兔垂体干细胞的培养鉴定及分化

doi:10.12307/2024.178

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 3942-3946.doi: 10.12307/2024.178

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

兔垂体干细胞的培养鉴定及分化

岳婷婷1，朱婷2，毛剑男1，李伟1，杭春华1，2

1南京大学医学院附属鼓楼医院神经外科，江苏省南京市 210008；2南京中医药大学鼓楼临床医学院，江苏省南京市 210008

收稿日期:2023-05-22 接受日期:2023-07-04 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 杭春华，博士，主任医师，教授，南京大学医学院附属鼓楼医院神经外科，江苏省南京市 210008；南京中医药大学鼓楼临床医学院，江苏省南京市 210008
作者简介:岳婷婷，女，1992年生，江苏省南京市人，汉族，2019年中国医科大学毕业，博士，主要从事干细胞在神经系统疾病中的作用及机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81971122)，项目负责人：杭春华

Culture, identification, and differentiation of rabbit pituitary stem cells

Yue Tingting1, Zhu Ting2, Mao Jiannan1, Li Wei1, Hang Chunhua1, 2

1Department of Neurosurgery, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 2Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Received:2023-05-22 Accepted:2023-07-04 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Hang Chunhua, MD, Chief physician, Professor, Department of Neurosurgery, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Yue Tingting, MD, Department of Neurosurgery, Nanjing Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81971122 (to HCH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

垂体干细胞：是具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，主要分布于垂体前叶，其在整个生命过程中保持多能能力，并可分化成多种分泌不同激素类型的垂体细胞，在垂体平衡中发挥重要作用。
细胞分化：指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在时间和空间上同一细胞与其从前的状态有所不同。如垂体干细胞可分化为多种类型细胞：促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、促生长激素细胞、促黄体生成激素细胞、促卵泡素细胞、催乳素细胞。

背景：脑垂体是人体重要的内分泌器官。多种疾病可引起脑垂体损伤，如脑垂体瘤、垂体功能减退症等。垂体干细胞因具有自我更新和多向分化潜力的特性，有望成为一种新的治疗方式修复受损的垂体。

目的：采用悬浮细胞球培养法分离培养垂体干细胞，鉴定其增殖及分化能力。
方法：采用悬浮细胞球培养法从新生新西兰白兔垂体中分离培养垂体干细胞，观察其形态特征；免疫荧光细胞染色检测垂体干细胞标志蛋白SOX2及Nestin的表达；采用EdU标记法检测垂体干细胞增殖能力；经贴壁及诱导分化后，通过ELISA法检测培养基中的激素水平。

结果与结论：通过悬浮细胞球培养法可成功分离得到垂体干细胞球，且具有较强的增殖能力；干细胞特异性标记物SOX2和Nestin阳性表达；经诱导分化后培养基中促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素、促黄体生成激素、促卵泡素、催乳素水平显著升高(P < 0.001)，具有较强的分化能力。

https://orcid.org/0000-0001-9672-0798 (岳婷婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 垂体干细胞, 垂体, 悬浮细胞球培养, 鉴定, 分化, 兔

Abstract: BACKGROUND: The pituitary gland is an important endocrine organ in the body. Certain diseases can cause damage to the pituitary gland, such as pituitary adenoma and abnormal hormone secretion. Pituitary stem cells, due to their self-renewal and multi-directional differentiation potential, are expected to become a new therapeutic approach for repairing damaged pituitary glands.

OBJECTIVE: To isolate and culture pituitary stem cells using the suspension cell ball culture method and identify their proliferation and differentiation ability.

METHODS: Pituitary stem cells were isolated and cultured from the pituitary gland of newborn New Zealand white rabbits using the suspension cell ball culture method, and their morphological characteristics were observed. Immunofluorescence cytochemistry was used to detect the expression of pituitary stem cell markers SOX2 and Nestin. EdU labeling method was utilized to detect the proliferative ability of pituitary stem cells. After adherent and induced differentiation, the hormone levels in the culture medium were detected by ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: Pituitary stem cell spheres could be successfully isolated by the suspension cell ball culture method, with strong proliferative ability. Positive expression of stem cell-specific markers SOX2 and Nestin was found in the cultured cells. After induction and differentiation, adrenocorticotropic hormone, thyroid hormone, growth hormone, luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, and prolactin levels significantly increased in the medium (P < 0.001), with strong differentiation ability.

Key words: pituitary stem cell, pituitary, suspension cell ball culture, appraisal, differentiation, rabbit

中图分类号:

岳婷婷, 朱婷, 毛剑男, 李伟, 杭春华. 兔垂体干细胞的培养鉴定及分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3942-3946.

Yue Tingting, Zhu Ting, Mao Jiannan, Li Wei, Hang Chunhua. Culture, identification, and differentiation of rabbit pituitary stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 3942-3946.

图/表（结果） 4

2.1 垂体干细胞的形态在解剖显微镜下找到垂体窝，取出垂体，经Accutase消化酶消化后，得到单个细胞，见图1A。原代培养1 d后，显微镜下观察到部分细胞悬浮，且悬浮细胞有聚集成团的趋势，见图1B，部分细胞贴壁，将悬浮细胞更换培养瓶后继续培养。培养至第3天，悬浮细胞聚集成细胞团，并逐渐增大，见图1C。随着细胞球直径增加，形态越来越均匀，第7天细胞球直径增至100 μm，
见图1D。

2.2 垂体干细胞标志蛋白SOX2及Nestin的表达当体外培养的垂体干细胞传代至第3代时，取部分细胞进行垂体干细胞鉴定。SOX2免疫荧光染色结果显示，细胞核被DAPI蓝染，同时细胞被SOX2绿染，见图2A-C。Nestin免疫荧光染色结果显示，细胞核均较小，被DAPI染成蓝色，胞浆呈绿色，说明Nestin呈阳性表达，见图2D-F。以上结果证明提取的细胞均有SOX2及Nestin阳性表达，为垂体干细胞。

2.3 垂体干细胞的增殖能力荧光显微镜结果显示，部分垂体干细胞呈现EdU阳性表现，经Image J软件分析Edu阳性细胞(即具有增殖能力的细胞)占所有细胞的比例约43.8%，见图3。

2.4 垂体干细胞的诱导分化能力 ELISA结果显示，与分化0 d的垂体干细胞上清液相比，分化5 d的垂体干细胞上清液中促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素、促黄体生成激素、促卵泡素、催乳素水平明显升高，分别为(55.30±3.40) pg/mL，(11.21±0.25) mU/L，(19.61±1.03) ng/mL，(30.67±1.57) mIU/mL，(5.75±0.34) mIU/mL，(511.50±33.42) mIU/L。该分化结果进一步证实，分离培养得到的细胞为垂体干细胞，且该细胞具有分化能力，见图4。

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引言

垂体是人体中最复杂的内分泌腺之一，位于大脑底部的鞍区。已知垂体可分泌多种激素，调节机体的一系列生理过程，如身体的生长、代谢、发育和生殖等[1-3]。根据解剖结构，垂体分为两部分：垂体前叶和垂体后叶。垂体前叶又称腺垂体，由前叶和中间叶组成，垂体前叶由拉特克囊发育而来，可分泌包括生长激素在内的6种激素，其不仅与身体的骨骼和软组织的生长有关，还影响其他内分泌腺的活动，以维持身体的激素平衡[1，4]，例如：腺垂体可促进甲状腺激素释放，继而刺激甲状腺增生及细胞增大，进而影响甲状腺的生理功能。垂体后叶来源于神经垂体芽，不包含腺体细胞，不能合成激素，它的主要功能是在适当的刺激下向血液中释放抗利尿激素和催产素，这些激素均由下丘脑合成并储存在垂体后叶[5]。目前，垂体腺瘤、Rathke肿瘤等垂体相关疾病的主要临床治疗方法包括手术治疗、药物治疗(化疗、靶向药物治疗、免疫抑制剂治疗及激素治疗)和放射治疗[6-8]，虽已取得很大的进展，但术后由于未切除尽而致的肿瘤复发、耐药性和用药后激素紊乱等问题仍十分棘手[9]。目前，激素缺乏或垂体功能减退症的治疗方式主要依赖于重组激素替代疗法[10-11]，一定程度上降低了患者的发病率和死亡率，但其仍存在一定局限性，如需要长期专业检测、不能精准地模拟每个内分泌器官的激素变化、有潜在的不良反应及费用较高。
干细胞治疗具有广阔的前景，近年来已逐渐成为一种流行且可信赖的治疗方法[12-17]。干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，在细胞生长、维持平衡和修复方面发挥着重要作用[18]。研究发现，垂体和其他组织一样，存在干/
祖细胞群，并且参与垂体的组织修复[19-21]。越来越多的证据表明脑垂体内有一个常驻的干细胞室，研究表明垂体干细胞参与了出生后垂体的细胞重塑过程，但是垂体可塑性的潜在分子机制，特别是与干细胞相关的机制，在很大程度上仍然未知[2]。实验人员通过注射白喉毒素致使小鼠生长激素细胞逐渐消失，SOX2+干细胞数量增加，证实垂体干细胞的存在，并在垂体损伤后发挥治疗能力[22-25]。研究发现SOX2+细胞主要分布在垂体裂隙的边缘区以及垂体前叶的实质
中[20]，SOX2+细胞数量随年龄及垂体发育过程而减少，但仍可在成年动物中发现SOX2+细胞[22，24]。长期以来，研究者对垂体干细胞的潜在应用价值十分感兴趣，但一直缺乏垂体干细胞全面且系统的体外培养方法。现阶段垂体干细胞体外培养多以大鼠或小鼠作为研究对象，进行提取鉴定[26-27]，但动物鼠的垂体较小，提取的干细胞数量少，不利于后期的进一步分析研究及转化应用。因此，该实验选取新西兰大白兔为实验对象，具有垂体体积大、细胞量多、易于优化实验过程等优点，且更有利于后续兔垂体干细胞移植等实验的开展及功能验证。该实验成功从新生24 h内的新西兰白兔垂体中提取和培养出垂体干细胞，希望为垂体相关疾病治疗提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞观察性实验。采用悬浮细胞球培养法从兔垂体中分离培养垂体干细胞，通过细胞形态、特定标记蛋白表达、增殖能力及分化后相关激素水平检测，证明该垂体干细胞提取方法的可靠性。计量资料使用独立样本t检验进行两组间的统计分析。
1.2 时间及地点实验于2022年5-12月在南京大学医学院附属鼓楼医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物出生24 h内新西兰白兔，由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供，许可证号为SYXK(苏)2019-0059。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。实验方案经南京大学医学院附属鼓楼医院动物实验伦理委员会批准，审批号为2023AE04002。
1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12、B27、Accutase、胎牛血清(Gibco公司)；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司)；Anti-SOX2、Anti-Nestin(Abcam公司)；二抗(Abcam公司)；QuickBlock™免疫染色封闭液、EdU细胞增殖试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；兔促肾上腺皮质激素ELISA试剂盒、兔促甲状腺激素ELISA试剂盒、兔促生长激素ELISA试剂盒、兔促黄体生成激素ELISA试剂盒、兔促卵泡素ELISA试剂盒、兔催乳素ELISA试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛(武汉谷歌)；TritonX-100、10×PBS(Sigma公司)；解剖显微镜、激光共聚焦显微镜(Leica公司)；普通光学显微镜(Zeiss公司)；DAPI、酶标仪、流式细胞仪、细胞培养箱、生物安全柜(Thermo Fisher公司)。
1.3.3 培养基配方 ①垂体干细胞增殖培养基：于DMEM/F12中加入2%B27、20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子；②垂体干细胞分化培养基：于DMEM/F12中加入2%B27、体积分数1%胎牛血清；③垂体干细胞贴壁培养基：于DMEM/F12中加入体积分数10%胎牛血清。
1.4 实验方法
1.4.1 原代垂体干细胞的分离、培养取出生24 h内的新西兰白兔，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后用剪刀断颈取头部，再依次剥离头皮、颅骨、大脑后，在解剖显微镜下于蝶鞍中部下凹即垂体窝内取出垂体。将垂体组织用PBS清洗2次后，加入Accutase消化酶，37 ℃消化10 min，用含有体积分数10%胎牛血清DMEM/F12终止消化，并用1 mL枪头吹打10次至无组织块，然后将细胞悬液用70 μm细胞过滤器过滤，1 000 r/min离心5 min，去除上清，加入垂体干细胞增殖培养基进行细胞重悬，最终以1×109 L-1的细胞浓度接种于培养瓶中，放置于37 ℃培养箱，每2 d加入0.2 μg表皮生长因子和0.2 μg碱性成纤维细胞生长因子，孵育7 d。
1.4.2 垂体干细胞的传代培养原代垂体干细胞培养过程中，每2 d观察细胞球大小与细胞状态，细胞球在培养7 d后直径大约为150 μm即可传代。收集待传代细胞于离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清加入1 mL Accutase消化酶，轻弹离心管至混匀，37 ℃消化3 min，用1 mL枪头吹打5次后继续37 ℃消化3 min，加入5 mL含有体积分数10%胎牛血清DMEM/F12终止消化，1 000 r/min离心5 min，PBS再次洗涤细胞沉淀后，用垂体干细胞增殖培养基重悬，完成传代。
1.4.3 垂体干细胞的鉴定将第3代垂体干细胞经消化成单细胞后，用垂体干细胞贴壁培养基进行贴壁处理12 h，PBS洗涤3次，细胞经多聚甲醛固定、TritonX-100通透、QuickBlock™免疫染色封闭液封闭后，加入1∶200稀释的Anti-SOX2或Anti-Nestin，4 ℃孵育过夜，经PBS洗涤后加入相应的二抗，最后使用DAPI染细胞核，应用激光共聚焦显微镜观察染色情况。
1.4.4 垂体干细胞增殖能力检测使用EdU细胞增殖试剂盒检测细胞增殖情况。将第3代垂体干细胞单细胞用垂体干细胞贴壁培养基进行贴壁处理12 h，弃去培养液，PBS清洗细胞，然后将37 ℃预热的2×EdU工作液与等体积完全培养基混合后加入，恒温培养箱中继续孵育细胞4 h完成EdU标记。细胞经固定、通透后，加入DAPI工作液进行核染，使用激光共聚焦显微镜观察染色情况。利用Image J软件统计分析EdU阳性细胞占所有细胞比例。
1.4.5 垂体干细胞的诱导分化及激素水平检测将第3代垂体干细胞单细胞用垂体干细胞贴壁培养基进行贴壁处理12 h，更换为垂体干细胞分化培养基，第3天再次更换垂体干细胞分化培养基，第5天收集细胞培养上清液，1 000 r/min离心5 min后去除沉淀取上清，应用ELISA法检测相关激素水平。
1.5 主要观察指标垂体干细胞的形态、生物学特征及分化情况。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 7.0 软件进行分析，计量资料表示为x±s。使用独立样本t检验进行两组间的统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过南京大学医学院附属鼓楼医院生物统计学专家审核。

讨论

垂体是人体最重要的内分泌腺，其中前叶(即腺垂体)可分泌多种激素，对代谢、生长、发育和生殖等有重要作用[1]。垂体干细胞是一种具有较强自我更新能力和促进垂体组织再生能力的细胞，胎儿出生后垂体在早期成熟过程中，垂体干细胞处于激活状态，并参与了新生儿腺垂体的成熟过程。鉴于干细胞在疾病中的治疗作用，如神经干细胞移植在脊髓损伤中的应用[13]，可见垂体干细胞对垂体损伤具有重要的潜在应用价值[1，28-29]。对于垂体瘤患者，手术、放疗和创伤性损伤均容易导致垂体功能减退，目前激素缺乏或垂体功能减退症的治疗方式主要依赖于重组激素替代疗法[30-31]，治疗重点还是替代缺乏的激素，但通常是替代靶激素治疗，例如：缺乏促甲状腺素的患者使用甲状腺激素。
因此，垂体干细胞的替代疗法有望成为一种新的治疗方式，该研究将为深入探讨垂体干细胞的临床转化提供参考。
原代培养垂体干细胞能够较好地保留生物学特性，可维持细胞原有的遗传特征及原始的生理病理过程，具有更高的临床应用价值。由于垂体体积小，因此选择新西兰白兔作为实验对象，与鼠垂体比较，具有体积大、细胞量多、易获取等优点。该研究采用悬浮细胞球培养法对兔垂体干细胞进行提取、鉴定，相较于流式细胞分选法具有操作简便、成本低、对细胞活性影响小等优点。首先从垂体窝中取出垂体培养24 h后，吸出培养瓶中的上清液转移至新的培养瓶内，以提高垂体干细胞的纯度。该过程没有磁珠或荧光抗体的费用，同时提高细胞获得的效率。垂体干细胞增殖能力随着年龄的增长而下降，研究发现在新生胎鼠垂体中SOX2阳性细胞比成年动物更丰富，当小鼠长至7月龄时垂体干细胞的数量及增殖能力显著降低[22]。因此，该实验采用出生24 h内的胎兔作为研究对象，可以提取较多的垂体干细胞，具有较强的增殖能力。前期实验证实，垂体中表达SOX2/Nestin的细胞具有增殖及分化为具有分泌功能细胞的能力，证明了SOX2/Nestin阳性细胞为垂体干细胞[20]。故该研究选取细胞形态更稳定的第3代垂体干细胞球进行标志性蛋白SOX2、Nestin免疫染色鉴定以及EdU细胞增殖检测，结果证实该细胞球SOX2表达阳性，并具有较强的增殖功能。调控胚胎SOX2表达细胞信号因子可参与调控成年垂体干细胞增殖与分化过程[20]；Wnt信号通路作为调控细胞增殖的重要通路之一[32]，研究也发现Wnt信号通路可通过旁分泌途径对垂体干细胞的增殖起到重要调控作用[33-34]。
基于不同的转录因子调控，垂体干细胞可分化为5种产生内分泌激素的细胞类型，继而通过分泌相应的激素而发挥重要的生理作用，包括促肾上腺皮质激素、生长激素、泌乳素、促甲状腺激素和促性腺激素[29，35]。因此，该研究将垂体干细胞贴壁处理并使用分化培养基进行诱导分化，通过ELISA检测细胞上清中的激素水平，探究垂体干细胞的分化潜力，结果显示在诱导分化5 d后促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促生长激素、促黄体生成激素、促卵泡素、催乳素激素水平较对照组显著升高，反映体外培养的垂体干细胞分化能力较强。
综上所述，该实验在新生新西兰兔垂体内获得的垂体干细胞具有增殖和分化的能力，且分化的细胞具有相对应的激素分泌能力。垂体干细胞的成功提取可为垂体干细胞的理论研究及临床应用奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

兔垂体干细胞的培养鉴定及分化

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本文评价

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