松脂醇二葡萄糖苷激活Wnt/β-catenin信号通路保护成骨细胞

doi:10.12307/2025.237

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (2): 339-346.doi: 10.12307/2025.237

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

松脂醇二葡萄糖苷激活Wnt/β-catenin信号通路保护成骨细胞

余鹏1，孟东方2，李慧英2，刘洪飞3，贺自克4

1河南中医药大学骨伤学院，河南省郑州市 450000；2河南中医药大学第一附属医院，河南省郑州市 450000；3辽宁中医药大学，辽宁省沈阳市110847；4河南省中医院，河南省郑州市 450000

收稿日期:2023-12-01 接受日期:2024-03-07 出版日期:2025-01-18 发布日期:2024-05-25
通讯作者: 李慧英，博士，教授，主任医师，博士生导师，河南中医药大学第一附属医院，河南省郑州市 450000
作者简介:余鹏，男，1992年生，河南省南阳市人，汉族，河南中医药大学在读博士，主要从事中医药防治骨关节及脊柱疾病方面的研究。共同第一作者：孟东方，男，博士，副主任医师，从事中医药防治骨关节及脊柱疾病的研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项(2021JDZY009，2023ZY2029)，项目负责人：李慧英；河南省中医药科学研究专项(2022JDZX123)，项目负责人：孟东方；河南省中医药科学研究专项(2021JDZX2024)，项目负责人：贺自克；河南中医药大学2022年度研究生科研创新类项目(2022KYCX084)，项目负责人：余鹏

Pinoresinol diglucoside activates the Wnt/beta-catenin signaling pathway to protect osteoblasts

Yu Peng1, Meng Dongfang2, Li Huiying2, Liu Hongfei3, He Zike4

1College of Orthopedics and Traumatology, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; 2The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China; 4Henan Provincial Hospital of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2023-12-01 Accepted:2024-03-07 Online:2025-01-18 Published:2024-05-25
Contact: Li Huiying, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Yu Peng, MD candidate, College of Orthopedics and Traumatology, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China Meng Dongfang, MD, Associate chief physician, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China Yu Peng and Meng Dongfang contributed equally to this work.
Supported by:
Henan Province Chinese Medicine Scientific Research Special Project, Nos. 2021JDZY009 (to LHY), 2023ZY2029 (to LHY), 2022JDZX123 (to MDF), and 2021JDZX2024 (to HZK); 2022 Graduate Student Scientific Research and Innovation Project of Henan University of Chinese Medicine, No. 2022KYCX084 (to YP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
成骨细胞：是参与骨组织形成、修复和调节的关键细胞类型，在骨组织形成和修复中起着重要作用。通过骨基质合成、骨矿化和骨代谢的调节来维持骨组织的结构与功能的稳态。
松脂醇二葡萄糖苷：作为一种天然化合物，属于松脂醇类的糖苷化合物，存在于多种植物中，是中药杜仲的质量标志物。具有抗氧化应激、抗炎抗菌和维持骨代谢平衡的作用。

背景：松脂醇二葡萄糖苷可以促进骨形成与骨基质的合成，加速骨组织修复，但其对成骨细胞的影响和作用机制仍需进一步探索。
目的：基于Wnt/β-catenin信号通路探讨松脂醇二葡萄糖苷对地塞米松干预成骨细胞的影响和作用机制。
方法：设置不同浓度的地塞米松组和松脂醇二葡萄糖苷组对成骨细胞干预24 h，筛选最佳干预浓度；使用地塞米松、松脂醇二葡萄糖苷和Wnt/β-catenin抑制剂XAV-939对成骨细胞进行干预，设置对照组、地塞米松组、抑制剂组、松脂醇二葡萄糖苷组、松脂醇二葡萄糖苷+抑制剂组。CCK-8法检测细胞活性，检测各组细胞碱性磷酸酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活性，Annexin V/PI染色与EdU法检测细胞凋亡与增殖情况，Real-Time qPCR检测Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达水平，Western Blot检测Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达水平。
结果与结论：①地塞米松和松脂醇二葡萄糖苷干预成骨细胞24 h后，发现浓度为10 μmol/L的地塞米松细胞抑制率为实验最佳干预浓度；松脂醇二葡萄糖苷浓度在100 μmol/L时，细胞增殖最为明显；②与地塞米松组比较，松脂醇二葡萄糖苷组的碱性磷酸酶活性显著增强(P < 0.05)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活性显著降低(P < 0.05)；Annexin V/PI染色和EdU法细胞增殖检测结果表明，松脂醇二葡萄糖苷可抑制地塞米松干预后成骨细胞的凋亡，促进成骨细胞增殖；③与地塞米松组和抑制剂组比较，松脂醇二葡萄糖苷组和松脂醇二葡萄糖苷+抑制剂组中Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)；④结果表明，松脂醇二葡萄糖苷可以抑制地塞米松干预后的成骨细胞凋亡，通过激活Wnt/β-catenin信号通路来保护成骨细胞活性，促进成骨细胞增殖，可能发挥延缓激素性股骨头坏死的作用。

https://orcid.org/0009-0005-3669-6358(余鹏)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 松脂醇二葡萄糖苷, 激素性股骨头坏死, 成骨细胞, 细胞活性, Wnt/β-catenin信号通路, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Pinoresinol diglucoside promotes bone formation and bone matrix synthesis and accelerates bone tissue repair. However, the mechanism of action and effects of this compound in osteoblasts need to be further explored.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of action of pinoresinol diglucoside on dexamethasone-treated osteoblasts based on the Wnt/β-catenin signaling pathway.
METHODS: Different concentrations of dexamethasone groups and pinoresinol diglucoside groups were set to treat osteoblasts for 24 hours, and the optimal intervention concentrations were screened. Osteoblasts were treated with dexamethasone, pinoresinol diglucoside and inhibitor XAV-939. Then, control group, dexamethasone group, XVA-939 group, pinoresinol diglucoside group, pinoresinol diglucoside+XVA-939 group were set up. Cell counting kit-8 assay was used to detect cell activity. Alkaline phosphatase activity and caspase3/7 enzyme activity in cells were detected. Annexin V/PI staining and EdU assay were used to detect cell apoptosis and proliferation. Real-time qPCR and western blot were used to detect the mRNA and protein expression levels of Wnt3a, β-catenin, c-myc, osteocalcin, and type I collagen, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: After dexamethasone and pinoresinol diglucoside intervened in osteoblasts for 24 hours, 10 μmol/L dexamethasone was found to be the optimal intervention concentration for cell inhibition, and cell proliferation was most pronounced at a concentration of pinoresinol diglucoside of 100 μmol/L. Compared with the dexamethasone group, alkaline phosphatase activity was significantly enhanced (P < 0.05) and caspase3/7 enzyme activity was significantly reduced (P < 0.05) in the pinoresinol diglucoside group. Annexin V/PI staining and cell proliferation assay by EdU method showed that pinoresinol diglucoside inhibited apoptosis and promoted proliferation of osteoblasts after dexamethasone intervention. The mRNA and protein expression levels of Wnt3a, β-catenin, c-myc, osteocalcin, and type I collagen were significantly higher in the pinoresinol diglucoside group and pinoresinol diglucoside+XVA-939 group compared with the dexamethasone and XVA-939 groups (P < 0.05). To conclude, pinoresinol diglucoside can inhibit osteoblast apoptosis after dexamethasone intervention, protect osteoblast activity and promote osteoblast proliferation by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway, which may play a role in delaying steroid-induced osteonecrosis of the femoral head .

Key words: pinoresinol diglucoside, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, osteoblast, cell activity, Wnt/β-catenin signaling pathway, cell proliferation, cell apoptosis

中图分类号:

余鹏, 孟东方, 李慧英, 刘洪飞, 贺自克. 松脂醇二葡萄糖苷激活Wnt/β-catenin信号通路保护成骨细胞[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(2): 339-346.

Yu Peng, Meng Dongfang, Li Huiying, Liu Hongfei, He Zike. Pinoresinol diglucoside activates the Wnt/beta-catenin signaling pathway to protect osteoblasts [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(2): 339-346.

图/表（结果） 11

2.1 确定地塞米松干预hFOB1.19成骨细胞浓度为了获取损伤程度20%细胞模型，不同浓度地塞米松对hFOB 1.19成骨细胞干预24 h后发现，随着地塞米松干预剂量的增加，成骨细胞的存活率逐渐降低。在浓度为10 μmol/L时，细胞存活率约为80%，即细胞活性抑制率为20%。因此选择地塞米松浓度为10 μmol/L且干预24 h作为后续实验的细胞造模条件(表2)。

2.2 不同浓度的PDG对hFOB1.19成骨细胞的影响为了筛选PDG干预成骨细胞的最佳浓度，使用1-200 μmol/L
之间5个不同梯度的PDG干预24 h。结果表明，不同浓度PDG干预24 h后，成骨细胞的活性均未降低。在
10 μmol/L浓度时，细胞开始出现明显增殖现象；且在100 μmol/L浓度时，细胞增殖最明显，见表3。因此选择100 μmol/L的PDG作为后续实验的干预用药。

2.3 PDG对地塞米松干预后成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响通过检测碱性磷酸酶活性发现，与对照组对比，地塞米松组成骨细胞的碱性磷酸酶活性明显减低(P < 0.05)；与地塞米松组对比，PDG组成骨细胞的碱性磷酸酶活性显著增高(P < 0.05)，见表4。表明PDG可以改善地塞米松干预后成骨细胞的碱性磷酸酶活性。

2.4 PDG对地塞米松干预后成骨细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性的影响通过检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性发现，与对照组对比，地塞米松组成骨细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性显著增高(P < 0.05)；与地塞米松组对比，PDG组成骨细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性显著降低(P < 0.05)，见表5。表明PDG可以降低地塞米松干预后成骨细胞的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性，抑制其凋亡。

2.5 PDG对地塞米松干预后成骨细胞凋亡的影响通过Annexin V/PI染色细胞凋亡实验发现，与对照组对比，地塞米松组在早期凋亡阶段和晚期凋亡阶段的凋亡细胞数均显著增多(P < 0.05)；与地塞米松组对比，PDG组在早期凋亡阶段和晚期凋亡阶段的凋亡细胞数均显著减少(P < 0.05)，见表6及图1。表明PDG可以明显抑制地塞米松

干预后成骨细胞的凋亡，保障成骨细胞的活性。
2.6 PDG对地塞米松干预后成骨细胞增殖的影响通过EdU法细胞增殖检测发现，与对照组对比，地塞米松组的EdU阳性细胞率显著降低(P < 0.05)；与地塞米松组对比，PDG组的EdU阳性细胞率显著增高(P < 0.05)，见表7及图2。表明PDG可以促进成骨细胞的增殖。

2.7 松脂醇二葡萄糖苷激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制成骨细胞凋亡
2.7.1 Real-Time qPCR检测相关 mRNA表达水平与对照组比较，除PDG组中骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05)，地塞米松组、抑制剂组和PDG+抑制剂组中的Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白 mRNA表达均显著降低(P < 0.05)；与地塞米松组比较，抑制剂组中Wnt3a mRNA表达水平无明显差异(P > 0.05)，β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白 mRNA表达水平均显著降低(P < 0.05)，PDG组和PDG+抑制剂组中的Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白 mRNA表达水平均显著升高(P < 0.05)；与抑制剂组比较，PDG组和PDG+抑制剂组中的Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白 mRNA表达水平均显著升高(P < 0.05)；与PDG组比较，PDG+抑制剂组中各指标的mRNA表达水平均无明显变化(P > 0.05)，见表8。
2.7.2 Western Blot检测相关蛋白的表达水平与对照组比较，除PDG组中骨钙素表达水平无明显差异外(P > 0.05)，地塞米松组、抑制剂组和PDG+抑制剂组中的Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白表达水平均显著降低(P < 0.05)；与地塞米松组比较，抑制剂组中Wnt3a、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白表达水平无明显差异(P > 0.05)，β-catenin、c-myc表达水平均显著降低(P < 0.05)，PDG组和PDG+抑制剂组中Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达水平均升高(P < 0.05)；

与抑制剂组比较，PDG组和PDG+抑制剂组中的蛋白表达量均显著升高(P < 0.05)；与PDG组比较，PDG+抑制剂组中的蛋白水平均无明显变化(P > 0.05)，见表9及图3。

参考文献

[1] CHANG C, GREENSPAN A, GERSHWIN ME. The pathogenesis, diagnosis and clinical manifestations of steroid-induced osteonecrosis. J Autoimmun. 2020;110:102460.
[2] MONT MA, SALEM HS, PIUZZI NS, et al. Nontraumatic Osteonecrosis of the Femoral Head: Where Do We Stand Today?: A 5-Year Update. J Bone Joint Surg Am. 2020;102(12):1084-1099.
[3] POWELL C, CHANG C, GERSHWIN ME. Current concepts on the pathogenesis and natural history of steroid-induced osteonecrosis. Clin Rev Allergy Immunol. 2011;41(1):102-113.
[4] KIM JM, LIN C, STAVRE Z, et al. Osteoblast-Osteoclast Communication and Bone Homeostasis. Cells. 2020;9(9):2073.
[5] SUN F, ZHOU JL, LIU ZL, et al. Dexamethasone induces ferroptosis via P53/SLC7A11/GPX4 pathway in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head. Biochem Biophys Res Commun. 2022;602: 149-155.
[6] 吴思敏,孙薇,高玉海,等.松脂醇二葡萄糖苷促进体外培养成骨细胞骨形成的作用研究[J].解放军医药杂志,2021,33(5):9-12.
[7] 黄星翔,钟超,叶华,等.基于Nrf2通路探讨松脂醇二葡萄糖苷改善小鼠骨质疏松的机制研究[J].中国临床解剖学杂志,2023,41(2): 162-171.
[8] 尚征亚,曹林忠,杨浩东,等.中医药调控Wnt/β-catenin信号通路治疗激素性股骨头坏死的研究进展[J].中国实验方剂学杂志, 2023,29(20):205-213.
[9] XU H, FANG L, ZENG Q, et al. Glycyrrhizic acid alters the hyperoxidative stress-induced differentiation commitment of MSCs by activating the Wnt/β-catenin pathway to prevent SONFH. Food Funct. 2023;14(2): 946-960.
[10] XIE D, ZHENG GZ, XIE P, et al. Antitumor activity of resveratrol against human osteosarcoma cells: a key role of Cx43 and Wnt/β-catenin signaling pathway. Oncotarget. 2017;8(67):111419-111432.
[11] 闫玉珠,于燕,刘俊叶,等.酒精性和激素性股骨头坏死的外周血脂质组学分析[J].中南大学学报(医学版),2022,47(7):872-880.
[12] 孔智恒, 李树山, 王海涛,等.激素性股骨头坏死来源的细胞外囊泡对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].中华实验外科杂志, 2022,39(8):1545-1548.
[13] 田心保, 林瑞珠, 朱宁.激素性股骨头缺血性坏死的发病机制[J].中国矫形外科杂志,2022,30(10):915-919.
[14] CUI Q, JO WL, KOO KH, et al. ARCO Consensus on the Pathogenesis of Non-traumatic Osteonecrosis of the Femoral Head. J Korean Med Sci. 2021;36(10):e65.
[15] CAI T, CHEN S, WU C, et al. Erythropoietin suppresses osteoblast apoptosis and ameliorates steroid-induced necrosis of the femoral head in rats by inhibition of STAT1-caspase 3 signaling pathway. BMC Musculoskelet Disord. 2023;24(1):894.
[16] DIRCKX N, MOORER MC, CLEMENS TL, et al. The role of osteoblasts in energy homeostasis. Nat Rev Endocrinol. 2019;15(11):651-665.
[17] 张鑫,张晓峰,徐西林,等.激素对H型血管的抑制作用与骨质疏松症发病的探讨[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(5):706-712.
[18] HUANG C, WEN Z, NIU J, et al. Steroid-Induced Osteonecrosis of the Femoral Head: Novel Insight Into the Roles of Bone Endothelial Cells in Pathogenesis and Treatment. Front Cell Dev Biol. 2021;9:777697.
[19] 刘聪,郭非非,肖军平,等.杜仲不同部位化学成分及药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2020,45(3):497-512.
[20] WANG Y, ZHANG J, WANG L, et al. Twelve-component pharmacokinetic study of rat plasma after oral administration of You-Gui-Wan in osteoporosis rats with kidney-yin deficiency and kidney-yang deficiency. Biomed Chromatogr. 2023;37(6):e5619.
[21] 谢高倩,高玉海,魏朋,等.松脂醇二葡萄糖苷对青年大鼠骨代谢的影响[J].中国药理学通报,2022,38(12):1785-1790.
[22] LEE JH, WEI YJ, ZHOU ZY, et al. Efficacy of the herbal pair, Radix Achyranthis Bidentatae and Eucommiae Cortex, in preventing glucocorticoid-induced osteoporosis in the zebrafish model. J Integr Med. 2022;20(1):83-90.
[23] DE VRIES TJ, KLEEMANN AS, JIN J, et al. The Differential Effect of Metformin on Osteocytes, Osteoblasts, and Osteoclasts. Curr Osteoporos Rep. 2023;21(6):743-749.
[24] VLASHI R, ZHANG X, WU M, et al. Wnt signaling: Essential roles in osteoblast differentiation, bone metabolism and therapeutic implications for bone and skeletal disorders. Genes Dis. 2023;10(4): 1291-1317.
[25] MOORER MC, RIDDLE RC. Regulation of Osteoblast Metabolism by Wnt Signaling. Endocrinol Metab (Seoul). 2018;33(3):318-330.
[26] OTON-GONZALEZ L, MAZZIOTTA C, IAQUINTA MR, et al. Genetics and Epigenetics of Bone Remodeling and Metabolic Bone Diseases. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1500.
[27] LIU J, XIAO Q, XIAO J, et al. Wnt/β-catenin signalling: function, biological mechanisms, and therapeutic opportunities. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):3.
[28] RONG X, KOU Y, ZHANG Y, et al. ED-71 Prevents Glucocorticoid-Induced Osteoporosis by Regulating Osteoblast Differentiation via Notch and Wnt/β-Catenin Pathways. Drug Des Devel Ther. 2022;16:3929-3946.
[29] MIZOKAMI A, KAWAKUBO-YASUKOCHI T, HIRATA M. Osteocalcin and its endocrine functions. Biochem Pharmacol. 2017;132:1-8.
[30] CAMOZZI V, TOSSI A, SIMONI E, et al. Role of biochemical markers of bone remodeling in clinical practice. J Endocrinol Invest. 2007;30(6 Suppl):13-17.
[31] DEPALLE B, MCGILVERY CM, NOBAKHTI S, et al. Osteopontin regulates type I collagen fibril formation in bone tissue. Acta Biomater. 2021; 120:194-202.
[32] XUE Z, WANG X, XU D. Molecular investigations of the prenucleation mechanism of bone-like apatite assisted by type I collagen nanofibrils: insights into intrafibrillar mineralization. Phys Chem Chem Phys. 2022; 24(31):18931-18942.
[33] FERRARO V, GAILLARD-MARTINIE B, SAYD T, et al. Collagen type I from bovine bone. Effect of animal age, bone anatomy and drying methodology on extraction yield, self-assembly, thermal behaviour and electrokinetic potential. Int J Biol Macromol. 2017;97:55-66.

引言

激素性股骨头坏死是因长期或者短期内大剂量使用类固醇激素，导致股骨头周围和股骨头内血管受损、血运减少甚至中断引起的一系列骨骼病理变化，最终导致股骨头坏死、塌陷，该病具有发病隐匿、进展迅速、致残率高的特点[1-2]。股骨头内骨形成与骨吸收平衡被打破引起的骨代谢失衡是股骨头坏死过程中重要的病理现象，具体表现为骨形成减少和骨吸收增加[1，3]。成骨细胞在骨形成过程中扮演着关键角色，保障成骨细胞活性可以维持骨形成，调节骨代谢平衡[4]。此外，地塞米松可以导致成骨细胞凋亡，引起激素性股骨头坏死的发生[5]。
松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)是一种天然的植物化合物，属于木脂素类化合物。PDG可以增强成骨细胞中碱性磷酸酶活性，提高骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2的表达，促进成骨细胞的分化与形成[6]。研究表明，PDG可减轻激素干预下成骨细胞中氧化应激反应，降低成骨细胞损伤，保护成骨细胞活性[7]。同时，Wnt/β-catenin信号通路在调节成骨细胞活性、增强骨形成和提高骨密度方面发挥着重要作用[8]。研究表明，激素性股骨头坏死的病理变化过程与该通路的异常变化密切相关[9]，大剂量激素的应用抑制了β-catenin的入核，降低了下游相关因子的转录，从而加重了激素性股骨头坏死的发展[10]。因此，PDG与Wnt/β-catenin信号通路在保护成骨细胞活性、维持骨代谢平衡和缓解激素性股骨头坏死发展过程中均扮演着重要角色。
目前，PDG是否可以通过Wnt/β-catenin信号通路发挥降低成骨细胞凋亡、保护成骨细胞活性的作用尚未明确。因而，此次研究拟通过地塞米松干预成骨细胞，观察PDG调控Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的作用机制，探究PDG防治激素性股骨头坏死潜在的可能作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，组间比较通过单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年7-10月在河南中医药大学第一附属医院中心实验室和郑州点睛科技有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与药物此次研究选用SV40转染人成骨细胞hFOB 1.19(货号：FH0117)，购自上海富衡生物科技有限公司。地塞米松(D8040，北京索莱宝科技有限公司)，PDG(B21213，上海源叶生物科技有限公司)。该文章撰写遵守了国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
1.3.2 试剂 DMEM/F12培养基(8123265，赛默飞世尔科技公司)，胎牛血清(FSP500，依科赛生物科技(太仓)有限公司)，青链霉素(P1400，北京索莱宝科技有限公司)，1×PBS(P1020，北京索莱宝科技有限公司)，G418(G8160，北京索莱宝科技有限公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300，北京索莱宝科技有限公司)，胰蛋白酶消化液(T1350，北京索莱宝科技有限公司)，无血清细胞冻存液(FH7001，上海富衡生物科技有限公司)，CCK-8试剂(GK10001，上海宏叶生物科技有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(E-BC-K091-M，E-CK-A383，E-CK-A211，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，BeyoClick™ EdU-555细胞增殖检测试剂盒(C0075S，上海碧云天生物技术有限公司)，TRIZOL、Surescript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit、BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0 (QP020，QP056，QP031，美国GeneCopoeia公司)，RIPA总蛋白裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒(P0013D，P1046，P0012A，P0018M，上海碧云天生物技术有限公司)，BCA蛋白质浓度测定试剂盒[A53225，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，柯达医用X射线胶片(XBT-1，美国伊士曼柯达公司)，抗体GAPDH(ab8245，英国Abcam公司)，抗体Wnt3a、β-catenin和c-myc(bs-23278R，bs-1165R，bs-4963R，北京博奥森生物技术有限公司)，抗体骨钙素(A6205，武汉爱博泰克生物科技有限公司)，抗体Ⅰ型胶原蛋白(66761-1-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司)。
1.3.3 仪器细胞培养箱(WJ-160A-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造公司)，超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司)，离心机(TGL-16c，上海安亭科学仪器厂)，酶标仪(DR-200Bs，无锡华卫德朗仪器有限公司)，荧光定量PCR仪(7900HT Fast Real-Time PCR System，美国应用生物系统公司)，高速冷冻型微量离心机[D3024R，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司]，电泳仪(DYY-6C，北京六一生物科技有限公司)，扫描仪[L4158，爱普生(中国)有限公司]，化学发光仪(JS-1070P，上海培清科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养与传代取5 mL胎牛血清，500 μL青链霉素，0.3 mg/mL G418和DMEM/F12培养基，混匀后配置成为50 mL的10%完全培养基，放置到4 ℃冰箱备用。细胞培养箱的培养环境为37 ℃、体积分数5%CO2、95% AIR。hFOB 1.19成骨细胞用T25培养瓶进行培养，每个T25培养瓶含有4-6 mL完全培养基。根据细胞生长情况，培养2-4 d，待细胞在培养瓶中铺满到80%以上时，蛋白胰酶消化，离心机离心(900×g，5 min)，进行传代。
1.4.2 CCK-8实验将hFOB 1.19成骨细胞接种于96孔板内，6×103个/孔，共铺设2个96孔板。将96孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。设置地塞米松组别浓度(0，1，10，100，200，300 μmol/L)和PDG组别浓度(0，1，10，50，100，200 μmol/L)。根据不同组别浓度加药，每组设置6个复孔，放入培养箱中培养24 h。随后每孔加入10 μL CCK-8试剂，放入培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定96孔板在450 nm处的吸光度，获取吸光度(A)值。根据A值计算不同浓度干预药物的细胞活性，确定最佳干预浓度。
1.4.3 细胞中碱性磷酸酶活性检测将hFOB 1.19成骨细胞接种于6孔板内，2×105个/孔，共铺设2个6孔板。将6孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。设置组别为对照组、地塞米松组、PDG组。对照组仅加入完全培养基；地塞米松组为完全培养基中加入浓度为10 μmol/L的地塞米松，PDG组为完全培养基中加入浓度为10 μmol/L的地塞米松和浓度为100 μmol/L PDG。每组设置3个复孔，加药结束后，放入培养箱中培养24 h。用胰酶(不含EDTA和酚红)对细胞进行消化，收集细胞，参照碱性磷酸酶比色法检测方法严格操作。最后用酶标仪测定在520 nm处的A值，分析每组碱性磷酸酶的活力值。
1.4.4 细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活性检测将hFOB 1.19成骨细胞接种于6孔板内，2×105个/孔，共铺设2个6孔板。将6孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。设置组别为对照组、地塞米松组、PDG组，参照“1.4.3”中组别干预方法。每组设置3个复孔，加药结束后，放入培养箱中培养24 h。用胰酶(不含EDTA和酚红)对细胞进行消化，收集细胞，PBS重悬细胞并计数。参照半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性试剂盒检测方法严格操作，通过考马斯亮蓝(Bradford)法检测每组细胞的蛋白浓度。用酶标仪测定样本在405 nm处的A值，分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活力。
1.4.5 细胞凋亡实验将hFOB 1.19成骨细胞接种于6孔板内，2×105个/孔，共铺设2个6孔板。将6孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。设置组别为对照组、地塞米松组、PDG组，参照“1.4.3”中组别干预方法。每组设置3个复孔，加药结束后，放入培养箱中培养24 h。
随后，收集细胞上清，胰酶(不含EDTA和酚红)对细胞进行消化，消化完毕后，PBS清洗，吹打混匀，细胞计数。取1×105重悬细胞，进行离心(300×g，5 min)，反复2次后，弃细胞上清，获取离心后的细胞沉淀。随后根据Annexin V试剂盒进行操作，加入500 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC Reagent和Annexin V-PI Reagent，涡旋混匀，室温下避光孵育20 min。随后使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。
1.4.6 细胞增殖实验将hFOB 1.19成骨细胞接种于6孔板内，2×105个/孔，共铺设2个6孔板。将6孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。设置组别为对照组、地塞米松组、PDG组，参照“1.4.3”中组别干预方法。每组设置3个复孔，加药结束后，放入培养箱中培养24 h。参照碧云天EdU-555细胞增殖检测方法严格操作，每孔中加入1 mL EdU工作液，培养箱中继续孵育2 h后，40 g/L多聚甲醛室温下固定15 min，用3%BSA的PBS清洗3次，5 min/次，用0.3% Triton X-100的PBS室温孵育15 min，3%BSA的PBS清洗2次，加入EdU反应液，室温避光孵育30 min，3% BSA的PBS清洗3次，加1× Hoechst 33342溶液，室温避光下孵育10 min，随后进行荧光拍照检测。通过Image J软件计算EdU阳性细胞比率(EdU阳性细胞数/总细胞数×100%)。
1.4.7 细胞分组将hFOB 1.19成骨细胞接种于6孔板内，细胞悬液2 mL/孔，2×105个/孔，将6孔板放置于培养箱中24 h，使细胞完全贴壁。将细胞分为对照组、地塞米松组(10 μmol/L地塞米松)、抑制剂组(10 μmol/L地塞米松，1 μmol/L XAV-939)、PDG组(10 μmol/L地塞米松，100 μmol/L PDG)、PDG+抑制剂组(10 μmol/L地塞米松，100 μmol/LPDG，1 μmol/L XAV-939)，共5组，每组3个复孔。
1.4.8 Real-Time qPCR检测成骨细胞相关mRNA表达检测不同组别细胞中Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA表达。干预后的细胞采用TRIzol法处理，提取总RNA。根据Surescript™ First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，反应条件为37 ℃，60 min，85 ℃，5 min。引物由华大基因合成，详见表1。使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH为内参，反应条件为变性：95 ℃，10 s；退火：60 ℃，20 s；延伸：72 ℃，15 s；进行40个循环。最后，采用2-ΔΔCt法计算相关mRNA表达量，通过Graphpad软件对数据行进统计分析。

1.4.9 Western Blot检测成骨细胞相关蛋白的表达检测不同组别细胞中Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白的蛋白表达。干预后的细胞加入RIPA裂解液(加入蛋白酶抑制剂)提取总蛋白。根据BCA法检测样本蛋白浓度，通过十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)胶电泳分离蛋白，将其转到PVDF膜上，丽春红试剂进行染色，封闭液室温下封闭1 h。加入GAPDH(1∶6 000)，Wnt3a (1∶2 000)，β-catenin(1∶2 000)，c-myc(1∶2 000)，骨钙素(1∶1 000)，Ⅰ型胶原蛋白(1∶5 000)在4 ℃下孵育过夜。加入二抗(1∶10 000)，室温孵育。通过化学发光法对胶片条带进行显影，GAPDH为内参，利用Image J软件处理分析目标条带的灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值作为目标蛋白相对表达量的吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①地塞米松和PDG干预成骨细胞细胞的最佳浓度；②各组成骨细胞的碱性磷酸酶活性与细胞增殖水平；③各组成骨细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7酶活性和细胞凋亡水平；④每组成骨细胞中Wnt3a、β-catenin、c-myc、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白 mRNA和蛋白表达水平。
1.6 统计学分析所有数据采用x±s来表示，通过SPSS 29.0软件进行统计分析。组间比较通过单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。此次研究采用的统计学方法已通过河南中医药大学统计学专家审核。

讨论

在非创伤性股骨头坏死中的发病因素中，激素和酒精是常见的两大诱因[11]。由于激素的广泛应用，激素性股骨头坏死已成为非创伤性股骨头坏死的主要类型[12]。研究表明，激素性股骨头坏死发病的年龄阶段主要集中在中壮年时期，好发于双侧，给患者及社会带来了很大负担[13]。现代医学对于激素性股骨头坏死的病理机制研究尚未完全明确，提出了众多机制学说[1]。但最终均因激素的应用导致股骨头内骨吸收与骨形成的骨代谢平衡被打破，出现股骨头内局部坏死、塌陷的病理表现[14]。
成骨细胞作为维持骨形成的关键环节，激素的应用会导致成骨细胞的异常活动，影响骨基质的合成，降低骨密度，增加骨折风险[15]。而成骨细胞凋亡的增加会导致骨细胞数量的降低，破坏了正常骨组织代谢和修复过程[16]。此外，成骨细胞与股骨头内微血管形成密切相关，成骨细胞的异常功能可能导致股骨头内血管供应的异常，加剧股骨头缺血和坏死的程度[17-18]。因此，维持成骨细胞活性、降低成骨细胞凋亡率对于防治激素性股骨头坏死具有重要意义。此次研究通过不同浓度地塞米松干预成骨细胞发现，随着地塞米松剂量的增加，成骨细胞的凋亡率也随之增高，表明激素可以导致成骨细胞凋亡。
PDG作为中药杜仲的质量标志物[19]，在增加骨量、减少骨流失、防治骨质疏松方面发挥着重要作用[20]。研究表明，PDG可以增加大鼠骨小梁数量，提高骨密度，同时上调骨形态发生蛋白2 和Runt相关转录因子2的表达，下调骨保护素的表达，调节骨代谢的平衡[21]。同时，PDG可以降低地塞米松导致的斑马鱼椎体面积的减少，并提高了碱性磷酸酶活性和骨形成蛋白1的表达[22]。此次研究通过CCK-8细胞活性实验发现，PDG可以增强成骨细胞活性，促进其增殖。此外，碱性磷酸酶作为成骨细胞的主要标志物之一，参与骨基质矿化过程，反映成骨细胞的活性[23]。此次研究通过对成骨细胞中碱性磷酸酶活性的检测与细胞增殖实验发现PDG显著改善地塞米松诱导的成骨细胞中碱性磷酸酶活性降低，增强成骨细胞活性，促进成骨细胞增殖。此外，细胞凋亡实验和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7检测结果表明PDG可以降低地塞米松对成骨细胞的影响，发挥抗凋亡作用，保护成骨细胞活性。
Wnt/β-catenin信号通路是促进成骨细胞增殖与分化的重要通路之一，在减轻激素对成骨细胞损伤、维持骨代谢平衡与骨重建方面扮演着重要角色[24-26]。Wnt/β-catenin信号通路激活后，可以增加β-catenin的入核表达，激活下游相关转录因子和成骨相关基因的表达[27]。XAV-939作为该通路的抑制剂，通过增加Axin的稳定性来促进β-catenin的降解，降低入核表达，抑制信号通路的活性[28]。此次研究通过增加Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂XAV-939干预成骨细胞，来验证PDG是否通过Wnt/β-catenin信号通路来作用于成骨细胞。研究结果表明，PDG可以促进β-catenin的入核表达，减轻XAV-939对β-catenin转录的抑制作用，激活Wnt/β-catenin信号通路，发挥抗凋亡作用。骨钙素作为成骨细胞分泌蛋白，参与调节骨骼的形成与维持，在骨代谢方面发挥着重要作用[29]。Ⅰ型胶原蛋白是骨组织中最主要的胶原蛋白，构成了骨基质的主要成分，成骨细胞通过合成和分泌Ⅰ型胶原蛋白，促进新骨的形成[30-33]。此次研究发现PDG可以促进骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白表达，表明PDG可以降低地塞米松对成骨细胞的抑制作用，保障成骨细胞活性，促进其增殖。
综上所述，此次研究发现PDG可以减轻地塞米松对成骨细胞凋亡的影响，可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，保证成骨细胞活性，上调骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白表达，促进成骨细胞的增殖。
然而此次研究仍存在一定不足，只进行了体外细胞实验研究，仍需建立激素性股骨头坏死动物模型，通过体内实验验证PDG激活Wnt/β-catenin信号通路发挥保护成骨细胞活性、延缓激素性股骨头的作用机制，此外，更详细的调控机制仍待进一步探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

松脂醇二葡萄糖苷激活Wnt/β-catenin信号通路保护成骨细胞

Pinoresinol diglucoside activates the Wnt/beta-catenin signaling pathway to protect osteoblasts

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 11

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	韩海慧, 冉磊, 孟晓辉, 辛鹏飞, 向峥, 边艳琴, 施杞, 肖涟波. 靶向成纤维细胞生长因子受体1信号改善类风湿关节炎的骨破坏[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1905-1912.
[2]	赵济宇, 王少伟. 叉头框转录因子O1信号通路与骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(9): 1923-1930.
[3]	尹路, 蒋川锋, 陈俊杰, 易明, 王子赫, 石厚银, 汪国友, 沈骅睿. 沙苑子苷A对关节软骨细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1541-1547.
[4]	朱汉民, 王松, 肖文琳, 张文静, 周茜, 何烨, 李微, . 线粒体自噬调控骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1676-1683.
[5]	迟文鑫, 张存鑫, 高凯, 吕超亮, 张科峰. 川陈皮素抑制BV2小胶质细胞炎症反应的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1321-1327.
[6]	胡涛涛, 刘兵, 陈诚, 殷宗银, 阚道洪, 倪杰, 叶凌霄, 郑祥兵, 严敏, 邹勇. 过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进小鼠皮肤创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1343-1349.
[7]	刘琪, 李林臻, 李玉生, 焦泓焯, 杨程, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1371-1379.
[8]	艾克帕尔·艾尔肯, 陈晓涛, 吾凡别克·巴合提. 成骨诱导人牙周膜干细胞来源外泌体促进炎症微环境下人牙周膜干细胞成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1388-1394.
[9]	朗么磋, 张义林, 汪莉. miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体影响牙槽骨成骨细胞增殖及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(5): 899-907.
[10]	肖放, 黄雷, 王琳. 磁性纳米材料与磁场效应加速骨损伤修复[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(4): 827-838.
[11]	韩杰, 潘成镇, 尚昱志, 张驰. 激素性股骨头坏死免疫诊断标志物的鉴定与药物筛选[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7690-7700.
[12]	柳承源, 过倩萍. Kartogenin对大鼠和兔源骨髓间充质干细胞成软骨与成骨分化的差异性影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7490-7498.
[13]	方源, 钱智勇, 何源哈达, 王海燕, 沙丽蓉, 李筱贺, 刘婧, 贺雅超, 张凯, 特木日巴根. 蒙药蓝刺头对血管内皮细胞增殖和血管生成能力的潜在作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(35): 7519-7528.
[14]	石彤彤, 邓荣霞, 张建光. 天然提取与人工合成羟基磷灰石颗粒理化性能及刺激胶原蛋白分泌的差异[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7278-7285.
[15]	尹航, 宋奎. 藏红花素水凝胶对软骨细胞与MC3T3-E1细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(34): 7293-7300.