自体来源诱导性多能干细胞移植治疗小鼠慢性乙型肝炎性肝损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1551

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
慢性乙型肝炎性肝损伤：是指患者在感染HBV后引起的肝脏慢性炎症，病程一般在半年以上，随着病情进展，先后经历肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，这一连续的病理生理过程最终导致肝细胞大量坏死，肝细胞再生能力降低，肝脏功能失代偿进而肝衰竭，患者肝脏一旦进入功能失代偿期，则常规治疗方法的疗效欠佳，虽然肝细胞具有再生功能，但肝细胞的再生能力随着肝损伤程度的加重而被抑制，导致患者病死率高。
诱导性多能干细胞移植：随着基因编辑技术的发展，通过将成体细胞重编程获取能分化成多种组织器官的诱导性多能干细胞不仅限于正常机体，患者的体细胞也可重编程为疾病特异性的诱导性多能干细胞，为发病机制及药物筛选研究提供细胞模型，还能实现自体细胞移植，避免了伦理及免疫排斥问题，使器官损伤的再生医学与组织工程具有更广阔的应用前景。

摘要
背景：自体来源诱导性多能干细胞移植改善肝组织结构与功能是慢性乙型肝炎性肝损伤治疗的新研究方向。
目的：观察自体皮肤来源诱导性多能干细胞移植治疗HBV转基因小鼠慢性肝损伤的效果。
方法：用腹腔注射四氯化碳建立HBV转基因小鼠(购于北京维通达生物技术有限公司)慢性肝损伤模型；造模开始注射四氯化碳第1周后，将模型小鼠皮肤成纤维细胞体外重编程为诱导性多能干细胞并进行鉴定；造模6周结束后第2天，通过门静脉途径将0.1 mL诱导性多能干细胞移植到模型小鼠肝内，对照组注射0.1 mL PBS；移植后7，14 d，冰冻切片观察诱导性多能干细胞定植情况；ELISA法检测小鼠肝功能；石蜡切片苏木精-伊红染色观察肝组织病理学变化。
结果与结论：①模型小鼠皮肤成纤维细胞在体外成功重编程为诱导性多能干细胞，具有多向分化潜能；②移植后7 d，实验组小鼠肝内可见荧光标记的诱导性多能干细胞；③实验组小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素水平低于对照组，白蛋白水平高于对照组(P < 0.05)；④实验组小鼠肝脏中肝细胞变性、坏死及炎细胞浸润较对照组明显改善；⑤结果提示，自体来源诱导性多能干细胞门静脉移植可治疗小鼠慢性乙型肝炎肝损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1026-562X(潘丽娟)

关键词: 乙型肝炎, 肝损伤, 诱导性多能干细胞, 细胞移植, 肝功能, HBV转基因小鼠

Abstract:

BACKGROUND: Autologous source induced pluripotent stem cell transplantation to improve liver tissue structure and function is a new research direction in the treatment of liver injury caused by chronic hepatitis B.
OBJECTIVE: To observe the effect of autologous skin-derived induced pluripotent stem cell transplantation on chronic hepatic injury in HBV transgenic mice.
METHODS: Achronic hepatic injury model of HBV transgenic mice (provided by the Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd. in China) was established with intraperitoneal injection of carbon tetrachloride. At 1 week after injection of carbon tetrachloride, skin fibroblasts from the model mice were reprogrammed into induced pluripotent stem cells and identified in vitro. Induced pluripotent stem cells (0.1 mL) were transplanted into the liver of model mice through the portal vein pathway as experimental group, and PBS (0.1 mL) was injected into the other mice as control group. Colonization of induced pluripotent stem cells was observed by frozen section at 7 and 14 days of transplantation. Liver function of the mice was detected by ELISA, and liver histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin staining of paraffin section.
RESULTS AND CONCLUSION: Skin fibroblasts from model mice were successfully reprogrammed into induced pluripotent stem cells in vitro that had multipotent differentiation potential. At 7 days after transplantation, fluorescent labeled induced pluripotent stem cells were found in the mouse liver of the experimental group. The levels of serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, glutamyl transpeptidase, and total bilirubin in the experimental group were lower than those in the control group, and the level of albumin was higher than that in the control group (P < 0.05). Liver cell degeneration, necrosis and inflammatory cell infiltration in the mouse liver of the experimental group were significantly improved as compared with the control group. These results suggest that portal vein transplantation of autologous source induced pluripotent stem cells can treat chronic hepatitis B-induced liver injury in mice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hepatitis B, Induced Pluripotent Stem Cells, Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

潘丽娟，王荣丽. 自体来源诱导性多能干细胞移植治疗小鼠慢性乙型肝炎性肝损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 773-778.

Pan Lijuan, Wang Rongli. Therapeutic effect of autologous source induced pluripotent stem cell transplantation on chronic hepatitis B-induced liver injury mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 773-778.

图/表（结果） 1

2.1 诱导性多能干细胞的形态与鉴定 传至第3代的诱导性多能干细胞呈克隆样生长，椭圆形细胞克隆边界清晰，克隆中细胞体积小，细胞核大，核仁明显，细胞形态一致，折光性强，排列紧密，见图1A；免疫荧光染色结果显示，细胞中多能性标志OCT4、NANOG和SSEA-1呈阳性表达，提示细胞具有多能性，见图1B；体外分化能力检测结果显示，将细胞悬浮培养10 d后形成拟胚体，提示细胞具有体外分化增殖能力，见图1C。上述结果表明转染后获得的细胞具有诱导性多能干细胞特征。

2.2 参与研究小鼠一般情况及数量分析 24只HBV转基因小鼠在造模后饮食次数减少、行动略迟缓、体质量减轻，对照组造模6周内死亡1只，PBS注射后死亡1只；实验组造模6周内死亡2只，诱导性多能干细胞移植后10只小鼠无死亡；两组均有10只小鼠的实验数据计入结果分析。

2.3 诱导性多能干细胞在小鼠肝脏中的定植 为了细胞移植后示踪，门静脉注射前用荧光染料CFSE标记诱导性多能干细胞，CFSE与细胞膜、细胞质及细胞核上的蛋白结合，呈现绿色荧光，与细胞核的结合最多，见图2A，经CFSE染料标记的悬浮诱导性多能干细胞在荧光显微镜下观察可见绿色荧光，细胞核部位荧光强度较胞质高，说明诱导性多能干细胞活性较好；移植7 d后，实验组冰冻切片在荧光显微镜下观察显示小鼠肝脏内有点状散在分布的绿色荧光，强弱不等，说明荧光标记的诱导性多能干细胞在肝脏内定植，由于一旦细胞分裂，标记的荧光将减弱，提示移植的诱导性多能干细胞可能存在不同程度的分化，见图2B；移植后14 d，实验组小鼠肝脏冰冻切片在荧光显微镜下无明显绿色荧光出现，提示随着诱导性多能干细胞的分裂增殖，荧光逐渐减弱，见图2C。

2.4 诱导性多能干细胞移植对小鼠肝功能的影响 为了明确移植诱导性多能干细胞对小鼠肝功能的影响，分别检测了移植7，14 d后血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、白蛋白、总胆红素水平，见图3。对照组与正常小鼠肝功能比较，血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素水平均升高，白蛋白水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；与对照组比较，移植后7 d和14 d实验组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素水平均不同程度的降低，白蛋白水平则升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与移植后7 d比较，实验组移植14 d后血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素水平均降低，白蛋白水平升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示诱导性多能干细胞移植后，随着时间的延长，肝功能得到改善。

2.5 诱导性多能干细胞移植对损伤肝脏组织结构的影响 为了深入研究移植诱导性多能干细胞对肝脏损伤的治疗作用，对损伤肝脏的组织病理学特征进行观察。移植7 d后，对照组小鼠肝脏中肝小叶结构紊乱，可见坏死的肝细胞，较多肝细胞内含有大小不一的脂滴呈脂肪变性，炎症细胞浸润明显，见图4A；移植14 d后，对照组小鼠肝脏中变性、坏死的细胞增多，中央静脉位于偏位，大量炎症细胞浸润，见图4B。移植7 d后，实验组小鼠肝脏的单个显微视野中坏死和脂肪变性的肝细胞数量减少，浸润的炎症细胞减少，门管区的小叶间静脉中可见上皮样细胞，见图4C；移植14 d后，实验组小鼠肝脏的单个显微视野中肝细胞脂肪变性、坏死及炎症细胞浸润改善明显，假小叶减少，可见肝小叶重建，见图4D。

参考文献

[1] Schlabe S, van Bremen K, Aldabbagh S, et al. Hepatitis B virus subgenotype F3 reactivation with vaccine escape mutations: A case report and review of the literature. World J Hepatol. 2018;10(7): 509-516.

[2] Bhatia M, Gupta E, Choudhary MC, et al. Evaluation of impact of occult hepatitis B infection in chronic HCV-infected patients: A retrospective cohort study. J Lab Physicians. 2018;10(3):304-308.

[3] Lanini S, Pisapia R, Capobianchi MR, et al. Global epidemiology of viral hepatitis and national needs for complete control. Expert Rev Anti Infect Ther. 2018;16(8):625-639.

[4] Jiang XW, Ye JZ, Li YT, et al. Hepatitis B reactivation in patients receiving direct-acting antiviral therapy or interferon-based therapy for hepatitis C: A systematic review and meta-analysis. World J Gastroenterol. 2018;24(28):3181-3191.

[5] 闫成,薛改,吴丽颖,等. 两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较[J]. 中国组织工程研究, 2015,19(19): 2993-2998.

[6] 袁淑芳,胡兰英,姜涛,等. 骨髓间充质干细胞移植肝衰竭大鼠CD163和白细胞介素10的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014,18(6):919-925.

[7] 赵文秀,张磊,刘建明,等. 小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及其在肝内归巢[J]. 南方医科大学学报,2013,33(8):1151-1154.

[8] 丛姗,白立恒,李岩,等. 人羊膜间充质干细胞移植对CCl4诱导的小鼠损伤肝HGF、SIRT-1、α-SMA及P~(27kip1)表达的影响[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2015,31(3): 292-300.

[9] 王建军,赵平,靳雪源,等. 诱导性多能干细胞治疗小鼠肝损伤的初步研究[J]. 中国肝脏病杂志(电子版),2016,8(2): 39-43.

[10] 吴玉卓,杨乐,翟玉峰,等. 自体骨髓间充质干细胞治疗乙型肝炎失代偿期患者:肝纤维化、肝功能、MELD评分及1年生存率分析[J]. 中国组织工程研究,2017,21(13):2049-2055.

[11] 任浩,董静,刘力伟,等. 人脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化患者发生肝细胞癌的危险因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2018,22(9): 1350-1356.

[12] Pocock JM, Piers TM. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nat Rev Neurosci. 2018;19(8): 445-452.

[13] 张雪,明雅南,张岚. 诱导性多能干细胞的安全性及其在肝细胞再生方面的应用潜能[J].肝脏,2016,21(5): 404-407.

[14] Roy-Chowdhury N, Wang X, Guha C, et al. Hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells. Hepatol Int. 2017; 11(1):54-69.

[15] Pournasr B, Duncan SA. Modeling Inborn Errors of Hepatic Metabolism Using Induced Pluripotent Stem Cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37(11):1994-1999.

[16] 李君,杜潇,吴嫣爽,等. 不同分化阶段诱导性多能干细胞移植实验研究进展[J].解剖学报,2015,46(5):699-703.

[17] Revill P, Yuan Z. New insights into how HBV manipulates the innate immune response to establish acute and persistent infection. Antivir Ther. 2013;18(1):1-15.

[18] Chang RH, Nyamsuren T, Gyawali S, et al. Long-term Nucleos(t)ides Analogues for Chronic Hepatitis B Improve Liver and Spleen Size: A Noninvasive Sonographic Study. J Med Ultrasound. 2017;25(3):161-166.

[19] Raven S, Urbanus A, de Gee A, et al. Predictors of hepatitis B vaccination completion among people who use drugs participating in a national program of targeted vaccination. Vaccine. 2018; 36(35):5282-5287.

[20] Liu D, Liu L, Wang L, et al. Therapeutic effects of mesenchymal stem cells combined with short hairpin RNA on liver injury induced by hepatitis B virus infection. Mol Med Rep. 2018;17(1):1731-1741.

[21] Berenguer M, de la Rosa Rodríguez G, Domínguez-Gil B. Significant impact of new oral therapies against HCV on the waiting list for liver transplantation in Spain. J Hepatol. 2018; 69(4):966-968.

[22] Zheng WP, Zhang BY, Shen ZY, et al. Biological effects of bone marrow mesenchymal stem cells on hepatitis B virus in vitro. Mol Med Rep. 2017;15(5):2551-2559.

[23] Qu M, Yuan X, Liu D, et al. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Attenuate Immune-Mediated Liver Injury and Compromise Virus Control During Acute Hepatitis B Virus Infection in Mice. Stem Cells Dev. 2017;26(11):818-827.

[24] Lou C, Bai T, Bi LW, et al. Negative impact of hepatitis B surface seroclearance on prognosis of hepatitis B-related primary liver cancer. World J Clin Cases. 2018;6(8):192-199.

[25] Tseng CH, Chang CY, Mo LR, et al. Acoustic Radiation Force Impulse Elastography with APRI and FIB-4 to Identify Significant Liver Fibrosis in Chronic Hepatitis B Patients. Ann Hepatol. 2018; 17(5):789-794.

[26] Singh K, Evens H, Nair N, et al. Efficient In Vivo Liver-Directed Gene Editing Using CRISPR/Cas9. Mol Ther. 2018;26(5): 1241-1254.

[27] Aravalli RN, Steer CJ. Gene editing technology as an approach to the treatment of liver diseases. Expert Opin Biol Ther. 2016;16(5): 595-608.

[28] Sukowati CH, El-Khobar KE, Ie SI, et al. Significance of hepatitis virus infection in the oncogenic initiation of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2016;22(4):1497-1512.

[29] Terai S, Takami T, Yamamoto N, et al. Status and prospects of liver cirrhosis treatment by using bone marrow-derived cells and mesenchymal cells. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20(3):206-210.

[30] Li YH, Xu Y, Wu HM, et al. Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Hepatitis B Virus Related Acute-on- Chronic Liver Failure Treated with Plasma Exchange and Entecavir: a 24-Month Prospective Study. Stem Cell Rev. 2016; 12(6):645-653.

引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属于有包膜的小型部分双链DNA嗜肝病毒，严重危害人类健康^[1]。在世界范围内，每年约有7.5万慢性乙型肝炎患者死于包括肝硬化、肝癌和肝衰竭在内的HBV相关性并发症^[2-3]。慢性乙型肝炎是指患者在感染HBV后引起的肝脏慢性炎症，肝脏一旦进入功能失代偿期，则常规治疗方法疗效欠佳，虽然肝细胞具有再生功能，但肝细胞的再生能力随着肝损伤程度的加重而被抑制，导致患者病死率较高^[3-4]。因此，以干细胞为种子细胞来源的肝细胞再生医学研究成为修复损伤肝脏、提高患者生存率的一个新方向。

干细胞具有自我更新与多向分化潜能，根据其来源不同，分为胚胎干细胞与成体干细胞，其中以间充质干细胞为代表的成体干细胞研究在肝脏再生方面取得了一系列重要进展^[5]。大量基础与临床研究证实，骨髓、人脐带、脂肪、人羊膜来源间充质干细胞及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)通过不同移植方式对损伤肝组织进行修复^[6-9]，效果良好。也有研究表明，骨髓、脐带来源间充质干细胞移植治疗乙型肝炎肝损伤效果显著^[10-11]。目前，尚未有关于诱导性多能干细胞移植治疗乙型肝炎肝损伤的研究报道。

诱导性多能干细胞不仅在自我复制过程中可以保持遗传稳定性，还具有向三胚层分化的能力，因其自体来源避免了免疫排斥和伦理问题，已成为再生医学研究中最具潜力的种子细胞，其体外诱导方法也已日臻完善^[12]。以往的研究已证实，诱导性多能干细胞不仅可以体外诱导分化为功能性肝细胞，还能经过体内移植治疗肝损伤及肝衰竭动物模型，效果良好^[13-15]。李君等^[16]研究发现将干细胞体外诱导为成熟细胞再进行移植虽然发挥作用快，但不持久且活性低，而尾静脉直接注入诱导性多能干细胞进入肝脏则明显提高了小鼠存活率，还在外周血中持续检测到白蛋白。因此，作者设想将HBV感染小鼠的体细胞重编程为诱导性多能干细胞进行体内移植也有改善慢性肝损伤的效果。

为了更好地研究HBV的感染机制、药物开发及新治疗手段，国内外学者先后用不同方法建立了HBV小鼠模型，其中HBV转基因小鼠模型在HBV清除机制之外的研究方向上得到了广泛应用^[17]。该研究应用HBV转基因小鼠通过化学性诱导建立慢性乙型肝炎肝损伤模型，取模型小鼠自体皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞，观察诱导性多能干细胞体内移植后是否有效减轻肝损伤且促进肝组织修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物体内移植实验。

1.2 时间及地点 2016年1月至2017年12月在西南医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 8-10周龄C57BL/6小鼠10只，雌雄各半，体质量23-26 g，SPF级，购于北京华阜康生物科技股份有限公司；8-10周龄雄性HBV转基因小鼠24只，体质量20-24 g，SPF级，购于北京维通达生物技术有限公司。

1.3.2 实验试剂与仪器 四氯化碳 (中国天津德恩公司)；Knockout DMEM、DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；Ⅰ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司)；Anti-OCT4、NANOG、SSEA-1、β-actin抗体(美国Abcam公司)；DAPI、荧光标记IgG(美国Termo Fisher公司)；荧光染料CFSE(CFDA-SE) (日本Dojindo公司)；倒置相差显微镜、光学显微镜(日本Olympus公司)；二氧化碳培养箱(美国Termo Fisher公司)；超净工作台(中国上海博讯公司)；酶标仪(美国BioTek公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 HBV转基因小鼠慢性肝损伤模型的建立 取24只HBV转基因小鼠，以10 mL/kg剂量腹腔注射含20%四氯化碳的食用花生油，每周一和周四注射1次，连续注射6周，造模完成。

1.4.2 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备 C57BL/6小鼠按雌雄1∶1比例合笼交配，次晨做阴道涂片检查阳性记为受孕，取孕13 d的C57BL/6胎鼠，将其躯干剪碎放于培养皿中，加入0.05%胰蛋白酶消化，5 min后终止消化，反复多次至组织块完全消化，1 500 r/min离心10 min，收集细胞制成细胞悬液，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中常规培养，1∶4传代，取第3代细胞加入10 mg/L丝裂霉素Ｃ处理3 h，PBS洗涤细胞，将细胞以5×10⁴/cm²的密度接种于预先涂有1%明胶的培养皿底部制成细胞饲养层备用。

1.4.3 慢性肝损伤模型小鼠诱导性多能干细胞的制备 慢性肝损伤造模开始注射四氯化碳第1周后，无菌条件下，局麻后取24只HBV转基因小鼠背部1 cm²皮肤2块，剪除皮下组织，放入预冷的含有200 U/mLⅠ型胶原酶、300 U/mL透明质酸酶的DMEM培养基中4 ℃消化12 h，随后加入同体积的0.25%胰蛋白酶室温消化，20 min后终止消化，1 500 r/min离心5 min，收集细胞接种于培养瓶中，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中常规培养，1︰2传代，取第2代细胞经携带OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC cDNAs的慢病毒转染48 h；将转染后的细胞接种到预先制备的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，用DMEM培养液培养7 d，换用Knockout DMEM培养基继续培养，约21 d出现克隆样结构后，机械分离法分离克隆，收集细胞进行传代和鉴定。

1.4.4 慢性肝损伤模型小鼠诱导性多能干细胞的鉴定 ①细胞免疫荧光检测：收集细胞，预冷40 g/L多聚甲醛固定10 min，0.3% Triton X-100进行细胞膜打孔，PBS漂洗3次，1%脱脂奶粉室温封闭30 min，分别加入OCT4(工作浓度1∶100)、NANOG(工作浓度1∶50)和SSEA-1(工作浓度1∶100)单克隆抗体和β-actin多克隆抗体(工作浓度1∶500)，4 ℃过夜，次晨取出，室温平衡30 min，PBS漂洗3次，滴加FITC标记的荧光二抗，室温避光孵育30 min，DAPI(工作浓度1∶1 000)染核内DNA 10 min，荧光显微镜下观察并摄片；②体外分化能力检测：收集第5代细胞，将1×10⁵细胞接种于6孔培养板的各孔中，悬浮培养10 d，倒置相差显微镜观察拟胚体形成情况。

1.4.5 诱导性多能干细胞移植与分组 将慢性肝损伤HBV转基因小鼠随机分为2组，每组12只，造模结束后第2天进行干预。①对照组：10%水合氯醛麻醉小鼠，无菌条件下做腹正中切口，充分暴露门静脉主干，用胰岛素注射用针抽取0.1 mL PBS缓慢注射于小鼠门静脉主干内，压迫注射点至无明显渗血，庆大霉素注射液冲洗腹腔，逐层关腹；②实验组：将第3代诱导性多能干细胞用荧光染料CFSE在37 ℃温箱孵育30 min进行荧光标记，移植方法同对照组，取0.1 mL细胞浓度为2×10⁸ L^-1的诱导性多能干细胞悬液进行移植注射。

1.4.6 冰冻切片观察诱导性多能干细胞在肝脏中的定植 移植后7 d和14 d，每组分别处死5只小鼠，切取1.0 cm³肝组织块用冰冻切片机连续切片，制成3 μm超薄切片，荧光显微镜下观察并摄片，剩余肝脏组织放入40 g/L多聚甲醛中固定，用于后续石蜡切片的制作。

1.4.7 ELISA法检测小鼠肝功能 移植后7 d和14 d，在处死小鼠之前，采用眼眶静脉丛采血法收集各组5只小鼠血液，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测小鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)水平，采用溴甲酚绿法检测血清白蛋白(serum albumin，ALB)水平，重氮法检测血清总胆红素(total bilirubin，TBIL)水平。

1.4.8 苏木精-伊红染色观察肝脏组织结构 移植后7 d和14 d，取上述用40 g/L多聚甲醛固定的肝组织，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切片、60 ℃烤片60 min、脱蜡、水合、苏木精染液染色5 min、自来水冲洗、伊红染液染色3 min、盐酸乙醇分化、脱水、透明、中性树胶封固、显微镜下观察并摄片。

1.5 主要观察指标 ①诱导性多能干细胞在肝脏中的定植情况；②血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、白蛋白和总胆红素水平；③肝脏组织病理学特征。

1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 22.0软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

慢性乙型肝炎是威胁人类健康的一种由HBV引起的慢性感染性疾病，长期反复炎症刺激导致肝纤维化，进而发展为不可逆的肝硬化乃至肝癌，这一连续的病理生理过程最终导致肝细胞大量坏死，肝细胞再生能力降低，肝脏功能失代偿进而肝衰竭，患者病死率极高^[18]。肝移植一直以来被认为是肝衰竭的标准治疗方法，但移植肝的来源不足、移植并发症多、成本高，严重限制了肝移植的应用^[19-20]。近年来，间充质干细胞移植已成为一种新的潜在治疗方法。虽然以往的研究表明，自体来源间充质干细胞移植到肝损伤患者体内可显著改善肝功能^[21]。但研究也证实，慢性HBV感染不仅影响自体来源间充质干细胞的生物学特性，还影响间充质干细胞体外培养的成功率，而且细胞的生长速度缓慢，细胞分泌活性物质的能力降低，移植效果也由此受影响^[22]。如果在体外通过基因编辑直接将骨髓间充质干细胞重编程为功能性肝细胞，则可提高HBV感染患者间充质干细胞的存活率和增殖效率^[23-24]。基于此，对于慢性乙型肝炎肝损伤患者而言，寻找其他来源的可塑性好的干细胞进行深入研究具有重要意义^[25]。随着基因编辑技术的发展，成体细胞经过重编程获得诱导性多能干细胞，来源更丰富，获取更容易，其类似于胚胎干细胞的多项分化潜能决定其优越的可塑性，奠定了其作为临床治疗应用的理想种子细胞的基础^[26-27]。

该研究拟将HBV转基因小鼠皮肤来源的成纤维细胞在体外重编程为诱导性多能干细胞，经鉴定不仅表达干细胞多能性的标志，还具有多向分化潜能，生长状态良好，增殖效率未受到影响。有学者将自体来源的骨髓间充质干细胞经肝动脉移植入感染HBV引发的肝衰竭患者，结果显示移植成功率达100%，患者肝功能有明显改善，未发生严重不良反应，但长期疗效并不理想^[28]。多项基础研究表明，肝细胞或干细胞的移植途径主要包括肝动脉、门静脉、腹腔内、脾内、肝内或尾静脉注射移植，经脾、腹腔内或尾静脉途径移植的细胞在肝内定植分化的数量存在较大争议；经门静脉移植是理想的植入途径，移植后由于门静脉高压导致的动物死亡率增高也可以通过控制注射细胞剂量和注射时间得以降低^[29]。于是，该研究采用门静脉途径进行移植，移植后14 d内无小鼠死亡，提示门静脉可作为有效的移植途径。

以往的研究显示，无论何种内脏器官发生损伤，体内的多种干细胞均会迁移到损伤部位，进行代偿性组织修复，即便是通过多种途径移植入体内的外源性干细胞也会归巢至病变部位，发挥与内源性干细胞相同的组织修复作用^[30]。该研究冰冻切片细胞示踪结果显示，经门静脉移植的诱导性多能干细胞通过肝血窦分散到肝脏各处，在移植后7 d内均可见到荧光标记的细胞，提示移植成功。HBV转基因小鼠肝脏经四氯化碳诱导的慢性损伤是全肝损伤，各部分肝小叶均有不同程度的破坏，故该研究发生定植的诱导性多能干细胞也是散在分布到全肝进行修复。为了进一步探讨诱导性多能干细胞的移植效果，实验同时从肝脏的组织结构与功能两方面进行观察，选取了谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、白蛋白、总胆红素等临床常用的肝功能血清学检测指标，结果显示，实验组血清中直接反映肝脏损伤程度的谷丙转氨酶和谷草转氨酶随着移植时间的延长逐渐降低，且明显低于对照组，同时反映肝细胞合成功能的白蛋白则随着时间延长而升高，实验组与对照组小鼠肝功能的差异提示移植诱导性多能干细胞确实明显改善了损伤肝脏的功能。此外，作为治疗效果评价“金标准”的组织学结果显示，实验组肝组织在移植后随着时间延长肝细胞的变性、坏死及炎细胞浸润均明显减轻，肝小叶开始重建，提示诱导性多能干细胞移植后可发挥损伤组织修复作用，与肝功能研究结果一致。

总之，该研究从组织结构与功能两方面证实了自体来源诱导性多能干细胞对HBV转基因小鼠慢性肝损伤的治疗作用，为基础实验研究与临床应用提供了理论基础。但该研究使用的小鼠慢性肝损伤模型是由化学物质诱导的，不能完全模拟HBV对肝脏的损伤，进一步寻找有效模拟HBV所致肝损伤的动物模型进行诱导性多能干细胞移植效果及机制研究可能为慢性HBV患者肝功能修复带来新的希望。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程