神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞的神经生成

doi:10.12307/2024.186

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 3994-3999.doi: 10.12307/2024.186

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神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞的神经生成

李震1，孙晓1，谢永鹏2，荣旺1，孙海涛3

连云港市第一人民医院，1创伤中心，3骨科，江苏省连云港市 222000；2连云港市第一人民医院急危重症医学部，连云港市急诊研究所，江苏省连云港市 222000

收稿日期:2023-03-21 接受日期:2023-08-07 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 孙晓，主任医师，连云港市第一人民医院创伤中心，江苏省连云港市 222000 谢永鹏，博士，副主任医师，连云港市第一人民医院急危重症医学部，连云港市急诊研究所，江苏省连云港市 222000
作者简介:李震，1993年生，江苏省连云港市人，2020年江苏大学毕业，硕士，医师，主要从事骨组织工程及神经再生方面的研究。
基金资助:
连云港市第一人民医院青年英才基金(QN2213)，项目负责人：李震；江苏省卫健委医学科研项目(H2019109)，项目负责人：谢永鹏

Neuron-derived extracellular vesicles promote neurogenesis of neural stem cells

Li Zhen1, Sun Xiao1, Xie Yongpeng2, Rong Wang1, Sun Haitao3

1Trauma Center, 3Department of Orthopedics, First People’s Hospital of Lianyungang, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China; 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, First People’s Hospital of Lianyungang, Institute of Emergency Medicine of Lianyungang, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China

Received:2023-03-21 Accepted:2023-08-07 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Sun Xiao, Chief physician, Trauma Center, First People’s Hospital of Lianyungang, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China Xie Yongpeng, MD, Associate chief physician, Department of Emergency and Critical Care Medicine, First People’s Hospital of Lianyungang, Institute of Emergency Medicine of Lianyungang, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China
About author:Li Zhen, Master, Physician, Trauma Center, First People’s Hospital of Lianyungang, Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China
Supported by:
Youth Project of First People’s Hospital of Lianyungang, No. QN2213 (to LZ); Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health Commission of China, No. H2019109 (to XYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞外囊泡：是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，可包括外泌体、微粒、凋亡小体和癌小体。细胞外囊泡包含多种生物活性分子，可运载胞质蛋白、膜蛋白、细胞因子、趋化因子、细胞受体、非编码RNA及mRNA和miRNA，参与细胞间通讯、细胞迁移分化、血管新生和免疫调节等多方面功能调控。
细胞分化：是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。

背景：已有研究表明，神经干细胞能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。间充质干细胞来源细胞外囊泡被证实能够透过血脑屏障到达中枢神经损伤部位，促进神经修复。然而，神经元来源细胞外囊泡是否促进神经干细胞向有益于神经生成的方向分化，帮助神经修复，还不是很明确。

目的：探究神经元来源细胞外囊泡是否有利于神经干细胞向神经生成的方向分化。
方法：用胰酶消化法从新生SD大鼠大脑皮质中提取神经元和神经干细胞。收集培养神经元的细胞上清，提取神经元来源细胞外囊泡。将培养10 d的神经干细胞与神经元来源细胞外囊泡或PBS共培养7 d，采用免疫印迹、免疫荧光和RT-qPCR技术分别检测神经元、神经干细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞特异性标志蛋白的表达。

结果与结论：神经干细胞与神经元来源细胞外囊泡共培养后，高表达神经元特异性蛋白β3微管蛋白、神经丝蛋白200和少突胶质细胞特异性蛋白髓鞘碱性蛋白，低表达星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白。这些结果说明，神经元来源细胞外囊泡能够促进神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化，抑制其向星形胶质细胞分化。

https://orcid.org/0000-0001-8294-2859 (李震)； https://orcid.org/0009-0009-4173-520X (孙晓)；https://orcid.org/0000-0001-5787-5463 (谢永鹏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 神经元, 神经干细胞, 星形胶质细胞, 少突胶质细胞, 细胞外囊泡, 分化, 干细胞移植, 神经损伤

Abstract: BACKGROUND: It has been shown that neural stem cells can differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles have also been shown to cross the blood-brain barrier to reach sites of central nervous injury and promote neural repair. However, it is not clear whether neuron-derived extracellular vesicles promote the differentiation of neural stem cells in a direction that is beneficial for neurogenesis.
OBJECTIVE: To investigate whether neuron-derived extracellular vesicles facilitate neural stem cell differentiation towards neurogenesis.
METHODS: Neurons and neural stem cells were extracted from neonatal SD rat cerebral cortex by trypsin digestion. Cell supernatants of neurons were collected. Neuron-derived extracellular vesicles were extracted. Neural stem cells cultured for 10 days were co-cultured with neuron-derived extracellular vesicles or PBS for 7 days. Immunoblotting, immunofluorescence, and RT-qPCR were used to detect proteins specifically expressed by neurons, neural stem cells, oligodendrocytes, and astrocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: The neural stem cells co-cultured with neuron-derived extracellular vesicles showed high expression of neuron-specific proteins and oligodendrocyte-specific proteins including β3-tubulin, neurofilament 200 and myelin basic protein, and low expression of astrocyte-specific protein glial fibrillary acidic protein. These results suggest that neuron-derived extracellular vesicles can promote the differentiation of neural stem cells into neurons and oligodendrocytes and prevent the differentiation of neural stem cells into astrocytes.

Key words: neuron, neural stem cell, astrocyte, oligodendrocyte, extracellular vesicle, differentiation, stem cell transplantation, nerve injury

中图分类号:

李震, 孙晓, 谢永鹏, 荣旺, 孙海涛. 神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞的神经生成[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3994-3999.

Li Zhen, Sun Xiao, Xie Yongpeng, Rong Wang, Sun Haitao. Neuron-derived extracellular vesicles promote neurogenesis of neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 3994-3999.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠神经元鉴定结果分离并培养大鼠神经元，随着培养时间的延长，观察到细胞逐渐贴壁并长出长突起，突起数量也逐渐增多，细胞周围光晕明显。培养至第6天，细胞贴壁，每个细胞有多个长突起，交错成网，见图1A。免疫荧光检测高表达神经元特异性表达的标志蛋白NSE，见图1B-D，说明成功获得大鼠原代神经元。

2.2 神经元来源细胞外囊泡鉴定结果透射电子显微镜观察神经元来源细胞外囊泡形态近似圆形或椭圆形杯状，见图2A；动态光粒子散射仪显示神经元胞外囊泡直径在10-200 nm 之间，见图2B。Western blot 检测发现神经元胞外囊泡高表达细胞外囊泡特异性标志蛋白CD9、CD63和TSG101，见图2C。

2.3 神经干细胞的鉴定结果刚提取的神经干细胞有少量贴壁，大部分悬浮呈单细胞样分布，折光性好。随着培养时间的延长，可观察到细胞聚集成团，大小不等，形似桑葚。细胞团直径逐渐增大，部分克隆球中心变暗，经消化换液及传代后形态更加均匀、规整、折光性好且无明显突起，第2，4，10天神经干细胞的形态，见图3A-C。免疫荧光检测结果显示，提取的细胞高表达神经干细胞标志性蛋白NSE、SOX2和 CD133，提示获得较高纯度的神经干细胞，见图3D-L。

2.4 神经元来源细胞外囊泡对神经干细胞分化的影响与PBS处理组相比，神经元来源细胞外囊泡处理后神经干细胞形态发生明显改变，细胞突起明显，胞体饱满，部分细胞形态呈神经元样，部分细胞似少突胶质细胞样，见图4A-C。RT-qPCR检测发现，相比于PBS组，神经元来源细胞外囊泡组神经元特异性标志蛋白β3-Tubulin、GAP43、NF200的表达升高，少突胶质细胞的标志蛋白MBP的表达也有升高，见图4D，此外，星形胶质细胞特异性标志蛋白GFAP的表达下降。相应地，免疫印迹技术和免疫荧光检测也发现β3-Tubulin、NF200和MBP蛋白表达升高，而GFAP表达降低，见图4E和图5。这些结果说明，神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞向神经元及少突胶质细胞方向分化，抑制星形胶质细胞分化，有利于神经生成。

参考文献

[1] REYNOLDS BA, WEISS S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 1992;255(5052):1707-1710.
[2] XU B, YIN M, YANG Y, et al. Transplantation of neural stem progenitor cells from different sources for severe spinal cord injury repair in rat. Bioact Mater. 2022;23:300-313.
[3] ASSINCK P, DUNCAN GJ, HILTON BJ, et al. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 2017;20(5):637-647.
[4] 陈晓丽, 李少川, 陈久智, 等. 神经干细胞治疗脊髓损伤的研究近况[J].中国医药生物技术,2017,12(5):424-428.
[5] 李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲,等. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J].中国组织工程研究,2023,27(6):890-896.
[6] LU P, WOODRUFF G, WANG Y, et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 2014;83(4):789-796.
[7] LU P, WANG Y, GRAHAM L, et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 2012;150(6):1264-1273.
[8] ROSENZWEIG ES, BROCK JH, LU P, et al. Restorative effects of human neural stem cell grafts on the primate spinal cord. Nat Med. 2018;24(4):484-490.
[9] SALEWSKI RP, MITCHELL RA, LI L, et al. Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cells Mediate Functional Recovery Following Thoracic Spinal Cord Injury Through Remyelination of Axons. Stem Cells Transl Med. 2015;4(7):743-754.
[10] O’SHEA TM, BURDA JE, SOFRONIEW MV. Cell biology of spinal cord injury and repair. J Clin Invest. 2017;127(9):3259-3270.
[11] FITCH MT, SILVER J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 2008;209(2):294-301.
[12] MATHIEU M, MARTIN-JAULAR L, LAVIEU G, et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 2019;21(1):9-17.
[13] ZOMER A, MAYNARD C, VERWEIJ FJ, et al. In Vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 2015;161(5): 1046-1057.
[14] VALADI H, EKSTRÖM K, BOSSIOS A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 2007;9(6):654-659.
[15] HUANG CC, NARAYANAN R, ALAPATI S, et al. Exosomes as biomimetic tools for stem cell differentiation: Applications in dental pulp tissue regeneration. Biomaterials. 2016;111:103-115.
[16] SHARMA P, MESCI P, CARROMEU C, et al. Exosomes regulate neurogenesis and circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(32):16086-16094.
[17] CHOU CH, FAN HC, HUENG DY. Potential of Neural Stem Cell-Based Therapy for Parkinson’s Disease. Parkinsons Dis. 2015;2015:571475.
[18] PARMAR M. Towards stem cell based therapies for Parkinson’s disease. Development. 2018;145(1):dev156117.
[19] HAYASHI Y, LIN HT, LEE CC, et al. Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer’s disease models. J Biomed Sci. 2020;27(1):29.
[20] IM W, LEE ST, CHU K, et al. Stem Cells Transplantation and Huntington’s Disease. Int J Stem Cells. 2009;2(2):102-108.
[21] CHOI KA, CHOI Y, HONG S. Stem cell transplantation for Huntington’s diseases. Methods. 2018;133:104-112.
[22] ZHANG HA, YUAN CX, LIU KF, et al. Neural stem cell transplantation alleviates functional cognitive deficits in a mouse model of tauopathy. Neural Regen Res. 2022;17(1):152-162.
[23] GHOBRIAL GM, ANDERSON KD, DIDIDZE M, et al. Human Neural Stem Cell Transplantation in Chronic Cervical Spinal Cord Injury: Functional Outcomes at 12 Months in a Phase II Clinical Trial. Neurosurgery. 2017;64(CN_suppl_1):87-91.
[24] CURTIS E, MARTIN JR, GABEL B, et al. A First-in-Human, Phase I Study of Neural Stem Cell Transplantation for Chronic Spinal Cord Injury. Cell Stem Cell. 2018; 22(6):941-950.
[25] LEVI AD, OKONKWO DO, PARK P, et al. Emerging Safety of Intramedullary Transplantation of Human Neural Stem Cells in Chronic Cervical and Thoracic Spinal Cord Injury. Neurosurgery. 2018;82(4):562-575.
[26] LEVI AD, ANDERSON KD, OKONKWO DO, et al. Clinical Outcomes from a Multi-Center Study of Human Neural Stem Cell Transplantation in Chronic Cervical Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. 2019;36(6):891-902.
[27] SHIN JC, KIM KN, YOO J, et al. Clinical Trial of Human Fetal Brain-Derived Neural Stem/Progenitor Cell Transplantation in Patients with Traumatic Cervical Spinal Cord Injury. Neural Plast. 2015;2015:630932.
[28] WU CC, LIEN CC, HOU WH, et al. Gain of BDNF Function in Engrafted Neural Stem Cells Promotes the Therapeutic Potential for Alzheimer’s Disease. Sci Rep. 2016;6:27358.
[29] MARSH SE, BLURTON-JONES M. Neural stem cell therapy for neurodegenerative disorders: The role of neurotrophic support. Neurochem Int. 2017;106:94-100.
[30] CUMMINGS BJ, UCHIDA N, TAMAKI SJ, et al. Human neural stem cell differentiation following transplantation into spinal cord injured mice: association with recovery of locomotor function. Neurol Res. 2006;28(5):474-481.
[31] HE N, MAO XJ, DING YM, et al. New insights into the biological roles of immune cells in neural stem cells in post-traumatic injury of the central nervous system. Neural Regen Res. 2023;18(9):1908-1916.
[32] HANEY MJ, KLYACHKO NL, ZHAO Y, et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. J Control Release. 2015;207:18-30.
[33] GUO S, PERETS N, BETZER O, et al. Intranasal Delivery of Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes Loaded with Phosphatase and Tensin Homolog siRNA Repairs Complete Spinal Cord Injury. ACS Nano. 2019;13(9):10015-10028.
[34] MAROTE A, TEIXEIRA FG, MENDES-PINHEIRO B, et al. MSCs-Derived Exosomes: Cell-Secreted Nanovesicles with Regenerative Potential. Front Pharmacol. 2016;7:231.
[35] PERETS N, HERTZ S, LONDON M, et al. Intranasal administration of exosomes derived from mesenchymal stem cells ameliorates autistic-like behaviors of BTBR mice. Mol Autism. 2018;9:57.
[36] NI H, YANG S, SIAW-DEBRAH F, et al. Exosomes Derived From Bone Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Early Inflammatory Responses Following Traumatic Brain Injury. Front Neurosci. 2019;13:14.
[37] WILLIAMS AM, DENNAHY IS, BHATTI UF, et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Provide Neuroprotection and Improve Long-Term Neurologic Outcomes in a Swine Model of Traumatic Brain Injury and Hemorrhagic Shock. J Neurotrauma. 2019;36(1):54-60.
[38] REZA-ZALDIVAR EE, HERNÁNDEZ-SAPIÉNS MA, MINJAREZ B, et al. Potential Effects of MSC-Derived Exosomes in Neuroplasticity in Alzheimer’s Disease. Front Cell Neurosci. 2018;12:317.
[39] FÜHRMANN T, ANANDAKUMARAN PN, SHOICHET MS. Combinatorial Therapies After Spinal Cord Injury: How Can Biomaterials Help? Adv Healthc Mater. 2017; 6(10):1601130.
[40] XU B, ZHANG Y, DU XF, et al. Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity. Cell Res. 2017;27(7):882-897.
[41] YIN Z, HAN Z, HU T, et al. Neuron-derived exosomes with high miR-21-5p expression promoted polarization of M1 microglia in culture. Brain Behav Immun. 2020;83:270-282.

引言

中枢神经损伤后自体的修复能力十分有限。许多神经损伤及神经退行性疾病，包括脑卒中、脊髓损伤、帕金森病、阿尔茨海默症等，尚无较好的治疗方法。成人中枢神经元被认为是不可再生和不可替代的细胞，1992年，REYNOLDS等[1]的研究首次验证神经干细胞的存在，从成年小鼠大脑分离的细胞有分化为神经元和星形胶质细胞的能力。随着对神经干细胞了解的增多以及组织工程研究的深入，研究者们希望通过神经干细胞移植来促进损伤的中枢神经修复和再生[2-5]。
研究发现，移植到中枢神经损伤部位的神经干细胞能够分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等多种类型细胞[6-8]。移植分化而来的神经元能够形成长轴突，跨越损伤部位，与自体神经形成大量突触，恢复部分神经环路功能[6-7]；由神经干细胞分化的少突胶质细胞能够再髓鞘化，帮助神经功能恢复[9]；星形胶质细胞在受损的脊髓组织周围反应性增生，形成瘢痕，防止组织损伤造成的炎症进一步扩散，但是这种形成的机械屏障却阻碍了神经再生[10-11]。
几乎所有的细胞都会释放细胞外囊泡，细胞质膜连续内陷而形成多囊泡体，多囊泡体可以与细胞内其他囊泡或者细胞器融合后再分离。因此，细胞外囊泡的成分多样，可以包含多种细胞成分，包括DNA、RNA、脂质、代谢物和细胞表面蛋白等。细胞外囊泡可以通过膜融合的方式将其内含物转移到受体细胞中，从而介导细胞间通讯，影响受体细胞[12-14]。最近多项研究表明，细胞外囊泡能够影响干细胞的分化，可作为潜在的仿生工具诱导干细胞向特定的谱系分化[15]。从人多能干细胞来源的神经元培养物中分离的细胞外囊泡能够促进人神经元增殖和分化。动物实验也证明细胞外囊泡在体内有生物活性并促进神经细胞增殖[16]。总之，这些研究都表明，细胞外囊泡可以通过各种机制调节干细胞的分化，对组织的修复和再生有着重要的意义。
鉴于以上研究进展，作者推测来源于神经元的细胞外囊泡极有可能影响神经干细胞的分化。神经干细胞移植的同时应用神经元来源细胞外囊泡可能更有利于神经损伤的修复，为治疗中枢神经系统损伤提供新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外培养大鼠神经元和神经干细胞，分离神经元的细胞外囊泡，并用神经元来源细胞外囊泡处理神经干细胞。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2022年12月在江苏大学基础医学院和连云港市第一人民医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物新生24 h SD乳鼠，体质量5-10 g，用于提取神经元细胞和神经干细胞。所有实验动物由江苏大学实验动物中心提供，饲养于江苏大学SPF级动物房，动物合格编号：NO.202105363，NO.202110777，所有动物实验操作均符合江苏大学动物伦理委员会要求和规定，审批号为UJS-IACUC-AP-2020052902。
1.3.2 实验试剂和仪器 PBS、DMEM/F12培养基(BI)；2%B27(华韵生物科技有限公司)；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、Accutase、青霉素-链霉素、胎牛血清、谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco)；ECL发光液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或抗鼠IgG抗体(武汉Proteintech)；Prime Script RT试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒(南京诺唯赞)；40 g/L多聚甲醛、牛血清白蛋白(徐州VICMED)；阿糖胞苷(上海麦克林生化科技有限公司)；L-多聚赖氨酸、TRIzol 试剂(Sigma )；BCA试剂盒(上海碧云天)；引物(中国南京金斯瑞)；细胞爬片(白鲨)；抗体β3微管蛋白(β3-Tubulin)、CD9、CD63、TSG101、CD133、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、SOX2、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、生长相关蛋白43(growth-associated protein-43，GAP43)、神经丝蛋白200(neurofilament 200，NF200)、GAPDH(武汉ABclonal)；Cy3标记或FITC标记荧光二抗(美国Abcam)；ExoQuick-TC(SBI)；0.22 μm无菌过滤器(洁特)；PVDF膜(美国Millipore公司)；普通离心机、微量移液器(德国Eppendorf)；AllegraTM X-12R Centrifuge高速离心机(美国贝克曼)；细胞超净工作台(中国博科)；Applied Biosystems 7500快速实时荧光定量PCR系统、CO2细胞培养箱(美国赛默飞)；200目滤网(美国Corning)；普通相差倒置显微镜、倒置荧光显微镜(日本Olympus)；Western blot电泳转印系统(美国Bio-Rad)；动态光粒子散射仪(美国Wyatt
Technology)；Tecnai 12透射电镜(荷兰Philips)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠神经元的提取、培养和鉴定新生24 h内的SD乳鼠于体积分数为75%乙醇中浸泡消毒5 min，在超净工作台中取出其大脑皮质，置于PBS中清洗，剔离脑膜及血管组织，剪碎，用含 EDTA 的0.125% 胰蛋白酶消化，轻柔吹打20下左右，再加入DMEM/F12完全培养基(DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+ 1%青霉素-链霉素)终止消化，200目筛网过滤以除去组织块，细胞悬液滤至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，再用DMEM/F12完全培养基重悬细胞，将适量细胞接种于多聚赖氨酸预处理后的 6 cm培养皿中，37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养24 h后，使用含5 μmol/L阿糖胞苷的神经元培养液(DMEM/F12培养基+2% B27+1%谷氨酰胺+1%青霉素-链霉素)培养细胞，24 h后再用无阿糖胞苷的神经元培养液培养细胞，之后每两三天半量换液，大约6 d后细胞可用于后续实验，通过免疫荧光检测神经元标志蛋白NSE的表达鉴定神经元细胞。
1.4.2 大鼠神经元细胞外囊泡的提取与鉴定使用试剂盒提取细胞外囊泡。收集1.4.1中培养神经元的细胞上清液，500×g离心10 min去除细胞，2 000×g离心15 min去除细胞碎片；再使用高速离心机10 000×g 离心30 min去除亚细胞碎片；用0.22 μm无菌滤器过滤细胞上清，然后使用细胞外囊泡提取试剂盒提取细胞外囊泡，最后用100 μL PBS重悬沉淀，保存于-80 ℃备用。
取适量细胞外囊泡重悬液轻轻滴于电镜专用铜网，然后用2%磷钨酸负染5-10 min，置于透射电镜下观察、拍照。然后用动态光粒子散射仪检测囊泡的大小。免疫印迹法检测细胞外囊泡标志蛋白CD9、CD63和TSG101的表达。
1.4.3 大鼠神经干细胞的提取、培养和鉴定新生24 h内的SD乳鼠于体积分数为75%乙醇中浸泡消毒1 min，转移至超净台中，取出其大脑皮质，置于PBS中，剔离脑膜及血管组织后，转移至另一无菌平皿中剪碎，加入含 EDTA的0.125%胰蛋白酶，移液器吹打混匀消化1 min；随后加入5倍体积的神经干细胞培养基(95% DMEM/F12，2% B27，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮生长因子，1%双抗)终止消化，再次轻柔吹打混匀；70 μm细胞筛网过滤掉较大的组织，4 ℃，1 000 r/min离心5 min；弃上清，神经干细胞培养基重悬沉淀，接种细胞于培养皿，37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养；次日换液，此后每2 d半量换液。观察细胞生长状况，待神经干细胞聚集成球且较大，球心折光度变暗时进行传代；4 ℃，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清，Accutase消化液37 ℃消化沉淀15 min，神经干细胞培养基终止消化后轻柔吹打重悬；悬浮液1 000 r/min离心30 s，沉淀为消化不充分的神经球，视情况可再次消化，上清液1 000 r/min离心5 min，重悬后接种于培养皿中。免疫荧光检测神经干细胞标志蛋白NSE、SOX2和CD133的表达以鉴定神经干细胞。
1.4.4 神经元来源细胞外囊泡与神经干细胞共培养将培养10 d的神经干细胞轻柔吹打成单细胞，接种至6孔培养板，每孔3×105个细胞，静息培养12 h后，加入神经元来源细胞外囊泡(1 mg/mL)或PBS共培养，诱导分化7 d。
1.4.5 免疫印迹分析蛋白表达量 ①细胞蛋白提取：收集PBS或神经元来源细胞外囊泡共培养7 d后的神经干细胞，用4 ℃预冷的 PBS 洗2遍，置于冰上，加入适量RIPA裂解液，用细胞刮刀刮下细胞并收集至EP管中，用涡旋仪涡旋15 s，置于冰上裂解20 min后，4 ℃、13 200 r/min离心15 min，收集上清至1.5 mL EP管中，再向EP管中加入1/4体积的5 ×Protein loading buffer，混匀后放到95 ℃金属浴上煮5 min，然后将样品置于冰上或置于-20 ℃冰箱保存。②细胞外囊泡蛋白提取：用BCA 蛋白检测试剂盒定量检测细胞外囊泡的蛋白浓度，将5×Protein loading buffer加入细胞外囊泡中充分混匀后，95 ℃金属浴上煮5 min。③SDS-PAGE凝胶电泳：将配制好的10% PAGE胶安装至电泳槽中。上样后，浓缩胶中电泳电压为90 V，样品进入分离胶后再调整电压为120 V。④转膜：电泳结束后，切去浓缩胶，将胶转移至转膜液中。无水甲醇激活PVDF 膜后转移至转膜液中平衡。组装好PAGE胶、PVDF膜和滤纸后，在转膜槽中恒压100 V转膜 90 min。⑤封闭和抗体孵育：室温下，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜3次，4 ℃下摇床孵育一抗(Anti-GFAP、Anti-NF200、Anti-MBP、Anti-β3-Tubulin、Anti-CD9、Anti-CD63、Anti-TSG101、Anti-GAPDH)过夜，TBST洗膜3次，室温下二抗孵育1 h后用TBST洗涤3次，最后用ECL化学发光液显色，化学发光成像仪采集图像。

1.4.6 实时定量PCR ①RNA提取：收集PBS或神经元来源细胞外囊泡共培养7 d后的神经干细胞，预冷的PBS洗2遍，在通风橱中，在每个样品中加入500 μL Trizol，反复吹打，充分裂解后吸到新的EP管中，加入100 μL氯仿，在涡旋仪上涡旋15 s，冰上静置，待液面分层后，4 ℃、13 200 r/min离心15 min，吸取上清至新的EP 管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，冰上静置15 min，然后4 ℃、13 200 r/min离心15 min，弃上清，600 μL体积分数为75%乙醇洗涤2次后，将EP管倒扣桌面，干燥5-10 min，最后向EP管中加入30 μL DEPC水溶解RNA，55 ℃加热5 min，促进RNA溶解。②反转录：取 500 ng RNA 用诺唯赞反转录试剂盒进行反转录。③最后用SYBR Green PCR试剂盒进行扩增，ABI 7500检测。基因引物序列见表1。

1.4.7 免疫荧光将细胞爬片提前放置于24孔板中，用多聚赖氨酸处理，充分干燥后按10 000个/孔接种神经干细胞，给予PBS或神经元来源细胞外囊泡共培养7 d，弃去培养基，用预冷PBS洗2遍，加入 300 μL 40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗去残余固定液，用含 0.1% TritonX-100和1% BSA的 PBS破膜，PBS清洗，每孔加入200 µL含1% BSA的PBS，封闭1 h。一抗(GFAP、MBP、NF200)1∶250 稀释在1% BSA溶液中，4 ℃过夜孵育，然后PBS洗5 遍，每孔加入200 µL二抗，室温孵育1.5 h，PBS洗5遍，DPAI 染料1∶2 000 稀释，每孔200 µL，室温染色5 min，然后PBS洗5遍。将细胞爬片抠出，室温晾干。滴加适量抗荧光淬灭剂于载玻片，将细胞爬片倒扣在载玻片上，涂抹少量指甲油在爬片四周以固定爬片，最后使用荧光显微镜拍照。
1.5 主要观察指标免疫荧光检测PBS或神经元来源细胞外囊泡共培养后的神经干细胞中GFAP、MBP、NF200蛋白的表达；实时定量PCR检测PBS或神经元来源细胞外囊泡共培养后的神经干细胞中β3-tubulin、GAP43、GFAP、MBP和NF200的mRNA相对表达量；免疫印迹检测PBS或神经元来源细胞外囊泡共培养后的神经元干细胞中GFAP、NF200、MBP、β3-tubulin的蛋白表达。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料均以x±s表示，两组间比较采用非配对 t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经通过连云港市第一人民医院生物统计学专家审核。

讨论

神经干细胞能自我更新且具有多向分化潜能，可以分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等。在帕金森病[17-18]、阿尔茨海默症[19]、亨廷顿病等神经退行性疾病的动物模型中，神经干细胞移植被证明能明显改善认知行为[20-22]。已有几项神经干细胞移植治疗人脊髓损伤的临床试验发现，不管是商业来源的神经干细胞系，还是胎儿来源的神经干细胞都能提高患者脊髓功能评分，目前随访结果也未见明显不良反应[23-27]。神经干细胞的治疗效果依赖于移植的神经干细胞的存活情况，神经干细胞分化成的神经元和神经胶质细胞补充损伤部位细胞，同时提供了神经营养因子，还具有免疫调节功能[10，28-31]。
细胞外囊泡能够影响谱系分化，有很强的生物相容性和低免疫原性，细胞类型特异性外泌体可作为潜在的仿生工具诱导干细胞向特定的谱系分化[15]。细胞外囊泡能够通过血脑屏障到达中枢神经损伤部位，因此也被期望作为一种新型高效的递送载体[32-33]。许多研究表明，间充质干细胞来源细胞外囊泡在神经系统疾病中帮助再生，包括自闭症、阿尔茨海默症、创伤性脑损伤、帕金森病[32，34-38]。
该研究分离培养大鼠大脑皮质神经元和神经干细胞。从培养神经元的细胞上清液中提取神经元细胞外囊泡，然后与神经干细胞共培养，结果发现这些细胞外囊泡能够诱导神经干细胞表达更多的神经元标志蛋白和少突胶质细胞标志蛋白。研究表明，移植的神经干细胞通过分化为神经元和少突胶质细胞促进神经损伤修复，恢复部分神经功能，分化的神经元能够在损伤部位与自体神经元形成突触[6-7]。少突胶质细胞包裹轴突，形成绝缘的髓鞘，是维持动作电位传播和神经功能必不可少的，移植的神经干细胞也能够生成少突胶质细胞而实现再髓鞘化[9]。因此，促进移植的神经干细胞向神经元和神经胶质细胞分化，或许能加速神经损伤修复，提高神经干细胞移植的成功率。该研究发现了神经元细胞外囊泡促进神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化，为提高干细胞治疗效果提供新思路。此外，神经干细胞还能分化为星形胶质细胞，这被认为不利于神经修复，更容易导致抑制性环境的形成[11]。在神经损伤处，干细胞处于抑制性的环境可导致生长分化不成功、移植细胞死亡等情况，因此需要高剂量或多次细胞移植才能取得一定的效果。因此，干细胞移植联合其他治疗方式，如生物材料支架、神经营养因子等，被期望能够促进移植干细胞的存活、分化和整合，或直接作用于宿主组织，促进神经元轴突再生，保护神经元[39]。该研究也证实，神经元细胞外囊泡能够降低神经干细胞表达星形胶质细胞标志蛋白，这也有利于神经干细胞的神经生成。
细胞外囊泡包含多种生物活性分子，已有多项研究发现，神经元来源细胞外囊泡通过转运microRNAs影响其他细胞的功能。XU等[40]发现神经元通过分泌细胞外囊泡转运miRNA-132至内皮细胞，调节血管内皮钙黏蛋白的表达，从而调节脑血管的完整性。神经元细胞系PC12细胞通过细胞外囊泡转运 miR-21-5p至小胶质细胞中，影响小胶质细胞的极化[41]。该研究中神经元来源细胞外囊泡中是否含有某种microRNAs促进神经干细胞的分化，还有待进一步的探究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞的神经生成

Neuron-derived extracellular vesicles promote neurogenesis of neural stem cells

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[1]	杨玉芳, 杨芷姗, 段棉棉, 刘毅恒, 唐正龙, 王宇. 促红细胞生成素在骨组织工程中的应用及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1443-1449.
[2]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[3]	穆秉桃, 于婧文, 刘春云, 郭敏芳, 孟涛, 杨鹏伟, 魏文悦, 宋丽娟, 尉杰忠, 马存根. 黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞免疫调节的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1057-1062.
[4]	刘可心, 宋丽娟, 吴艺舸, 韩光远, 苗珠月, 魏汝恒, 肖保国, 马存根, 黄建军. 羟基红花黄色素A干预脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞脂质运载蛋白2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1063-1069.
[5]	刘建宏, 廖世杰, 李波香, 唐生平, 韦帧翟, 丁晓飞. 细胞外囊泡携带非编码RNA调控破骨细胞的活化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1076-1082.
[6]	王姗姗, 舒晴, 田峻. 物理因子促进干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1083-1090.
[7]	刘瀚峰, 王晶晶, 余云生. 人造外泌体治疗心肌梗死：应用现状及前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1118-1123.
[8]	诸葛晓萱, 李策, 包广洁, 康宏. 缝隙连接蛋白43经典与非经典作用在疾病治疗中的潜在价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1130-1136.
[9]	冯睿钦, 韩娜, 张蒙, 谷馨怡, 张丰识. 1%富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞促进周围神经损伤的修复[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 985-992.
[10]	王雯, 郑芃芃, 孟浩浩, 刘浩, 袁长永. 过表达Sema3A促进牙髓干细胞和MC3T3-E1的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 993-999.
[11]	邱晓燕, 李碧欣, 黎敬弟, 范垂钦, 马廉, 王鸿武. MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1000-1006.
[12]	李龙洋, 张松江, 赵献敏, 周春光, 高剑峰. 电针干预阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元和少突胶质细胞的增殖分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1029-1035.
[13]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[14]	李立斯, 张成栋, 李小龙, 叶姿妤, 蒲超, 杨在君, 匙峰, 肖东琴. 双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 373-379.
[15]	岳婷婷, 朱婷, 毛剑男, 李伟, 杭春华. 兔垂体干细胞的培养鉴定及分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3942-3946.