无动物源成分纯细胞因子从深低温冻存脐血中高效扩增NK细胞

doi:10.12307/2023.318

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (10): 1572-1577.doi: 10.12307/2023.318

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

无动物源成分纯细胞因子从深低温冻存脐血中高效扩增NK细胞

刁小娟1，2，石超群1，2，李栋3，王帅1，2，肖春1，2，刘国军1，2，曲廷瑜1，2，杨卫娟1，2，贾晓鹏1，2

1山东省齐鲁干细胞工程有限公司，山东省济南市 250100； 2山东省脐带血造血干细胞库，山东省济南市 250100；3山东大学齐鲁医院低温医学研究室，山东省济南市 250012

收稿日期:2022-03-04 接受日期:2022-06-06 出版日期:2023-04-08 发布日期:2022-09-08
通讯作者: 贾晓鹏，博士，研发中心总监，山东省齐鲁干细胞工程有限公司，山东省济南市 250100；山东省脐带血造血干细胞库，山东省济南市 250100
作者简介:刁小娟，女，1987年生，山东省济南市人，硕士，副高级工程师，主要从事免疫细胞及干细胞方面的研究。
基金资助:
山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目(2019JZZY011012)，项目负责人：曲廷瑜

Efficient expansion of natural killer cells from cryopreserved umbilical cord blood by pure cytokine method without animal ingredients

Diao Xiaojuan1, 2, Shi Chaoqun1, 2, Li Dong3, Wang Shuai1, 2, Xiao Chun1, 2, Liu Guojun1, 2, Qu Tingyu1, 2, Yang Weijuan1, 2, Jia Xiaopeng1, 2

1Shandong Province Qilu Stem Cell Engineering Co., Ltd., Jinan 250100, Shandong Province, China; 2Cord Blood Bank of Shandong Province, Jinan 250100, Shandong Province, China; 3Cryomedicine Lab, Qilu Hospital, Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2022-03-04 Accepted:2022-06-06 Online:2023-04-08 Published:2022-09-08
Contact: Jia Xiaopeng, PhD, Shandong Province Qilu Stem Cell Engineering Co., Ltd., Jinan 250100, Shandong Province, China; Cord Blood Bank of Shandong Province, Jinan 250100, Shandong Province, China
About author:Diao Xiaojuan, Master, Associate senior engineer, Shandong Province Qilu Stem Cell Engineering Co., Ltd., Jinan 250100, Shandong Province, China; Cord Blood Bank of Shandong Province, Jinan 250100, Shandong Province, China
Supported by:
Project of Shandong Key Research & Development Program (Major Scientific and Technological Innovation Project), No. 2019JZZY011012 (to QTY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
体外杀伤实验：杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面，免疫系统中有多种具有杀伤功能的细胞，如自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞等。体外杀伤实验是指在体外模拟体内条件，进而检测对某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞杀伤活性的实验。

背景：从深低温冻存脐血中获得大量高纯度无滋养层细胞、无动物源成分的NK细胞，以便更好地开展NK细胞杀伤肿瘤的实验研究，此次研究通过使用NK扩增培养试剂盒和血清替代物，以获得安全、高效的体外扩增培养NK细胞的方法。
目的：建立一种从冷冻脐血中采用纯细胞因子扩增NK细胞的技术体系并证明其体外杀瘤能力。
方法：解冻液氮存储的冻存脐血，优化复苏体系，采用Ficoll密度梯度离心的方法收集脐血单个核细胞，接种于预先铺板的T175培养瓶中，采用细胞因子试剂盒+血清替代物法培养21 d后收集细胞并计数，应用流式细胞术检测细胞中CD3-CD56+的比例，并将所得数据与K562滋养层细胞+胎牛血清的培养方法进行对比分析。同时以髓系白血病细胞K562为靶细胞，采用CCK-8试剂盒检测不同效靶比NK细胞杀伤K562细胞的作用。最后进行了12 h内的模拟储存运输实验，采用流式检测CD3-CD56+的比例变化，并使用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率。
结果与结论：①采用K562滋养层细胞+胎牛血清的培养方法扩增培养14 d，细胞扩增(51.47±4.28)倍；采用细胞因子试剂盒+血清替代物法扩增培养21 d，细胞数量5×109以上，细胞扩增(328.32±116.36)倍，细胞扩增倍数明显升高，2种方法获得的CD3-CD56+纯度比例均在80%以上，未见明显差异；②纯细胞因子方法培养后的NK细胞对K562细胞的杀伤效果(效靶比=10∶1)达80%以上；③在12 h的模拟储运实验中，CD3-CD56+的比例变化不明显，直至第12小时，NK细胞凋亡率< 7%；④结果表明：优化复苏体系和纯细胞因子扩增方法可以高效培养出高纯度的NK细胞，同时具有有效杀伤K562肿瘤细胞的能力，且经过12 h储运后仍然具有良好的细胞纯度和较低的凋亡率。

https://orcid.org/0000-0001-5638-3010 (刁小娟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 冷冻脐血, NK细胞, 因子, 扩增, 细胞毒性, 凋亡率, 配型, 临床应用

Abstract: BACKGROUND: To obtain a large number of high purity trophoblast-free, animal-derived natural killer (NK) cells from deep cryopreserved cord blood for better experimental studies on tumor killing by NK cells, a safe and efficient method for expanding and culturing NK cells in vitro was obtained by using NK expansion culture kits and serum substitutes.
OBJECTIVE: To establish a technical system for the expansion of NK cells from frozen cord blood using pure cytokines, and demonstrate their tumor-killing ability in vitro.
METHODS: The frozen cord blood stored in liquid nitrogen was thawed to optimize the recovery system. The individual nucleated cells were collected by Ficoll density gradient centrifugation and inoculated in pre-plated T175 culture flasks. Cells were cultured using the cytokine + serum replacement method for 21 days and counted. The ratio of CD3-CD56+ in cells was detected by flow cytometry. The data obtained were compared with the data of K562 trophoblast cells + fetal bovine serum culture method. Meanwhile, myeloid leukemia cells K562 were used as target cells, and CCK-8 kit was used to perform different potent target ratios of NK cells to kill K562 cells. Later, simulated storage transport experiments were performed for 12 hours. The changes in the ratio of CD3-CD56+ were detected by flow cytometry and the apoptosis ratio was determined using Annexin V/PI double-staining method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cells were expanded and cultured for 14 days using K562 trophoblast cells + fetal bovine serum, and the cells expanded (51.47±4.28) fold. After 21 days of expansion culture using cytokine + serum substitute method, the number of cells was more than 5×109; the cells expanded (328.32±116.36) times; the cell expansion ploidy was significantly higher; the CD3-CD56+ purity ratio obtained by both methods was above 80%; no significant difference was seen. (2) The killing effect of NK cells cultured by pure cytokine method on K562 cells (effective target ratio=10:1) was more than 80%. (3) The ratio of CD3-CD56+ did not change significantly during the 12-hour simulated storage experiment until the 12 hours, when the apoptosis rate of NK cells was < 7%. (4) The results showed that the optimized recovery system and pure factor expansion method can efficiently culture high-purity NK cells with the ability to effectively kill K562 tumor cells, and still have good cell purity and low apoptosis rate after 12-hour storage and transportation.

Key words: cryopreserved cord blood, NK cells, cytokine, expansion, cytotoxicity, apoptosis rate, matching, clinical application

中图分类号:

刁小娟, 石超群, 李栋, 王帅, 肖春, 刘国军, 曲廷瑜, 杨卫娟, 贾晓鹏. 无动物源成分纯细胞因子从深低温冻存脐血中高效扩增NK细胞[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1572-1577.

Diao Xiaojuan, Shi Chaoqun, Li Dong, Wang Shuai, Xiao Chun, Liu Guojun, Qu Tingyu, Yang Weijuan, Jia Xiaopeng. Efficient expansion of natural killer cells from cryopreserved umbilical cord blood by pure cytokine method without animal ingredients[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(10): 1572-1577.

图/表（结果） 5

2.1 培养过程中NK细胞形态的变化采用NK细胞扩增试剂盒培养NK细胞的过程中，随培养时间的延长，细胞数量逐渐增加；NK细胞由前期的少量细胞逐渐呈细胞团状，细胞状态良好，见图2。

2.2 NK细胞扩增倍数采用NK细胞扩增试剂盒方法诱导培养8份冻存脐血NK细胞，培养周期21 d，离心、收集细胞，锥虫蓝染色、计数，扩增培养的NK细胞倍数为328.32± 116.36，最终NK细胞总数量 > 5×109；而采用K562滋养层细胞+胎牛血清方法扩增培养的NK细胞倍数为51.47±4.28，两组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.3 流式检测NK细胞纯度流式细胞术检测NK细胞纯度比例(CD3-CD56+)，采用NK细胞扩增试剂盒方法诱导培养8份冻存脐血NK细胞的纯度为(86.51±1.79)%，而采用K562滋养层细胞+胎牛血清方法诱导培养8份冻存脐血NK细胞的纯度为(88.01±1.36)%。两种方法CD3-CD56+的表达均大于80%，差异不显著(P > 0.05)，说明两种培养方法对最终NK细胞纯度影响不显著，见图4。

2.4 NK细胞体外对K562细胞的杀伤能力采用NK细胞扩增试剂盒方法将3份冻存脐血NK细胞作为效应细胞，K562肿瘤细胞作为靶细胞。分别设置不同的效靶比，采用CCK-8试剂盒检测NK细胞的杀瘤效果，结果表明NK细胞的杀瘤率随效靶比的提高而升高，整体杀瘤率较高，在效靶比= 10∶1时，NK细胞对K562细胞的杀伤效果已达80%以上，见图5。

2.5 模拟储运实验采用NK细胞扩增试剂盒方法，对3例冻存脐血NK细胞进行12 h的模拟储运实验，流式细胞仪检测NK细胞的纯度及凋亡率。0 h NK细胞纯度为(87.80±3.45)%，6 h NK细胞纯度为(87.37±3.44)%，12 h NK细胞纯度为(87.29±3.01)%，NK细胞的纯度变化无显著性差异(P > 0.05)；0 h NK细胞凋亡率为(5.12±0.61)%，6 h细胞凋亡率为(3.18±1.00)%，12 h细胞凋亡率为(4.62±0.94)%，同样无显著性差异(P > 0.05)，见图6。说明在模拟储运12 h时间内使用NK细胞扩增试剂盒方法能够保持良好的NK细胞纯度和较低的细胞凋亡率。

参考文献

[1] MARTINET L, SMYTH MJ. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nat Rev Immunol. 2015;15(4):243-254.
[2] HANNA J, MANDELBOIM O. When killers become helpers. Trends Immunol. 2007;28(5):201-206.
[3] KIESSLING R, KLEIN E, WIGZELL H. “Natural” killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 1975;5(2):112-117.
[4] CHESTER C, FRITSCH K, KOHRT HE. Natural Killer Cell Immunomodulation: Targeting Activating, Inhibitory, and Co-stimulatory Receptor Signaling for Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2015;6:601.
[5] GRANZIN M, WAGNER J, KÖHL U, et al. Shaping of Natural Killer Cell Antitumor Activity by Ex Vivo Cultivation. Front Immunol. 2017;8:458.
[6] MICHEL T, POLI A, CUAPIO A, et al. Human CD56bright NK Cells: An Update. J Immunol. 2016;196(7):2923-2931.
[7] SHERECK E, DAY NS, AWASTHI A, et al. Immunophenotypic, cytotoxic, proteomic and genomic characterization of human cord blood vs. peripheral blood CD56Dim NK cells. Innate Immun. 2019;25(5):294-304.
[8] STOKIC-TRTICA V, DIEFENBACH A, KLOSE CSN. NK Cell Development in Times of Innate Lymphoid Cell Diversity. Front Immunol. 2020;11:813.
[9] MYERS JA, MILLER JS. Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18(2):85-100.
[10] BULLER CW, MATHEW PA, MATHEW SO. Roles of NK Cell Receptors 2B4 (CD244), CS1 (CD319), and LLT1 (CLEC2D) in Cancer. Cancers (Basel). 2020;12(7):1755.
[11] SUTLU T, ALICI E. Natural killer cell-based immunotherapy in cancer: current insights and future prospects. J Intern Med. 2009;266(2):154-181.
[12] MORVAN MG, LANIER LL. NK cells and cancer: you can teach innate cells new tricks. Nat Rev Cancer. 2016;16(1):7-19.
[13] VIVIER E, TOMASELLO E, BARATIN M, et al. Functions of natural killer cells. Nat Immunol. 2008;9(5):503-510.
[14] PALMER JM, RAJASEKARAN K, THAKAR MS, et al. Clinical relevance of natural killer cells following hematopoietic stem cell transplantation. J Cancer. 2013;4(1):25-35.
[15] CORRADO C, RAIMONDO S, SAIEVA L, et al. Exosome-mediated crosstalk between chronic myelogenous leukemia cells and human bone marrow stromal cells triggers an interleukin 8-dependent survival of leukemia cells. Cancer Lett. 2014;348(1-2):71-76.
[16] ZHU X, YOU Y, LI Q, et al. BCR-ABL1-positive microvesicles transform normal hematopoietic transplants through genomic instability: implications for donor cell leukemia. Leukemia. 2014;28(8):1666-1675.
[17] 王翘楚,郑亮.以肝素和抗 CD16 抗体为基础的扩增人脐血NK 细胞无血清培养体系的建立[J].中国实验血液学杂志,2018,26(2): 552-556.
[18] 汪德海,郭昌龙,周越,等.脐血单核细胞体外高效扩增NK 细胞方法的研究[J].中国输血杂志,2018,31(7):722-726.
[19] CHOI YH, LIM EJ, KIM SW, et al. IL-27 enhances IL-15/IL-18-mediated activation of human natural killer cells. J Immunother Cancer. 2019; 7(1):168.
[20] DAMOISEAUX J. The IL-2 - IL-2 receptor pathway in health and disease: The role of the soluble IL-2 receptor. Clin Immunol. 2020;218:108515.
[21] ZDOLSEK HJ, VEGFORS M, LINDAHL TL, et al. Hydroxyethyl starches and dextran during hip replacement surgery: effects on blood volume and coagulation. Acta Anaesthesiol Scand. 2011;55(6):677-685.
[22] KATAYAMA Y, YANO T, BESSHO A, et al. The effects of a simplified method for cryopreservation and thawing procedures on peripheral blood stem cells. Bone Marrow Transplant. 1997;19(3):283-287.
[23] HAMILTON JR. Albumin-indirect antiglobulin test. Immunohematology. 2019;35(2):63-64.
[24] HU W, WANG G, HUANG D, et al. Cancer Immunotherapy Based on Natural Killer Cells: Current Progress and New Opportunities. Front Immunol. 2019;10:1205.
[25] HODGINS JJ, KHAN ST, PARK MM, et al. Killers 2.0: NK cell therapies at the forefront of cancer control. J Clin Invest. 2019;129(9):3499-3510.
[26] KWEON S, PHAN MT, CHUN S, et al. Expansion of Human NK Cells Using K562 Cells Expressing OX40 Ligand and Short Exposure to IL-21. Front Immunol. 2019;10:879.
[27] THANGARAJ JL, PHAN MT, KWEON S, et al. Expansion of cytotoxic natural killer cells in multiple myeloma patients using K562 cells expressing OX40 ligand and membrane-bound IL-18 and IL-21. Cancer Immunol Immunother. 2022;71(3):613-625.
[28] PHAN MT, LEE SH, KIM SK, et al. Expansion of NK Cells Using Genetically Engineered K562 Feeder Cells. Methods Mol Biol. 2016;1441:167-174.
[29] YANG H, TANG R, LI J, et al. A New Ex Vivo Method for Effective Expansion and Activation of Human Natural Killer Cells for Anti-Tumor Immunotherapy. Cell Biochem Biophys. 2015;73(3):723-729.
[30] MIRANDOLA P, PONTI C, GOBBI G, et al. The response of human natural killer cells to interleukin-2. J Endocrinol Invest. 2004;27(6 Suppl):146-150.
[31] LI Y, LIU B, DING S, et al. Availability of NK cell expansion agent combined with recombinant IL‑2 and IL‑15 stimulation on the expansion and high‑purity of NK cells in patients with immune‑related pancytopenia in vitro. Mol Med Rep. 2019;20(5):4358-4366.
[32] BERGMAN H, LINDQVIST C. Human IL-15 Inhibits NK Cells Specific for Human NK-92 Cells. Anticancer Res. 2021;41(7):3281-3285.
[33] VIDARD L, DUREUIL C, BAUDHUIN J, et al. CD137 (4-1BB) Engagement Fine-Tunes Synergistic IL-15- and IL-21-Driven NK Cell Proliferation. J Immunol. 2019;203(3):676-685.
[34] IKEMIZU S, CHIRIFU M, DAVIS SJ. IL-2 and IL-15 signaling complexes: different but the same. Nat Immunol. 2012;13(12):1141-1142.
[35] WIDOWATI W, JASAPUTRA DK, SUMITRO SB, et al. Effect of interleukins (IL-2, IL-15, IL-18) on receptors activation and cytotoxic activity of natural killer cells in breast cancer cell. Afr Health Sci. 2020;20(2):822-832.

引言

自然杀伤(Natural killer，NK)细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，其分布于外周各淋巴器官及血液循环系统，是具有直接杀伤功能的天然免疫效应细胞[1-2]，于20世纪70年代进入人们的视线[3]。NK细胞发挥作用依赖于细胞表面多种受体的影响，如NKG2D、NKG2A、NKG2C、NCRs、KIRs、DNAM-1、2B4等[4-7]。NK细胞可以区分固有淋巴样细胞(Innate lymphoid cells，ILCs)的2个主要亚群：细胞毒性ILCs和辅助样ILCs(即ILC1，ILC2和ILC3)[8]，其主要作用是细胞杀伤和促炎细胞因子的产生[9]，它们来自造血干细胞，通过普通淋巴祖细胞发育而形成[10]。NK细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，杀伤机制包括Fas L与Fas相互作用、穿孔素/颗粒酶作用、借助表面CD16与肿瘤特异性IgG发生的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用、肿瘤凋亡相关因子(肿瘤坏死因子α、干扰素γ) 的分泌作用[11-12]。NK细胞可通过对巨噬细胞(Mφ)、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力[13]。不同于T细胞，NK细胞通过诱导移植物抗白血病效应，能清除剩余白血病细胞，而不会引起移植物抗宿主病反应[14]。

目前，研究者多利用转膜结合型白细胞介素15和4-1BB基因的K562细胞作为滋养层培养扩增NK细胞。然而，K562细胞本身就是一种白血病细胞，其释放的外泌体进入基质细胞后，使其发生功能改变，有导致白血病复发的风险[15]。更重要的是，K562细胞来源外泌体可以促使正常的造血细胞转化，有诱导白血病发生的可能性[16-17]；同时，汪德海等[18]建立了一种简便的新鲜脐血单个核细胞体外制备NK 细胞的方法，但其6份脐血单个核细胞培养结果中NK活细胞总数仅扩增至(3.6-5.5)×108 个；Choi等 [19]利用白细胞介素15，白细胞介素18和白细胞介素27协同培养NK细胞，能够有效增强NK细胞的细胞毒性，并通过延长培养天数(21 d)，显著增加CD3-CD56+ NK细胞的数量，但该研究是从人外周血中进行，其扩增数量最终也仅达到(23.6-41.9)×106个。

作者前期尝试过使用多种市售商业化NK细胞因子扩增试剂盒，其针对脐血，尤其是冻存脐带血，个体差异非常大，很难找到合适的可以稳定起到替代滋养层细胞和胎牛血清的扩增体系。经过多次尝试，该研究建立了一套采用细胞因子法和血清替代物培养NK细胞的体外扩增体系，该方法无滋养层细胞、无动物源血清添加，便于临床推广应用，同时为HLA配型脐血NK细胞的治疗应用奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机区组设计，独立样本 t 检验分析。
1.2 时间及地点实验于2020年4月至2021年12月在山东省脐带血造血干细胞库研发中心生物学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 样本来源健康足月的孕妇胎儿脐静脉血(16份)，由山东省脐带血造血干细胞库提供。冻存脐血为山东省脐带血造血干细胞库2016-2021 年置入公共液氮罐中的冻存脐血，病毒检测、细菌真菌检测、生化指标检测均合格，且具有完整的信息，包括知情同意书、HLA分型等。该研究的实施符合山东省脐带血造血干细胞库关于脐带血储存及技术研究的相关伦理要求，伦理审查批号：2021-002。
1.3.2 试剂与仪器 NK细胞扩增试剂盒(TBDNK2013-S-KIT)、无血清培养基(ANDL-TBD-G)、2 L体系悬浮细胞培养袋、Ficoll-Hypaque 人淋巴细胞分离液(密度1.077 g/mL)均购自天津灏洋；细胞培养基添加物购自达科为公司(6122012)；K562肿瘤细胞购自青旗(上海)生物公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；FITC偶联抗人的抗原CD3抗体(555339)、FITC偶联的小鼠免疫球蛋白IGG2a kappa链抗体(555573)、APC偶联抗人的抗原CD56抗体(555518)、APC偶联的小鼠免疫球蛋白IGG1 kappa链抗体(555751)均购自美国Becton Dickinson公司；人血清白蛋白购自Baxter AG公司；经辐照后的K562滋养层细胞购自杭州中赢生物；CCK-8试剂盒、Annexin V/PI试剂盒均购自碧云天公司；KBM581培养基、T175培养瓶购自Corning公司；CO2培养箱购自Heal Force公司；离心机购自Thermo公司；酶标仪购自Tecan公司(型号infinite F50)；流式细胞仪购自ACEA NovoCyte公司(型号2040R)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组实验分为2组：NK细胞纯因子扩增试剂盒+细胞培养添加物扩增组，K562滋养层细胞+胎牛血清扩增组。每组实验重复8次。
1.4.2 优化冻存脐血复苏体系并进行单个核细胞分离采用Ficoll密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。配制复苏保护液：500 mL PBS中加入30 mL 20%人血清白蛋白与30 mL 10%右旋糖酐溶液。将冻存脐血从液氮中取出后置于37 ℃水浴中迅速解冻，缓慢注入4 ℃预冷的复苏保护液，室温600×g离心5 min，取沉淀细胞用PBS悬浮，将混悬液缓慢加到Ficoll分离液上，室温1 200×g离心20 min；吸出白膜层，PBS重悬单个核细胞，室温下500×g离心5 min洗涤备用。
1.4.3 NK细胞扩增试剂盒+细胞培养添加物方法

(1)培养瓶包被和培养基配置：①培养瓶包被：在18 mL PBS中加入NK细胞扩增试剂盒中的1支试剂Ⅰ、1支试剂Ⅱ配置包被液，T175培养瓶中加入包被液，4 ℃冰箱过夜，或置于 37 ℃培养箱中至少包被2 h；②增殖培养基的配制：每1 000 mL免疫细胞无血清培养基中加入NK细胞扩增试剂盒1支试剂Ⅴ；③活化培养基的配制：配制完增殖培养基后，取出500 mL增殖培养基，加入NK细胞扩增试剂盒的1支试剂Ⅳ、1支活化培养基添加物。

(2)细胞培养：①第0天：将分离出的脐血单个核细胞用未加任何因子的免疫细胞无血清培养基配制成细胞悬液40 mL，加入1整套试剂Ⅲ(5支全部加入)，加入2支试剂 Ⅸ。将上述所有液体加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入5 mL细胞添加物，接种细胞浓度为(1-3)×109 L-1[接种细胞数量 (4-12)×107个]，置于37 ℃、体积分数为5% CO2 培养箱中培养；②第3天：加入40 mL活化培养基、5 mL细胞添加物，加入2支试剂 Ⅸ，1支试剂 Ⅵ；③第5天：加入70 mL活化培养基、5 mL细胞添加物，加入2支试剂Ⅸ，1支试剂Ⅶ；④第7天：将培养瓶中细胞完全吹打下来，加入适量细胞添加物，转移到培养袋中，补加剩余的活化培养基；⑤第9天至培养结束：每2 d根据细胞生长状态添加增殖培养基，将细胞浓度维持在1×109 L-1。见图1。培养至第21天收集细胞并进行以下实验。

1.4.4 K562滋养层细胞+胎牛血清方法 ①用PBS重悬K562滋养层细胞A1至50 mL离心管中，离心弃上清，加入3 mL胎牛血清重悬滋养层细胞备用；②将脐血单个核细胞按照(1-3)×109 L-1的浓度[接种细胞数量 (4-12)×107个]接种于含30 mL KBM581培养基的175 cm2培养瓶中，并与步骤①中的滋养层细胞混合，放入37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养；③第4-7天每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加KBM581培养基和胎牛血清，每次添加体积不宜超过现有体积1倍；④第8天计数，K562滋养层细胞A2用PBS重悬至50 mL离心管中，离心弃上清，用无血清KBM581培养基重悬后添加至培养瓶中；⑤第9-15天每天观察或计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加KBM581培养基，使得细胞浓度维持在1.0×109 L-1。当培养瓶内培养液体积大于300 mL则转移至培养袋培养。培养第14天收集NK细胞进行以下实验。
1.4.5 流式细胞术分析离心收集上述2种方法培养的NK细胞(约2×106 个)，PBS洗涤2次后重悬于1 mL PBS中并平均分为2管，其中一管中加入5 µL anti-CD3-FITC和5 µL anti-CD56-APC，另一管加入对应的同型抗体作为对照，室温避光孵育20 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测CD3-CD56+细胞百分比，之后采用ACEA NovoExpress®软件(Ver 1.2.5)分析数据。
1.4.6 CCK-8实验取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，作为靶细胞；采用NK细胞扩增试剂盒细胞因子法培养21 d，收集NK细胞，调整细胞浓度为5×108 L-1，1×109 L-1，2×109 L-1，5×109 L-1作为效应细胞，按照效靶比5∶1，10∶1，20∶1，50∶1的比例加入到96孔板中；每组做3次重复，放入培养箱中培养24 h；加入CCK-8试剂后培养箱中继续孵育2-4 h，用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度值，根据杀瘤效率=[1-(实验孔吸光度值-效应孔吸光度值)/靶细胞吸光度值]×100%进行计算。其中，实验孔里为NK细胞和K562肿瘤细胞，效应孔里为NK细胞，靶细胞孔里为K562肿瘤细胞。
1.4.7 模拟体外储运实验采用NK细胞扩增试剂盒细胞因子法培养21 d，离心收集扩增结束后的NK细胞，用生理盐水洗涤2次；用含5%人血白蛋白的生理盐水重悬细胞，然后均匀分成2份加入到50 mL运输袋中，每袋约30 mL；将分装后的NK细胞放入2-8 ℃储运箱中并置于摇床上晃动，检测细胞的纯度并观察细胞悬浮状态，以确定NK细胞的最佳储运时长；在0，6，12 h时分别使用Annexin V/PI双染法检测NK细胞凋亡情况。
1.5 主要观察指标 ①采用细胞计数法计算2种培养方法细胞扩增倍数；②流式细胞仪检测2种培养方法细胞表面CD3-CD56+的表达；③NK细胞扩增试剂盒+细胞培养添加物方法收获的NK细胞对K562肿瘤细胞的杀伤能力；④模拟储存运输实验对NK细胞凋亡率及纯度的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行数据分析处理，结果以x±s表示，各组间差异采用t检验进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过山东省脐带血造血干细胞库生物统计学专家审核。

讨论

由于新鲜脐血完成微生物和病毒检测质控出库约需要7 d的时间，有时候还需要出库HLA配型的脐血，所以采用新鲜脐血作为NK细胞培养起始细胞不易实现，多采用深低温冻存脐血起始培养。但是在程控降温和复苏过程中，细胞膜和主要的细胞器膜均可能存在冰晶损伤，而且细胞表面很多受体蛋白可能在冷冻复苏过程中脱落，例如白细胞介素2受体或干扰素γ受体，而白细胞介素2可显著促进淋巴细胞增殖[20]，是否对加入的细胞因子能够及时响应均需进一步研究。

该实验通过向预冷的PBS中添加右旋糖酐和人血清白蛋白的方法，复苏了深低温冻存的脐血，并在洗涤过程中增加了右旋糖酐和人血清白蛋白对细胞进行保护，然后采用NK纯因子试剂盒方法对CD3-CD56+这个亚群进行了有效扩增，在21 d之内扩增达(328.32±116.36)倍，最终NK细胞总数量 > 5×109，并且能够在体外混合培养中有效杀伤K562髓系白血病细胞，取得了预期的效果。其中，白蛋白是广泛用于血凝实验的添加剂溶液，在复苏过程中，白蛋白增稠并在洗涤中降低剪切力。右旋糖酐输注在临床上原本就被用于扩充血容量[21]，同时白蛋白和右旋糖酐均是大分子非渗透性物质[22]，将其加入到细胞冻存液中，可以通过改变细胞外渗透压引起细胞脱水，从而减少细胞内冰晶的形成，复苏时也可以减轻由于渗透压改变而引起的细胞肿胀[23]。

该实验对照组采用中赢生物公司转染了4-1BBL、白细胞介素21等基因工程改造的K562滋养层细胞。近些年，关于滋养层细胞扩增NK细胞的实验进行了很多种，如植物血凝素预先刺激的人外周血淋巴细胞、经过γ射线处理后EB病毒转变成的淋巴母细胞(EBV-TM-LCL)、基因修饰K562细胞、经照射或丝裂霉素C处理的自体或异体的单个核细胞等[24-27]。PHAN等[28]利用构建的GE-K562细胞(K562-mbIL15-41BBL)共培养人脐血单个核细胞21 d后，NK细胞增殖达到977倍左右[29]。但在临床使用中仍然担心滋养层细胞的安全问题，文章引言中提到采用纯细胞因子方法扩增培养NK细胞最终细胞数量较少，达不到109，因为脐血中NK细胞冻存后细胞活性会降低，进而复苏后影响到后期的扩增培养，同时因每份脐血存在个体差异，不具有临床广泛应用意义。该研究采用NK细胞因子扩增试剂盒替代滋养层细胞，细胞添加物替代胎牛血清达到扩增培养NK细胞的目的，且进行了8份脐血的重复性实验，每一份均可以达到临床应用的细胞数量和细胞纯度的需求，因此，此项研究为该领域中一次有意义的尝试，推测新方法能够提高NK细胞扩增倍数可能的原因在于NK扩增试剂盒中因子种类更多且组成合理，可完全达到甚至超过滋养层细胞的作用。替代胎牛血清的细胞培养添加物为血小板裂解物，细胞培养过程中所需的营养物质可完全替代动物源血清。NK细胞扩增的过程中，不同细胞因子刺激可以促进NK细胞的增殖和分化，细胞因子通过相互的组合在促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖过程及细胞毒作用中发挥着重要的作用。白细胞介素2是体外扩增NK细胞体系中最早也是最常用的细胞因子[30-31]，其作用是诱导NK细胞的增殖；白细胞介素15上调细胞表面受体的表达，增强非MHC依赖性的细胞毒作用，在NK细胞分化晚期成熟阶段发挥着重要的作用[32-33]；白细胞介素15与白细胞介素2都可与白细胞介素2受体复合体的β和γ链结合，故在生物学效应和信号转导上有许多相似之处，可以产生协同作用进一步提高其生物学效应[34]。白细胞介素18通过提高FAS配体表达，抑制NK细胞的体外扩增，通过协同白细胞介素18与白细胞介素2的浓度可以减弱其抑制作用[35]。该研究探讨了以NK扩增试剂盒为基础，加入细胞添加物体外扩增人冻存脐血NK细胞的方法，结果发现：虽然在NK细胞CD3-CD56+纯度上差异不大，但新方法中扩增倍数大于含滋养层细胞和胎牛血清的扩增倍数，同时推测该NK扩增试剂盒中除了具备上述提到的各种细胞因子之外，还有其他试剂盒或其他方法所缺少的重要添加物。

实验结果表明，NK细胞纯因子扩增方法在获得NK细胞扩增倍数和细胞总数上均优于含滋养层细胞+胎牛血清的培养方法，NK试剂盒纯因子方法培养的NK细胞体外对K562肿瘤细胞的杀伤能力较强，在效靶比= 10∶1时，杀伤率达 80%以上。同时在12 h的模拟储运实验中，CD3-CD56+的比例变化不明显，直至12 h时NK细胞凋亡率仍 < 7%，可以作为替代滋养层细胞+胎牛血清的方法。

综上所述，该研究采用的NK细胞扩增试剂盒方法简单易行，无转基因K562滋养层细胞，也无动物源成分，可从深低温冻存脐血中有效扩增NK细胞且具有体外杀瘤能力，这为从深低温库中经过检索配型提供HLA配型脐血NK细胞提供了技术基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

无动物源成分纯细胞因子从深低温冻存脐血中高效扩增NK细胞

Efficient expansion of natural killer cells from cryopreserved umbilical cord blood by pure cytokine method without animal ingredients

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杜雪婷, 张晓东, 陈焱君, 王梅, 陈武标, 黄文华. 压缩感知技术在踝关节2D MR成像中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1396-1402.
[2]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[3]	龙桂月, 李冬冬, 廖红兵. 磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸降解产物促进小鼠单核细胞破骨向分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1193-1198.
[4]	徐聪, 赵赫, 孙岩. 生物材料导管修复面神经损伤与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1089-1095.
[5]	李文婕, 游艾佳, 周俊丽 , 方素娟, 李春. 不同种类敷料治疗烧伤疗效的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 1141-1148.
[6]	柯维强, 陈祥慧, 陈小玲, 孟杰, 马燕琳. 自体外周血干细胞移植联合利妥昔单抗治疗弥漫大B细胞淋巴瘤及相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 915-920.
[7]	许其静, 杨伊春, 雷微, 杨莹, 余江, 夏婷婷, 张萌, 章涛, 张潜. 糖尿病皮肤慢性创面无细胞治疗的进展与问题[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 962-969.
[8]	王金玲, 黄夏荣, 屈萌艰, 黄福锦, 尹林伟, 钟培瑞, 刘静, 孙光华, 廖阳, 周君. 运动训练老年骨质疏松大鼠骨量及骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 676-682.
[9]	刘洪文, 李皎, 徐文豪, 聂华, 刘绍江, 徐杰, 尹立. 失神经骨骼肌萎缩模型大鼠肌肉组织中microRNA表达谱的差异分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 732-737.
[10]	李龙, 李光第, 石豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.
[11]	刘源. 低氧训练对氧感知通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 793-798.
[12]	宁梓文, 王旭, 施政良, 秦艺华, 王国梁, 贾笛, 王扬, 李彦林. 半月板非血供区损伤的修复方案[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 420-426.
[13]	牛梓晗, 余扬, 艾江, 卜盼盼, 李文博, 苏日耶·热合曼, 马少林. 沙棘总黄酮干预兔耳增生性瘢痕组织块的消退[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 258-263.
[14]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.
[15]	陈锋, 任国武, 章晓云, 陈跃平, 石儒生. 核因子κB受体活化因子信号转导机制与破骨细胞的活化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 293-299.