基于人工神经网络骨关节炎诊断模型的建立与分析

doi:10.12307/2024.294

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2550-2554.doi: 10.12307/2024.294

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基于人工神经网络骨关节炎诊断模型的建立与分析

范以东1，秦刚2，苏国威1，肖世富1，刘俊良1，李威材1，吴广涛1

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530000；2广西中医药大学第一附属医院骨病创伤骨科，广西壮族自治区南宁市 530022

收稿日期:2023-02-28 接受日期:2023-05-08 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-31
通讯作者: 秦刚，博士，主任医师，广西中医药大学第一附属医院骨病创伤骨科，广西壮族自治区南宁市 530022
作者简介:范以东，男，1993年生，河南省辉县市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事骨关节退变与缺血性疾病的防治研究。
基金资助:
广西自然科学基金(2020JJA140375)，项目负责人：秦刚；广西中医药大学校级科研创新项目(YCSY2022028)，项目负责人：范以东

Establishment and analysis of osteoarthritis diagnosis model based on artificial neural networks

Fan Yidong1, Qin Gang2, Su Guowei1, Xiao Shifu1, Liu Junliang1, Li Weicai1, Wu Guangtao1

1Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Osteoarthropathy, Traumatic Orthopedics, and Femoral Head Necrosis Specialty, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-02-28 Accepted:2023-05-08 Online:2024-06-08 Published:2023-07-31
Contact: Qin Gang, MD, Chief physician, Osteoarthropathy, Traumatic Orthopedics, and Femoral Head Necrosis Specialty, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530022, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Fan Yidong, Master candidate, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2020JJA140375 (to QG); Scientific Research Innovation Project of Guangxi University of Chinese Medicine, No. YCSY2022028 (to FYD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

人工神经网络：是基于生物学中神经网络的基本原理，以网络拓扑知识为理论基础，模拟人脑神经系统对复杂信息的处理机制的一种数学模型。
机器学习：是一门专注于计算机如何从数据中学习的科学学科，位于统计学和计算机科学的交叉点，可以应用于临床数据集，以开发强大的风险模型并重新定义患者类别。

背景：生物信息学领域的快速发展为骨关节炎的诊断提供了新的方法。人工神经网络具有强大的数据计算能力和分类能力，研究表明其在诊断疾病方面表现出了较好的性能。

目的：旨在使用人工神经网络建立一种新的骨关节炎诊断预测模型，并通过外部数据集验证其在骨关节炎中的诊断价值。
方法：通过GEO数据库搜索下载符合要求的骨关节炎相关数据集，将其分为Train组与Test组。对Train组的基因表达矩阵进行差异分析，筛选差异表达基因。对差异基因进行GO、KEGG富集分析；通过Lasso回归模型、支持向量机模型、随机森林树模型从差异基因中进一步鉴定骨关节炎关键基因。随后使用R软件“neuralnet”包构建基于人工神经网络的骨关节炎诊断模型，5折交叉验证评估模型表现；使用Test组中2个独立的数据集来验证其诊断效果。

结果与结论：通过差异分析共得到90个与骨关节炎相关的差异基因，其中33个下调，57个上调。GO富集分析显示其生物过程主要参与白细胞介导的免疫、骨髓白细胞迁移、趋化因子产生等过程；KEGG富集显示差异基因主要富集在类风湿关节炎、白细胞介素17信号通路、破骨细胞分化等通路。通过3种机器学习方法筛选并取交集后共得到5个诊断骨关节炎的关键基因，分别为HMGB2、GADD45A、SLC19A2、TPPP3、FOLR2。Train组中5个关键基因建立的人工神经网络模型显示其准确率为96.36%，曲线下面积(AUC)为0.997，对神经网络模型的5折交叉验证表明其平均AUC > 0.9，具有一定的稳健性；Test组中2个独立的数据集结果显示其AUC分别为0.814和0.788。提示：建立的人工神经网络骨关节炎诊断模型具有一定的诊断价值。

https://orcid.org/0009-0000-3044-7311(范以东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 诊断模型, 人工神经网络, 机器学习

Abstract: BACKGROUND: Rapid developments in the field of bioinformatics have provided new methods for the diagnosis of osteoarthritis. Artificial neural networks have powerful data computing and classification capabilities, which have shown better performance in disease diagnosis.
OBJECTIVE: To establish a new diagnostic predictive model of osteoarthritis based on artificial neural network and to verify the diagnostic value of the model in osteoarthritis with an external dataset.
METHODS: The eligible osteoarthritis-related data sets were downloaded through GEO database search and divided into Train group and Test group. The gene expression matrix of the Train group was analyzed to screen the differentially expressed genes. GO and KEGG enrichment analyses were performed on the differentially expressed genes. Through Lasso regression model, support vector machine model and random forest tree model, the key genes of osteoarthritis were further identified from the differentially expressed genes. The R software “Neuralnet” package was then used to construct the osteoarthritis diagnosis model based on artificial neural network, and the model performance was evaluated by the five-fold cross-validation. Two independent data sets in the Test group were used to verify their diagnostic results.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 90 differentially expressed genes related to osteoarthritis were obtained by differential analysis, of which 33 were down-regulated and 57 were up-regulated. GO enrichment analysis showed that the differentially expressed genes were mainly involved in the following biological processes, including leukocyte-mediated immunity, leukocyte migration in bone marrow and chemokine production. KEGG enrichment analysis showed that these genes were mainly enriched in rheumatoid arthritis, interleukin-17 signaling pathway and osteoclast differentiation pathway. Five key genes for the diagnosis of osteoarthritis, HMGB2, GADD45A, SLC19A2, TPPP3 and FOLR2, were identified by three machine learning methods. The artificial neural network model of five key genes in the Train group showed that the accuracy was 96.36% and the area under the curve was 0.997. The five-fold cross validation of the neural network model showed that the average area under the curve was greater than 0.9 and the model was of robustness. Two independent data sets in the Test group showed its area under the curve was 0.814 and 0.788 respectively. Therefore, the establishment of an artificial neural network model for the diagnosis of osteoarthritis has a certain diagnostic value.

Key words: osteoarthritis, diagnostic model, artificial neural network, machine learning

中图分类号:

范以东, 秦刚, 苏国威, 肖世富, 刘俊良, 李威材, 吴广涛. 基于人工神经网络骨关节炎诊断模型的建立与分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2550-2554.

Fan Yidong, Qin Gang, Su Guowei, Xiao Shifu, Liu Junliang, Li Weicai, Wu Guangtao. Establishment and analysis of osteoarthritis diagnosis model based on artificial neural networks[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2550-2554.

图/表（结果） 10

2.1 骨关节炎差异基因的筛选结果首先利用PCA分析可视化Train组批次矫正前后的数据分布情况。图1A示未校正前不同芯片数据之间距离较大，图1B示校正后芯片间数据较为集中，有利于进行后续分析。对Train组中的正常样本及骨关节炎样本进行差异分析，共得到90个DEGs，其中33个下调，57个上调，绘制火山图，见图2A。对上调和下调最显著的前10个基因进行可视化，绘制热图，见图2B。

2.2 GO与KEGG富集分析结果通过R软件对90个差异基因进行GO富集分析。其中生物过程主要参与白细胞介导的免疫、外部封装结构组织、骨髓白细胞迁移、趋化因子产生等过程。细胞成分显示主要构成含胶原蛋白的细胞外基质、网格蛋白被膜小泡、主要组织相容性复合物(MHC)蛋白等。分子功能上与酰胺结合、丝氨酸水解酶活性、免疫受体活性等密切相关，见图3。

在Metascape数据库中对差异表达基因进行KEGG富集分析。结果显示，其主要在类风湿关节炎、白细胞介素17信号通路、破骨细胞分化、PPAR信号通路、补体和凝血级联等通路中富集，见图4。

2.3 机器学习筛选骨关节炎关键基因结果通过Lasso回归算法，得到10倍交叉验证误差最小的点对应的12个关键基因，见图5A。SVM-RFE算法中，关键基因筛选用“svmRadial”方法，抽样方法为“cv”，当交叉验证的标准误差(RMSE)最小为0.296时，共得到37个关键基因，见图5B。随机森林树算法中，首先计算1-500棵树的袋外误差率(OOB eror)，选择错误率低、稳定性好的树的数目作为最优树数，结果显示当trees=200、mtry(为节点中二叉树的最佳变量数)=9时，误差值相对稳定，此时模型的袋外误差率最低为9.09%，Gini系数法计算每个基因的重要性得分，基因重要性评分> 2是随机森林常见的筛选条件[20]，在此次研究中，由于得到的基因重要性评分均< 2，故选择重要性评分> 1作为筛选条件，见图5C，D。随后将3种机器学习算法得到的关键基因取交集，见图5E；最终得到5个具有代表性的骨关节炎关键基因，分别是HMGB2、GADD45A、SLC19A2、TPPP3、FOLR2。

2.4 人工神经网络诊断骨关节炎模型的评价通过Train组的5个关键基因建立的神经网络共执行了1 015步，终止条件为误差函数的绝对偏导数< 0.01，误差值为1.169 884，神经网络每条连线上的数字代表节点之间的权重，见图6。输出结果显示，模型的权重范围在-4.997-0.068，权重预测值-4.996 589(TPPP3)，-4.912 893(FOLR2)，-4.985 799 (HMGB2)，0.290 0196(GADD45A)，0.068 763 16(SLC19A2)。根据Train组的预测结果绘制混淆矩阵，Train组的准确率为96.36%，灵敏度为96.30%，特效度为96.42%，见表2。5折交叉验证显示其平均准确率与AUC值均>0.9，说明了模型的稳健性，见图7。

2.5 人工神经网络诊断骨关节炎模型的验证采用2个独立的数据集GSE98918与GSE51588来验证神经网络模型的准确性，绘制混肴矩阵，见表3，4。Train组与数据集GSE51588、GSE98918的ROC曲线，见图8。

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引言

骨关节炎是最常见的退行性和慢性关节疾病，主要损害关节软骨，表现为关节周围的肿胀、疼痛和僵硬[1]。骨关节炎的发病机制复杂，目前，骨关节炎的发生被认为主要与多种因素有关，其中包括机械、遗传和物理因素[2]。随着人口老龄化趋势的加深，越来越多的患者被诊断为骨关节炎，这是目前全球最常见的残疾原因。由于缺乏有效的治疗方法，骨关节炎严重影响着患者的生活质量，且给社会经济带来了巨大负担。因此，骨关节炎的早期诊断和治疗显得格外重要。
近年来，微阵列和高通量测序技术的快速发展为疾病的诊断和治疗做出了很大贡献[3]。虽然在公共数据库中积累了许多骨关节炎的高通量数据，但如何利用这些数据筛选关键基因来诊断骨关节炎仍是一项巨大的挑战。生物信息学领域的快速发展为骨关节炎的诊断提供了新的方法。通过基因表达数据来筛选最有意义的分类指数或特征，可以使用机器学习算法[4]。机器学习作为人工智能(artificial intelligence，AI)的子集，在许多生物医学领域应用广泛，如生物标志物的筛选、疾病诊断特征鉴定和药物靶点的发现等[5]。一些机器学习的算法，如最小绝对值收敛和选择算子算法(Lasso)、随机森林树(random forest，RF)和支持向量机-递归特征消除(SVM-REF)等在模拟特征与潜在结果之间的相关性、疾病诊断和风险预测方面均有较好的准确性[6-7]。
人工神经网络(artificial neural network，ANN)是一种模拟大脑神经元传递信息而构建的模型，在对人脑结构及其对外界刺激的响应机制进行理解和抽象后，以网络拓扑为理论基础将数据进行非线性建模，进而模拟出人脑对复杂信息的处理模式，具有一定的学习能力[8]。最近的研究表明，随机森林和人工神经网络在诊断疾病方面表现出了较好的性能，包括心力衰竭[9]、阿尔茨海默症及子宫内膜异位症等[10-11]。
该研究通过GEO数据库搜索下载骨关节炎芯片数据，对其进行标准化后使用3种机器学习算法分别对骨关节炎差异基因进行分析，取交集后得到5个骨关节炎关键基因[高迁移率族蛋白2(high mobility group protein 2，HMGB2)、促微管聚合蛋白(tubulin polymerization promoting proteins 3，TPPP3)、SLC19A2、叶酸受体2(folate-receptor 2，FOLR2)、GADD45A]。使用这些关键基因构建人工神经网络诊断模型，并通过2个独立的外部数据集评估了诊断模型的准确性。此诊断模型有望对骨关节炎的早期诊断和治疗提供新见解。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计建立基于人工神经网络的骨关节炎诊断模型。采用t检验筛选骨关节炎差异基因，Lasso回归、SVM-RFE、随机森林树算法鉴定关键基因。
1.2 时间及地点实验于2022年12月至2023年2月在广西中医药大学分子实验室完成。
1.3 材料

1.3.1 数据来源以关键词“Osteoarthritis”，物种设为Homo sapiens(智人)从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索并下载5个骨关节炎芯片数据集，分别为GSE46750[12]、GSE55235[13]、GSE169077、GSE98918[14]、GSE51588[15](见表1)，将其分为Train组与Test组，其中芯片GSE55235中有10例类风湿关节炎样本予以删除。

1.3.2 纳入标准 ①微阵列或高通量测序的mRNA表达谱；②每个数据集中均包含有正常对照与骨关节炎样本；③数据集中的样本组织来源于人体滑膜、软骨或半月板。
1.4 方法
1.4.1 数据预处理和筛选差异基因通过对每个GEO数据芯片相应平台的注释文件将探针ID转换为基因符号，删除与基因符号不对应的探针。若一个基因对应多个探针位点，则使用这个探针位点的平均值作为该基因表达水平。使用R软件“limma”包对数据GSE46750、GSE55235、GSE169077进行合并作为Train组，“sva”包ComBat函数消除不同芯片的批次效应。利用主成分分析(principal component analysis，PCA)对ComBat前后的表达值进行可视化，观察数据整体分布情况。以校验P值< 0.05(adj.P.value < 0.05)，表达变化倍数的绝对值> 1(|log2FC|> 1)作为表达差异基因(differentially expressed genes，DEGs)的筛选条件。
1.4.2 GO与KEGG富集结果 R软件“clusterProfiler”包对差异表达基因进行基因本体 (gene ontology，GO)分析，分别对生物过程、细胞成分、分子功能进行富集分析。Metascape基因富集分析网站(http://metascape.org/)对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 分析。
1.4.3 机器学习筛选骨关节炎关键基因通过Lasso回归、支持向量机、随机森林3种机器学习方法筛选骨关节炎关键基因。Lasso是一种基于回归的算法，应用较广，可以对变量进行筛选和降低复杂度。其中λ负责控制lasso的复杂程度，λ越大则惩罚越大，相应系数的收缩也越大，从而去除一些无关变量，进而得到更好的性能参数和避免过度拟合[16]。SVM-RFE算法是基于风险最小化原则的统计学原理发展而来的，可以应用于分类和非线性回归。通过计算所有特征的权重排名，并根据权重作为分类基础对特征进行排序，删除权重最小的元素，达到减少分类计算时间、提高分类准确率的目的[17]。随机森林树是利用多个决策树对样本进行训练、分类并预测的一种算法，主要应用于回归和分类分析。随机森林中，通常2/3的研究样本用于模型训练，1/3用于模型测试，测试样本也称为袋外(out-of-bag，OOB)样本。在处理分类问题时，可以根据OOB样本错误分类的比率来衡量模型预测性能[18]。通过使用3种机器学习分别对差异基因进行筛选，能够进一步识别可能对骨关节炎有影响的基因，将得到的结果取交集作为骨关节炎的关键基因。
1.4.4 人工神经网络诊断骨关节炎模型的建立及验证首先进行数据的预处理以规范化数据，采用min-max方法对输入数据进行归一化[19]。对Train组和Test组中5个基因的表达量进行打分，对所有样品表达量的中位数与给定样品中单个基因的表达量进行比较，对于上调基因表达量大于中位值则标1，小于中位值标0，下调基因表达量小于中位值标1，大于中位值标0。然后，通过R语言建立基于Train组的人工神经网络模型，设置人工神经网络输入层、隐藏层和输出层。输入层为Train组55个样本中5个基因的打分，隐藏层设为1层，隐藏层节点数为4(节点数太少会导致网络性能较差，太多会导致数据“过拟合”，通过多次改变隐藏层节点数发现节点数为4时，模型具有较低的误差)，以是否患有骨关节炎作为输出层，每个神经元通过权重连接至下一层。5折交叉验证评估模型表现情况。最后使用Test组中的2个独立芯片来验证人工神经网络模型的准确性，绘制Train组和Test组的混淆矩阵及受试者工作特征(receiver operation characteristic，ROC)曲线，计算曲线下面积(area under the curve，AUC)值。
1.5 主要观察指标 ①骨关节炎差异基因的筛选结果；②机器学习筛选骨关节炎关键基因结果；③人工神经网络诊断骨关节炎模型的评价；④人工神经网络诊断骨关节炎模型的验证。
1.6 统计学分析分析工具为R软件(x64 4.2.1)以及各类R包。t检验筛选骨关节炎差异基因。以P < 0.05认为差异有统计学意义。Lasso回归、SVM-RFE、随机森林树算法分别采用“glmnet”“e1071”及“randomForest”包构建。人工神经网络模型采用“neuralnet”和“NeuralNetTools”包创建。文章的统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

骨关节炎是一种有着多种遗传学病因的复杂疾病，其他确定的危险因素，如肥胖和年龄的增加等并不能完全解释骨关节炎的发病[21]。骨关节炎的临床诊断和病情评估大都依靠X射线片、CT、磁共振以及关节镜。其中，X射线片对于早期骨关节炎的诊断不敏感，CT和磁共振虽然可以在早期发现关节软骨及软骨下骨质异常改变，但价格较为昂贵，关节镜检查为有创性操作[22]。所以，寻找一种准确性高、价格低、无创或者微创的诊断手段显得尤为重要。高通量技术的发展可以从基因层面来阐释骨关节炎的发生，确立诊断骨关节炎的生物标志物，弥补了检查手段的不足。
人工神经网络是现代计算机人工智能最重要的分支，其最主要的作用在于将已有的海量信息整合，可以提高人们分析和处理信息的效率。人工神经网络也是一种灵活且实用的建模工具，能将模式信息应用到新数据中，具有较高的容错性、非线性、并行性及泛化能力等信息处理特征[23]。得益于强大的信息整合能力，人工神经网络在医学领域的应用十分广泛，在诊断、影像学分析、心电图分析、预后评估等方面均有相应的研究和使用[24]。随着高通量测序技术的快速发展，将有大量例如DNA片段、抗原抗体、microRNA等生物标志物被检出，而人工神经网络对分析这些生物标志物与疾病之间的关系起到非常大的作用。
在此次研究中，发现对机器学习筛选的骨关节炎关键基因构建人工神经网络诊断模型可以很好地将骨关节炎样本与正常样本进行区分。首先，将3个GEO数据集进行合并筛选骨关节炎差异表达基因。然后采用3种机器学习算法对差异表达基因进行分析后取交集，筛选出5个关键基因，分别是HMGB2、FOLR2、GADD45A、SLC19A2、TPPP3。随后建立人工神经网络模型并通过独立的外部数据集进行验证。血清HMGB2与骨关节炎关系密切，有研究表明HMGB2在关节软骨浅表区特异性表达，可以和Lef-1蛋白相互作用增强Wnt信号传导并促进关节软骨浅表区中软骨细胞生长[25]。HMGB2表达下降导致软骨浅表区细胞的损失，加速软骨的降解。在敲除了HMGB2基因的骨关节炎小鼠模型中，小鼠的软骨细胞更容易发生细胞凋亡，不仅有早发性骨关节炎样改变，而且后期发展成骨关节炎时的症状也更为严重。谢春意等[26]研究发现HMGB2低表达于膝骨关节炎患者关节滑液中，HMGB2在早期膝骨关节炎发病过程中具有调控软骨分化、降低关节炎症反应及防止软骨退变等重要作用。
FOLR2又叫叶酸受体β，已被认为是多种炎症性疾病的临床标志物和靶标，包括骨关节炎[27]。叶酸受体β在活化的巨噬细胞中过表达，这些巨噬细胞主要存在于骨关节炎滑膜衬里层，并可介导骨赘形成和纤维化等骨关节炎相关病理[28-29]。越来越多的研究表明，在各种炎症性疾病的发炎组织中发现了表达高水平叶酸受体β的活化巨噬细胞，并积极参与这些疾病的发病机制。选择性靶向叶酸受体β活化巨噬细胞，有望诊断和治疗骨关节炎。
生长阻滞和DNA损伤基因45A(GADD45A)是响应细胞应激反应的应激传感器[30]，也是一种p53调节的应激诱导基因，已被描述为参与细胞对各种DNA损伤剂反应的重要参与者之一[31]。Hashimoto 等[32]研究发现在骨关节炎软骨细胞中p53的表达比正常软骨细胞高，软骨细胞凋亡增加，而沉默P53后软骨细胞凋亡被抑制，提示P53在软骨细胞凋亡中起重要作用。GADD45A-P53的调控机制在多篇文章中均有报道[33-34]，虽然此次研究没有发现GADD45A与骨关节炎的相关报道，但是有理由猜测在骨关节炎中GADD45A可以通过调控P53的表达影响软骨细胞，进而影响骨关节炎的发展。
溶质载体家族19成员2(SLC19A2)编码硫胺素转运蛋白1，可以将硫胺素(维生素B1)带入细胞[35]。有研究表明，P53可以触发硫胺素转运蛋白1的反向激活，导致硫胺素摄取增加[36]。积累的硫胺素以其磷酸化形式-焦磷酸硫胺素(TPP)进一步抑制细胞内p53活性，从而形成一种负反馈机制。P53在之前的研究中已被证实与骨关节炎相关[32]。所以，由SLC19A2基因编码的硫胺素转运蛋白1蛋白可能通过调节P53来影响骨关节炎。
TPPP3是一种诱导微管蛋白聚合的内在非结构化蛋白。STAVEROSKY等[37]研究发现TPPP3是肌腱鞘的第一个分子标记物，也表现为形成滑膜关节。肌腱鞘在肌腱周围形成弹性套筒，并提供润滑以最大限度地减少肌腱与周围组织之间的摩擦。目前关于TPPP3的研究较少，与骨关节炎相关的研究还是空白。从现有研究发现TPPP3参与分化肌腱鞘和滑膜关节，其对于骨关节炎的相关关系还有待继续发掘。
结论：这些研究表明，此次研究筛选的5个骨关节炎关键基因建立的人工神经网络可以较好的将骨关节炎患者进行区分，而且在外部数据集中显示了良好的性能。然而此研究也存在一些局限性，该模型仅在2个数据集中进行的验证，将来仍需要加入更多的样本进行验证。此外，该预测模型仍需要在基础实验和临床中得到进一步验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

基于人工神经网络骨关节炎诊断模型的建立与分析

Establishment and analysis of osteoarthritis diagnosis model based on artificial neural networks

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