实验证明龋齿类和人类间充质干细胞可以分化为具有正常肝细胞功能的肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells，HLCs)^[2-3]。间充质干细胞产生的细胞因子和信号分子作用于肝脏损伤部位，具有免疫调节、抗炎、预防存留肝细胞凋亡和促进存留肝组织增殖的作用^[4]。Gilsanz等^[5]用脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)减缓了胆汁淤积造成的肝衰竭的进展及其并发症的发生。Nicolas等^[6]认为间充质干细胞抑制急性肝衰竭相关免疫反应，并减轻和改善慢性肝损伤模型中的纤维化和炎症。Xu等^[7]证明间充质干细胞能够修复小鼠急性肝损伤。

目前干细胞在疾病中已有明显的治疗作用，面临的问题主要是移植后细胞很难定植于肝脏损伤区域，以及难以募集到其他内源性干细胞进入肝脏损伤区域进行修复。因此，寻找一个安全、生物相容性好的微载体用以提高移植后的存活率，促进干细胞的修复效果是非常关键的。生物相容性较好的材料如生物高分子材料多来源于生物体组织、蛋白以及多糖等，并且具有良好的生物相容性、低免疫原性^[8]，常用的有胶原蛋白^[9]、明胶^[10-11]、藻酸盐^[12-13]、壳聚糖^[14]、丝素蛋白等^[7]。壳聚糖材料与其他生物相容性材料相比具有来源广泛、廉价易得、良好生物相容性、安全性和可降解等优点，并且可以依据其组织的特异性采用不同的材料工艺对其进一步的加工和改造，使其具有特定的结构和性能。

综合以上的研究进展，利用生物相容性好的生物高分子材料结合ADSCs构建肝脏组织工程微单元成为治疗肝脏疾病的新策略。实验采用3D多孔壳聚糖微球为ADSCs提供一个较好的三维环境，促进ADSCs的黏附、增殖及分泌细胞因子，从而在另一方面提高ADSCs在移植部位的存活率及停留率。通过激光共聚焦显微镜观察ADSCs在明胶微球上的存活率，并且分析了ADSCs复合多孔壳聚糖微球后对大鼠肝脏损伤的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年5至7月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠36只，三四个月龄，体质量(240±10) g；出生48 h的SPF级SD乳鼠10只，雌雄不拘，均由北京市维通利华实验技术有限公司提供。

1.3.2 实验用主要材料、试剂及仪器 多孔壳聚糖微球(中国北京科技大学)，孔隙率(88.26±2.92)%，孔径(37.97±10.25) μm。Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司)；低糖DMEM、胎牛血清(美国Corning公司)；PBS(美国Corning公司)；双抗(美国Gibco公司)；胰酶(美国Gibco公司)；细胞培养皿、细胞培养瓶、6孔培养板(美国Corning公司)；DP70荧光显微镜、IX70倒置相差显微镜(日本OLYMOUS公司)；CD34、CD29、CD44、CD105抗体(美国Abcam公司)；流式细胞仪(型号：EPOCH TAKE3，美国BD公司)；YT-CJ-2NB超净工作台(北京亚泰公司)；低速台式离心机(北京白洋公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠ADSCs的分离和培养 采用脱颈法处死出生48 h SD乳鼠，体积分数75%乙醇浸泡10 min后，将其转移至超净台内无菌平皿中。用小镊子提起脐上部皮肤用眼科剪垂直于腹正中线环剪1周，然后延着腹正中线向下剪，取出SD乳鼠腹股沟处脂肪组织，PBS冲洗3遍。将洗净的脂肪组织放入含少量Ⅱ型胶原酶(防止脂肪组织粘瓶壁)的青霉素小瓶内，用眼科剪处理15 min，脂肪组织被剪碎后加入5 mL Ⅱ型胶原酶、磁珠，在培养箱内用磁力搅拌器磁力混匀消化30 min，经100 μm滤网过滤后在1 700 r/min低速离心机内离心5 min；加入与Ⅱ型胶原酶等量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化；取出上清液后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打成细胞悬浮液，接种到25 cm²培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中孵育培养，并标记为原代。

原代细胞孵育24 h后，倒置显微镜下观察细胞生长情况，若细胞未达到80%则进行换液处理。待细胞长到80%后，用0.25%胰蛋白酶对其进行消化，并按照1∶3比例传代培养，24 h后继续观察，若再次长到80%，应用上述方法进行传代，将细胞标记为第1-5代。

1.4.2 大鼠ADSCs三系诱导

(1)成脂诱导：将第2代ADSCs从培养瓶消化下来制成细胞悬液进行计数处理，以2×10⁴/cm²的密度接种于6孔板内，加入3 mL含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养液培养，24 h后吸弃培养液，加入成脂诱导液A液(A液基础培养基、胎牛血清、双抗、谷氨酰胺、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、地塞米松)，3 d后换成3 mL B液(B液基础培养液、胎牛血清、双抗、谷氨酰胺、胰岛素)，24 h后换回A液继续诱导，交替诱导三四次，PBS清洗2次，每孔加入40 g/L多聚甲醛液固定30 min，吸尽固定液后加入油红O染液染色30 min，显微镜下观察并拍照。

(2)成骨诱导：第2代ADSCs以2×10⁴/cm²的密度接种于6孔板内，加入3 mL含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养液培养，24 h后吸弃培养液，加入成骨诱导液(基础培养基、胎牛血清、双抗、谷氨酰胺、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松)，3 d换1次诱导培养液，持续诱导21 d，PBS清洗2次，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，吸尽固定液后加入茜素红染色3-5 min，显微镜下观察并拍照。

(3)成软骨诱导：用预混液(基础培养液、地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸)以5.0×10⁸ L^-1的密度重悬ADSCs，吸取1 mL悬液移至15 mL离心管内，800 r/min离心5 min，吸尽上清，小心加入成软骨诱导液(预混液、转化生长因子β3)，瓶盖勿拧死，置于培养箱内，每3 d换液1次，操作过程中要尽量小心，持续诱导28 d。诱导结束后软骨球经固定、脱水、包埋后石蜡切片，然后经脱蜡、脱水处理后阿利新蓝染色30 min，封固，待树脂干燥后在显微镜下观察并拍照。

1.4.3 ADSCs复合多孔壳聚糖微球 在微量称重仪上称取10 mg多孔壳聚糖微球放入EP管内，封孔膜封住EP管，在⁶⁰Co射线下进行消毒。将第2代ADSCs从培养瓶消化下来制成细胞浓度为5×10⁸ L^-1的细胞悬液放置在15 mL离心管内，加入10 mg无菌多孔壳聚糖微球使其浸泡在细胞悬液内。以封孔膜封住离心管后转移至37 ℃恒温培养箱内2 h，取出离心管内液体及微球在无菌超净台内转移至6孔板，加入5 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液。对6孔板进行日期标记。每24 h吸出孔内培养液，然后加入5 mL培养液，进行换液处理。

1.4.4 活/死染色 取出-20 ℃下保存的活/死染色剂A液、B液，待其解冻后在避光条件下以微量移液枪取B液2.0 μL、A液0.5 μL加入到1 mL PBS内混匀后避光，等待下一步染色。ADSCs在多孔壳聚糖微球上增殖1，3，5 d时分别取出微球至15 mL离心管内，PBS洗3遍，每次微球在PBS内浸泡5 min。将配制好的1 mL活/死染色剂加入至离心管内避光条件下轻轻晃动，避免微球沉入液体底部，来回反复持续10-15 min。染色完毕后取出离心管内多余液体，加入一定量的PBS浸泡5-10 min，重复3次对其进行清洗，然后转至共聚焦荧光显微镜下进行拍摄。

1.4.5 急性肝损伤模型制备 将四氯化碳与橄榄油按照1∶9配比制成10%四氯化碳-橄榄油试剂。一手抓捏大鼠背部皮肤固定其位置，使其头部偏下，选取左下腹注射部位，用1 mL注射器将10%四氯化碳-橄榄油(10 mL/kg)注入大鼠腹腔制备急性肝损伤模型。在鼠箱上标注注射日期及第0天以备下一步实验。

1.4.6 实验动物分组与处理 36只SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为3组，每组12只。①空白对照组：腹腔注射生理盐水；②急性肝损伤组：腹腔注射10%四氯化碳-橄榄油，注射后第1天行假手术，不给予ADSCs-多孔壳聚糖微球；③ADSCs-多孔壳聚糖微球组：腹腔注射10%四氯化碳-橄榄油，注射后第1天，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)进行麻醉，右上腹备皮、碘伏消毒、铺单，将其固定在手术台上，逐层打开腹腔暴露大鼠肝脏，在无菌条件下将ADSCs-多孔壳聚糖微球平铺在肝脏右外侧叶与右内侧叶之间。平铺之前将5×10⁸ L^-1 ADSCs与10 mg多孔壳聚糖微球复合后体外增殖培养5 d。注射四氯化碳-橄榄油后第1，2，3，7天每个时间点取3只大鼠，于腹主动脉取血，血量足够后排尽大鼠血液，取出大鼠肝脏，固定于组织固定液内。

1.4.7 血清学肝功能指标测定 取注射四氯化碳-橄榄油后第1，2，3，7天血液，放于生化管内，在高速离心机内3 500 r/min离心，取分离胶上处的血清于中国人民解放军总医院生化科检测大鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。

1.4.8 苏木精-伊红染色观察肝脏组织形态 肝脏组织经组织固定液固定24 h后，取右外侧肝叶组织块，梯度脱水，石蜡包埋固定，利用切片机切片，厚度为5-10 μm，切片常规脱蜡、复水，苏木精染色5 min，经0.5%盐酸分色、水洗蓝化后，伊红染色15 s，二甲苯透明，中性树胶封固，在显微镜下观察肝脏组织形态并拍照。

1.5 主要观察指标 ①ADSCs在培养瓶内形态；②ADSCs在多孔壳聚糖微球支架上的增殖及贴附情况；③各组大鼠肝功能生化指标；④各组大鼠肝脏组织学形态。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

早在1970年，Friedenstein等^[15]首次采用密度梯度离心法成功分离了骨髓间充质干细胞。研究表明，间充质干细胞存在于大多数器官的结缔组织中^[16]，具有多重转分化、抗细胞凋亡、促进血管生成、组织修复、抗炎活性、免疫抑制和神经保护等多效性^[17]，其可通过旁分泌作用，分泌细胞因子及生长因子，还可通过募集体内祖细胞来达到修复的效果^[18]。Guo等^[19]证实间充质干细胞具有较强的免疫调节作用，在器官急性损伤模型中白细胞介素10、白细胞介素13、肝细胞生长因子等细胞因子分泌显著升高，肝纤维化相关因子如人血小板衍生生长因子BB、人血小板衍生生长因子AA、转化生长因子β1等显著减低，从而在急性放射损伤方面具有一定的治疗效果。Chang等^[20]通过实验证明间充质干细胞与AML12肝细胞在体外共培养21 d可转分化为肝细胞样细胞，将分化后的肝细胞样细胞移植入大鼠肝脏表面可修复急性肝脏损伤。

病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性疾病、遗传性疾病等导致的严重肝功能损伤最终会发展为急性肝功能衰竭或慢性肝病。由于社会压力大、环境污染等因素一定程度上加速了肝病患者的转归，进展为终末期肝病。原位肝移植是急、慢性肝功能衰竭和终末期肝病患者的唯一有效治疗手段。但是，由于供肝源缺乏、免疫排斥、费用昂贵等因素限制了其在临床的广泛应用，部分患者往往在等待肝源中离去。肝脏组织工程的发展以及干细胞在临床中的应用为急、慢性肝病的治疗提供了新的手段。目前药物及人工肝治疗会降低死亡率，但治疗效果仍有限^[21-22]。以肝脏组织工程微单元构建生物人工肝支持系统能够缓解上述矛盾。生物人工肝系统的基础恰恰是种子细胞和生物材料载体。种子细胞一方面能发挥抗炎、抗细胞凋亡、募集体内干细胞、激活肝脏再生机制，另一方面能够补充有功能的肝脏细胞。由于肝脏祖细胞的数量有限，增殖能力较差，在体外培养维持其干性及表型所需要的条件较为苛刻。为了解决这些问题，研究者们提出了以其他成体干细胞为基础的治疗策略，包括胚胎干细胞^[23]，诱导多能干细胞^[24]、间充质干细胞等^[25-27]。Jiang等^[28]采用物理粉碎的方法将人脐带来源间充质干细胞膜粉碎重组成干细胞来源的外泌体小泡，通过尾静脉注射的方法证明了其具有抗氧化、抗凋亡的作用，并且能够激活增殖细胞核抗原，促进其自身再生。

在2001年，Zuk等^[29]用胶原酶首次分离培养了ADSCs。ADSCs与其他组织来源的间充质干细胞相比来源更为丰富，取材较为容易且创伤较小，无痛苦或痛苦小，且具有独特的免疫抑制性，不涉及伦理学问题等，其从被发现开始就被认为是细胞及组织工程种子细胞的完美替代细胞。目前间充质干细胞在治疗肝脏疾病方面的途径主要有肝动脉、肝静脉及门静脉内直接输注移植、腹腔内注射及直接肝内注射^[5]，这些移植途径都有着一定的治疗效果，但也存在着一定的弊端。血管内移植面临着血栓形成的风险，大血管注射对于肝功能较差患者面临着出血难以控制的风险，腹腔注射及直接肝内注射对于间充质干细胞的停留率难以保证，以及其是否能准确的归巢入肝脏等问题。近年来壳聚糖材料应用越来越广泛，与其他大分子物质复合形成的材料在组织工程中得到了广泛的应用。壳聚糖和赖氨酸结合的多孔微球复合间充质干细胞后有确切的修复软骨的作用^[14]，Padalhin等^[30]将双相磷酸钙与壳聚糖复合作为止血剂，并且观察到其促进了骨再生。因此ADSCs复合多孔壳聚糖微球移植入肝脏表面，不仅能够解决ADSCs的停留率，还规避了血管注射中可能面临的一系列危险因素，并且为下一步验证ADSCs在肝脏中的转归提供了便利。

间充质干细胞需要21 d才能分化成肝细胞样细胞^[31]，Jiang等^[28]实验证实了间充质干细胞膜打碎重组成的外泌体具有激活增殖细胞核抗原的功能，因此间充质干细胞在急性肝损伤模型中的治疗作用主要是依靠旁分泌作用，抑制肝细胞的凋亡以及促进肝细胞再生而发挥修复功能。与传统间充质干细胞注射移植治疗肝脏损伤相比，该实验中作者采用了ADSCs作为种子细胞复合多孔壳聚糖微球在体外培养增殖5 d，进行活/死染色后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞分布和增殖情况，第1，3，5天观察到细胞在多孔壳聚糖微球上生长有明显的增殖趋势，且死细胞数量远远少于活细胞数量，从而说明ADSCs可在多孔壳聚糖微球上生长且其无明显的细胞毒作用。将体外培养增殖5 d的ADSCs-多孔壳聚糖微球移植平铺在急性肝损伤大鼠肝脏表面，通过进行肝功能检测及肝脏苏木精-伊红染色观察发现从移植第3天开始，大鼠肝功能有明显的好转，其病理形态也证实了这一现象。因此，ADSCs-多孔壳聚糖微球能够促进损伤肝脏的修复。

综上所述，多孔壳聚糖微球为间充质干细胞的增殖提供了优化的三维环境和空间，使得干细胞能够大量在生物材料上增殖，促进移植干细胞的存活，增强干细胞的治疗效果，进而促进肝细胞再生，修复受损肝脏。下一步计划将支架、种子细胞等复合后诱导构建具有良好生物学功能的肝脏微组织，以期为肝脏组织工程的研究提供新的策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪间充质干细胞复合多孔壳聚糖微球修复大鼠肝损伤

Repair of liver injury in rats by adipose-derived mesenchymal stem cells combined with porous chitosan microspheres

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