贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法分离纯化鉴定大鼠纤维环源干细胞

doi:10.12307/2023.771

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (31): 4980-4986.doi: 10.12307/2023.771

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法分离纯化鉴定大鼠纤维环源干细胞

马东1，陈祁青2，赵继荣1，黄军凯1，杨云云1，朱宝2，赵宁2，马同2

1甘肃中医药大学，甘肃省兰州市 730030；2甘肃省中医院，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2022-10-26 接受日期:2023-01-04 出版日期:2024-11-08 发布日期:2024-01-22
通讯作者: 陈祁青，博士，副主任医师，甘肃省中医院，甘肃省兰州市 730050
作者简介:马东，男，1992年生，甘肃省兰州市人，回族，甘肃中医药大学在读硕士，主要从事中医骨伤科学研究。
基金资助:
甘肃省自然科学基金项目(17JR5RA051)，项目负责人：陈祁青；国家自然科学基金地区科学基金项目(81760877)，项目负责人：赵继荣；甘肃省中医院博士启动基金项目(2018-1)，项目负责人：陈祁青

Isolation, purification and identification of rat annulus fibrosus-derived stem cells by adherent method combined with fibronectin differential adhesion method

Ma Dong1, Chen Qiqing2, Zhao Jirong1, Huang Junkai1, Yang Yunyun1, Zhu Bao2, Zhao Ning2, Ma Tong2

1Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China; 2Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2022-10-26 Accepted:2023-01-04 Online:2024-11-08 Published:2024-01-22
Contact: Chen Qiqing, MD, Associate chief physician, Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Ma Dong, Master candidate, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
Gansu Natural Science Foundation Project, No. 17JR5RA051 (to CQQ); Regional Science Foundation Project of the National Natural Science Foundation of China, No. 81760877 (to ZJR); Gansu Provincial Hospital of TCM Doctoral Initiation Fund Project, No. 2018-1 (to CQQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

纤维连接蛋白：是一种细胞外基质蛋白，对细胞黏附、扩散、迁移、增殖和凋亡有着决定作用，可以促进细胞的增殖、附着、生长和分化及其与不同整合素受体结合。

纤维环：由含胶原纤维束的纤维软骨构成，位于髓核的四周，纤维环的外观结构为前侧及两侧较厚，而后侧较薄，与人体脊柱的生理弯曲形状相适应，同时纤维环的前部有强大的前纵韧带，宽而坚韧，后侧的后纵韧带较窄、较薄，这是腰椎间盘髓核多向后、向外侧突出的解剖学原因。纤维环的各层纤维彼此交错成菱形，牢固地附着在上下软骨终板和椎体骨缘上，这种特殊的纤维排列方式非常坚固且富有弹性，不仅使相邻椎体间存在一定限度内的活动范围，还可限制椎体之间的过度扭转和滑移活动，加强了椎体间连接的稳定性，同时还可耐受各个方向的压力，并能缓冲外力，吸收震荡。

背景：目前，细胞疗法治疗椎间盘退变多以骨髓间充质干细胞为主。但是，使用骨髓间充质干细胞作为纤维环再生的种子细胞存在修复部位形成异位骨化和畸胎瘤的危险。因此，寻找一种新的纤维环组织工程种子细胞对椎间盘退变的治疗将具有巨大的经济和社会意义。
目的：通过贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附筛选法分离纯化大鼠纤维环源干细胞，观察纯化效果及细胞的生物学特性。
方法：从SD大鼠椎间盘中获取纤维环组织，机械-酶消化法获取原代纤维环源干细胞，通过贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法纯化纤维环源干细胞，在显微镜下观察细胞形态变化及增殖情况，应用细胞免疫荧光技术和qPCR技术检测干细胞表面标志物的表达，对筛选后的细胞进行多系诱导分化和特征性基因检测。

结果与结论：①纯化后细胞生长良好，形态多以角形和星形多突起细胞为主，具有较好的增殖能力；②细胞膜表面抗原CD73、CD90、CD105呈阳性表达，CD45、CD34呈阴性表达；③经特定诱导后，细胞可以成功分化为成骨细胞、成软骨细胞及成脂细胞；④成骨诱导后Collagen-Ⅰ、Runx2、成软骨诱导后Collagen-Ⅱ、Sox-9 和成脂诱导后PPAR-γ、LPL各特征性基因均在细胞中呈高表达，与诱导前比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法能够有效筛选、纯化大鼠纤维环源干细胞，所得的细胞生物学性能良好，具有较好的增殖及多向分化潜能。

https://orcid.org/0000-0001-8607-9597(马东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 纤维环源干细胞, 培养, 纤维连接蛋白, 差别黏附法, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: At present, bone marrow mesenchymal stem cells are the main seed cells used in cell therapy for the treatment of intervertebral disc degeneration. However, the use of bone marrow mesenchymal stem cells as seed cells for the regeneration of fibrous rings is at risk of heterotopic ossification and teratoma at the repair site. Therefore, it is of great economic and social significance to find a new kind of seed cells for tissue engineering of annulus fibrosus for the treatment of intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To isolate and purify rat annulus fibrosus-derived stem cells by adherent method combined with fibronectin differential adhesion screening method, and to observe its purification effect and biological characteristics.
METHODS: Annulus fibrosus tissue was obtained from a SD rat intervertebral disc. Primary annulus fibrosus-derived stem cells were obtained by the mechanical-enzymatic digestion method. Annulus fibronectin differential adhesion method was used to purify annulus fibrosus-derived stem cells. Morphological changes and proliferation of cells were observed through a microscope. The expression levels of stem cell markers were detected by immunofluorescence technique and qPCR. The screened cells were subjected to multi-lineage cell differentiation and characteristic gene detection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The purified cells grew well, and most of them were angular and star-shaped multi-process cells, which had good proliferation ability. (2) Cells were positive for cell membrane surface antigens CD73, CD90 and CD105, while negative for CD45 and CD34. (3) After specific induction, cells could successfully differentiate into osteoblasts, chondroblasts and lipoblasts. (4) Collagen-I, Runx-2 after osteogenic induction, Collagen II, Sox-9 after chondrogenic induction, and PPAR -γ and LPL after lipogenic induction were highly expressed in cells, and the difference was significant compared with that before induction (P < 0.05). (5) These findings confirm that the adherent method combined with fibronectin differential adhesion method is effective enough to screen, isolate and purify rat annulus fibrosus-derived stem cells, and has good cell biological properties, good proliferation ability and multiple differentiation potential.

Key words: annulus fibrosus-derived stem cell, cultivation, fibronectin, differential adhesion method, rat

中图分类号:

马东, 陈祁青, 赵继荣, 黄军凯, 杨云云, 朱宝, 赵宁, 马同. 贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法分离纯化鉴定大鼠纤维环源干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4980-4986.

Ma Dong, Chen Qiqing, Zhao Jirong, Huang Junkai, Yang Yunyun, Zhu Bao, Zhao Ning, Ma Tong. Isolation, purification and identification of rat annulus fibrosus-derived stem cells by adherent method combined with fibronectin differential adhesion method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(31): 4980-4986.

图/表（结果） 9

2.1 AFSCs的形态原代细胞初次接种于培养瓶，倒置相差显微镜下观察未染色细胞呈多角形。使用鬼笔环肽及DAPI对细胞进行染色，荧光显微镜下可观察到培养24 h时，细胞开始贴壁生长，形态呈不规则形；培养至第4天，细胞开始增殖，且形态多以圆形、三角形为主；培养至第7天，形态呈多角形和星形多突起细胞为主；培养至第14天，细胞生长状态良好，形态未见明显变化，细胞融合度已达到70%-80%，见图1，2。

2.2 AFSCs的生长曲线 MTT结果显示，AFSCs生长曲线大致呈S型。接种前2 d是生长潜伏期，3-8 d进入对数生长期，8 d后细胞生长进入平台期，见图3。

2.3 AFSCs的干细胞表面标志物表达使用qPCR检测AFSCs表面标志物基因表达，相较于对照组，AFSCs组CD105、CD73、CD90相对mRNA表达较高，CD45、CD34相对mRNA表达较低，见图4。细胞免疫荧光染色结果显示，AFSCs表面特异性标志物CD105、CD73、CD90呈阳性表达，CD45、CD34呈阴性表达，见图5。

2.4 AFSCs成骨诱导分化结果加入成骨诱导液的AFSCs于培养第5天开始其细胞形态发生明显变化，3周后使用多聚甲醛固定液对细胞进行固定，选用10%的茜素红S染色液对细胞进行染色，镜下可明显观察到细胞被红染，染色细胞呈典型成骨细胞形态并有明显的红色钙结节沉积出现，而未诱导对照组细胞无明显染色和钙结节出现，呈阴性，见图6。

2.5 AFSCs成软骨诱导分化结果加入成软骨诱导液的AFSCs经培养后其细胞形态膨大变圆，且呈现出明显的类软骨细胞形态，3周后使用多聚甲醛固定液对细胞进行固定，选用2.5%番红O染色液对细胞进行染色，镜下可观察到由于软骨细胞特异性分泌大量硫酸蛋白聚糖而呈现出明显的细胞红染现象，而未诱导对照组细胞无明显染色，见图7。

2.6 AFSCs成脂诱导分化结果 AFSCs进行成脂诱导培养后，细胞变成空泡样而呈脂肪细胞形态，2周后使用多聚甲醛固定液对细胞进行固定，选用0.36%的油红O染色液对细胞进行染色，镜下可观察到细胞呈明显红染，而未诱导对照组细胞无明显染色且形态也无明显变化，呈阴性，见图8。

2.7 AFSCs诱导前后基因检测结果成骨诱导培养3周后，对AFSCs进行成骨细胞特征性基因检测，结果显示Collagen-Ⅰ、
Runx2 基因在细胞中呈高表达，而未诱导组无明显表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9A；成软骨诱导培养3周后，对AFSCs进行成软骨细胞特征性基因检测，结果显示Collagen-Ⅱ、Sox-9 基因在细胞中呈高表达，而未诱导组无明显表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9B；成脂诱导培养2 周后，对AFSCs进行脂肪细胞特征性基因检测，结果显示，PPAR-γ、LPL 基因在细胞中呈高表达，而未诱导组无明显表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9C。

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引言

椎间盘退行性疾病是引起下腰痛的主要原因之一，严重影响患者的生活质量，甚者可出现下肢残疾[1]。目前，对椎间盘退行性疾病的治疗主要有保守和手术两种治疗方式。保守治疗虽在一定程度上能缓解临床症状，但不能逆转椎间盘的退变进程。手术治疗是最后的选择，但其长期随访效果并不确定，且术后并发症发生率较高[2]。近年来，随着组织工程技术的日益发展，椎间盘组织工程为椎间盘退行性疾病的治疗带来了新方向[3]。
纤维环源干细胞(annulus fibrosus-derived stem cells，AFSCs)是从纤维环组织中分离出来的细胞亚群，其表现出典型的骨髓间充质干细胞表面抗原分子的基因表达以及克隆形成能力、自我更新能力和多向分化潜能[4-5]，可能成为细胞疗法或组织工程方法治疗椎间盘退行性疾病的理想候选细胞。然而AFSCs的研究刚刚起步，其分离纯化方法目前尚无统一意见。因此，选取一种有效可靠的筛选方法对于AFSCs的研究具有重要意义。
纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是一种细胞外基质蛋白，对细胞黏附、扩散、迁移、增殖和凋亡有着决定作用[6-7]。王海等[8]成功采用纤维连接蛋白差别黏附法筛选获得高纯度软骨终板干细胞，这为使用相同方法筛选分离同为干细胞的AFSCs提供了有效实验依据。因此，该研究通过贴壁法和纤维连接蛋白差别黏附法相结合来分离鉴定大鼠AFSCs，观察其筛选效果及分化潜能，探讨AFSCs的生物学特性，为纤维环组织工程种子细胞的选择提供一定的理论和实践依据，为后续的研究奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞生物学实验，多组间数据比较采用LSD法和S-N-K法。
1.2 时间及地点实验于 2019年8月在中国农业科学院兰州兽医研究所实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选择3月龄SD大鼠10只，雌雄各半，体质量180-220 g，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(甘)2015-0001。取T10-L5之间的椎间盘纤维环作为细胞培养标本。
实验方案经中国农业科学院兰州兽医研究所动物实验伦理委员会批准(编号：17JR5RA051)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂与仪器 0.25%胰蛋白酶溶液(Invitrogen，美国)；胎牛血清(Bioind，以色列)；DMEM(Invitrogen，美国)；鬼笔环肽(Solarbio，中国)；DAPI(Solarbio，中国)；Percoll分离液(Sigma，美国)；纤维连接蛋白(Corning，中国)；牛血清白蛋白(Solarbio，中国)；转化生长因子β1(Solarbio，中国)；免疫荧光试剂盒(Solarbio，中国)；免疫组化试剂盒(Solarbio，中国)；番红O 染色液(Solarbio，中国)；油红O染色液(Solarbio，中国)；茜素红染色液(Solarbio，中国)；反转录试剂盒(Takara，日本)；PCR试剂盒(Takara，日本)；聚丙烯酰氨凝胶电泳试剂盒(Solarbio，中国)；Trizol (Solarbio，中国)；总mRNA提取试剂盒(Solarbio，中国)；琼脂糖凝胶电泳试剂盒(Solarbio，中国)；37 ℃培养箱(Thermo Fisher，美国)；超净工作台(Thermo Fisher，美国)；倒置荧光显微镜(Thermo Fisher，美国)；PCR仪(BIO-RAD，美国)；倒置显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 AFSCs的分离、培养与鉴定
(1)提取AFSCs：SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉后脱臼处死，置于体积分数为75%乙醇中浸泡10 min消毒，在超净台上沿大鼠背部正中线切开皮肤并钝性分离竖脊肌，充分显露T10-L5椎体并将该段脊柱游离取出，去除多余的韧带及肌肉，取出各节段椎间盘组织，放入含5%双抗的DMEM培养液中，移除髓核并进一步去除纤维环周围的骨质与筋膜等组织。获得纤维环组织并切成小块(1 mm×1 mm×1 mm)，使用无菌PBS清洗干净纤维环组织，加入0.02% Ⅰ型胶原酶1 mL，放入37 ℃，体积分数5%CO2培养箱内，以间隔1 h为标准吹打纤维环组织块至完全消化。使用密度为200目的滤筛对组织进行过滤，设定1 000 r/min转速离心10 min，弃上清，然后用含体积分数为20%胎牛血清及1%双抗的DMEM完全培养基对细胞进行重悬，种植于直径为100 mm培养皿内，再次将细胞置于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱内培养，每2 d换液1次。当细胞达到80%融合时，使用0.25%胰蛋白酶消化传代或用于后续实验。

(2) 纤维连接蛋白差别黏附筛选法纯化AFSCs：细胞重悬后以1 mL含1 mmol/L CaCl2和1 mmol/L MgCl2的纤维连接蛋白(10 μg/mL)包被培养瓶24 h，培养瓶使用前以PBS(含体积分数为1%血清)封闭，置于95%湿度、37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中培养，每3 d换液1次，在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况。

1.4.2 细胞形态观察细胞培养至第1，4，7，14天时使用鬼笔环肽(FITC-Phalloidin)和DAPI染色，分别于倒置显微镜及荧光显微镜下进行细胞形态观察。
1.4.3 MTT法检测AFSCs增殖情况取生长良好的第1代AFSCs，使用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，800 r/min 离心8 min，移去上层液体，用含体积分数为20% 胎牛血清及1%双抗的L-DMEM 完全培养基重悬细胞，将细胞浓度稀释成2 000个/200 μL，以每孔1×105个的细胞密度接种到5块96孔培养板中，各培养板每个时间点设5个复孔。采用MTT法检测接种后第1-12天的细胞增殖活性，紫外分光光度仪检测该时间段各个孔细胞的吸光度值(450 nm波长)，绘制细胞生长曲线。
1.4.4 免疫荧光检测AFSCs表面标志的表达使用第3代AFSCs，通过细胞免疫荧光检测CD105、CD73、CD90，CD45、CD34干细胞标志物的表达，具体操作过程如下：常规石蜡包埋切片，切片厚度约4 μm[9]，然后使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡处理10 min；使用梯度乙醇(体积分数为100%，100%，95%，95%，85%，75%)各处理3 min，然后水洗2次，再于PBS中浸泡5 min；使用柠檬酸钠抗原修复液热修复5 min×2次；待冷却后，PBS洗5 min×3次；体积分数为3%过氧化氢封闭15 min，PBS洗5 min×3次；滴加5% Trition X-100室温15 min，PBS洗5 min×3次；滴加正常山羊血清，室温孵育15 min；滴加一抗(兔CD105、CD73、CD90，CD45、CD34抗体，1∶200)后置于湿盒中4 ℃条件下冰箱孵育过夜；37 ℃复苏35 min，PBS洗5 min×3次；滴加荧光素标记的与一抗来源相匹配的二抗，37 ℃孵育60 min(从此步骤后都需避光操作)，PBS洗5 min×3次，滴加DAPI室温染核5 min，PBS洗5 min×3次；抗荧光淬灭剂封固，荧光显微镜下观察。

1.4.5 qPCR方法检测AFSCs干细胞标志物基因表达应用qPCR方法检测AFSCs表面CD105、CD73、CD90、CD45、CD34的mRNA表达，使用不加引物的空白组AFSCs作为对照，具体操作过程如下：采用Trizol法提取第3代AFSCs中的总RNA，使用无酶水溶解稀释，依据试剂盒说明书利用反转录酶反转录合成cDNA，再以cDNA为模板依照实时定量PCR步骤顺序进行qPCR检测。PCR反应程序：预变性设定条件为温度95 ℃、10 min，循环数为1；扩增设定条件为温度95 ℃、15 s；60 ℃、15 s及72 ℃、30 s，循环数为40。用2-ΔΔCt表示基因相对表达量。目的基因引物序列见表1。

1.4.6 AFSCs的多向诱导分化取生长良好的第3代AFSCs，无菌PBS清洗后用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化并制成单细胞悬液。将细胞以每孔4×104个的细胞密度接种在24孔板的培养基中(含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基)。当细胞达到80%融合时分别在成骨、成软骨以及成脂培养基中进行诱导分化，各诱导培养基配方见表2-4，每3 d换液1次，其中成骨诱导分化培养21 d，成软骨诱导分化培养21 d，成脂诱导分化培养14 d。对照组使用基础培养基不加诱导液，其他培养条件与实验组保持一致。

1.4.7 诱导分化后染色成骨诱导分化21 d、成软骨诱导分化21 d及成脂诱导分化14 d后，吸除培养板中的液体，PBS清洗细胞2次，吸净培养板内的液体，加入200 μL 40 g/L多聚甲醛固定液对细胞进行固定，于室温条件下静置40 min后继续使用PBS清洗细胞3次，每次5 min，吸净培养板内的液体，分别于成骨诱导的细胞中加入10%的茜素红S染色液50 μL、成软骨诱导的细胞中加入2.5%的番红O染色液50 μL、成脂诱导的细胞中加入0.36%的油红O染色液50 μL。室温条件下静置(成骨1 h、成软骨30 min、成脂1 h)后吸除染色液并使用PBS清洗3次，每次5 min，倒置相差显微镜观察并摄片。

1.4.8 诱导分化后基因检测在PubMed数据库的GenBank中查得目的基因 RNA 序列，利用引物设计软件Primier 5.0 设计所需的引物。引物由Invitrogen 公司合成。分别在成骨诱导21 d、成软骨诱导21 d和成脂诱导14 d时提取细胞总RNA，qPCR检测成骨诱导后Collagen-Ⅰ、Runx2，成软骨诱导后Collagen-Ⅱ、Sox-9 和成脂诱导后PPAR-γ、LPL 的基因表达，与未做诱导的细胞作对照，每个样品3 个复孔。合成的引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①MTT法检测AFSCs接种后第1-12天的增殖活性；②细胞免疫荧光检测第3代AFSCs表面CD105、CD73、CD90，CD45、CD34的表达，并应用qPCR方法检测AFSCs表面CD105、CD73、CD90，CD45、CD34的mRNA表达；③在成骨诱导21 d、成软骨诱导21 d和成脂诱导14 d时， qPCR检测成骨细胞特征基因Collagen-Ⅰ、Runx2，成软骨细胞特征基因Collagen-Ⅱ、Sox-9 和脂肪细胞特征基因PPAR-γ、LPL 的mRNA表达。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，数据多重比较采用LSD法和S-N-K法，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过甘肃中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

椎间盘结构复杂，主要由3个不同的部分组成，即纤维软骨环及其外部和内部区域同心定向的纤维组织层、中央髓核以及软骨终板，其中纤维环的退变损伤致使髓核内细胞外基质减少以及合成代谢和分解代谢之间的不平衡是导致椎间盘退行性疾病的主要原因之一[10-11]。此外，椎间盘的基本结构单位中，纤维环也是限制中央髓核和维持椎间盘内压力的关键，其完整性对于维持椎间盘的健康结构和生物功能至关重要。因此，近年来纤维软骨环的再生与修复逐渐成为椎间盘组织工程研究的重点[12-13]。
细胞移植作为纤维环修复的一种主要治疗方法，在组织工程中起着重要作用[14]，其中种子细胞的选择尤为关键。在既往研究中，间充质干细胞与纤维环细胞常作为种子细胞的首要选择[15]。但是SCHUBERT等[16]研究发现纤维环细胞在体外扩增中会出现自身细胞形态丢失以及Ⅱ型胶原蛋白表达降低的问题，无法达到修复退变组织的作用，且间充质干细胞在体外长期培养后可能会失去生物功能，将间充质干细胞作为种子细胞对纤维环进行再生修复时可能会出现修复部位形成异位骨化以及畸胎瘤的危险。此外，间充质干细胞获取困难且来源有限，常常给患者和医生带来不必要的研究停滞的麻烦[17-21]。随着组织工程研究的发展，纤维环组织中AFSCs被成功分离鉴定。研究发现，脂肪来源间充质干细胞具有更高的成脂潜力，而骨膜和肌肉来源间充质干细胞具有更好的成骨能力[22]，肌腱间充质干细胞也优先分化为腱细胞样干细胞[23-24]。这些研究表明，来自某一特定组织的干细胞优先分化为驻留在该组织中的细胞类型[25]。因此，来源于纤维环组织的AFSCs是更合适用于椎间盘退行性疾病细胞治疗或纤维软骨环组织工程再生修复的潜在种子细胞。
目前，常用干细胞的分离纯化方法主要有差速贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法以及免疫磁珠法。差速贴壁法具有筛选快速、简单且经济实惠的优势，但其所筛选获得的细胞纯度不高。密度梯度离心法虽为常见实验室技术，但其所筛选的细胞特异性有限，且操作过程难度较大。免疫磁珠分离法与流式细胞仪分离法在筛选分离细胞时对细胞活性有较大的影响，加之价格昂贵且操作繁杂，故实验使用较少[26-27]。王海等[8]采用纤维连接蛋白差别黏附法成功分离纯化出软骨终板干细胞，且细胞纯度达到90%以上，加之该方法操作相对简单且对设备要求不高，此次实验使用该方法与贴壁法相联合来分离纯化AFSCs，细胞纯度高，增殖活性强。因此，贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法可作为AFSCs分离培养的优选方案。
此次实验通过细胞免疫荧光和Real-time PCR检测一些干细胞典型的表面抗原表达来鉴定所获得AFSCs的干细胞属性，结果显示CD73、CD90和CD105在AFSCs中呈强阳性表达，而CD34和CD45在AFSCs中却几乎没有表达。此外，相关研究发现，CD73、CD90和CD105在细胞中是否存在表达是鉴定间充质干细胞的关键[28-30]，这一结果表明AFSCs具有典型的间充质干细胞属性。实验对分离所得的第3代AFSCs进行成骨、成软骨及成脂诱导分化，分别用茜素红S 染色、番红O 染色及油红O染色进行鉴定，结果表明AFSCs经诱导后成功向成骨、成软骨和成脂方向分化。在成骨诱导21 d、成软骨诱导21 d和成脂诱导14 d时提取细胞总RNA，qPCR检测成骨诱导后Collagen-Ⅰ、Runx2，成软骨诱导后Collagen-Ⅱ、Sox-9 和成脂诱导后PPAR-γ、LPL 的基因表达，与未做诱导的细胞作对照，结果显示诱导后成骨、成软骨与成脂细胞特征性基因均在细胞中呈高表达，与对照组比较，差异有显著性意义。而这些主要分化转录因子的表达是鉴定细胞是否具有良好分化能力的关键[31-34]。因此，上述结果证明分离所得的AFSCs是具有典型干细胞属性和多项分化潜能的干细胞。
此次实验运用贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法能够有效筛选AFSCs并获得较高纯度的细胞，可为以后的相关实验研究及临床应用打下良好的细胞学基础。同时，实验证实AFSCs具有典型间充质干细胞属性和良好的多向分化潜能，有望成为椎间盘退行性疾病细胞治疗和纤维软骨环组织工程再生修复的潜在种子细胞，且对相关疾病的治疗具有重要的研究价值和广阔的应用前景。但目前对于AFSCs的研究仍不够深入，不同纯化培养方法的对比研究较少，且AFSCs在机体内的作用机制尚不清楚，这也有待于从大动物实验中进一步验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

贴壁法联合纤维连接蛋白差别黏附法分离纯化鉴定大鼠纤维环源干细胞

Isolation, purification and identification of rat annulus fibrosus-derived stem cells by adherent method combined with fibronectin differential adhesion method

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