单倍体造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病的发病机制

doi:10.12307/2022.735

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (30): 4806-4811.doi: 10.12307/2022.735

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单倍体造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病的发病机制

于漫亚1，孔凡盛2，张杰2，徐杰2，崔兴2

1山东中医药大学中医学院，山东省济南市 250014；2山东中医药大学附属医院血液科，山东省济南市 250011

收稿日期:2021-11-18 接受日期:2021-12-16 出版日期:2022-10-28 发布日期:2022-03-29
通讯作者: 崔兴，博士，主任医师，硕士研究生导师，山东中医药大学附属医院血液科，山东省济南市 250011
作者简介:于漫亚，女，1998年生，山东省菏泽市人，汉族，山东中医药大学在读硕士，主要从事中西医结合血液病临床及实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81774080)，项目负责人：崔兴；泰山学者青年专家人才项目(tsqn201812145)，项目负责人：崔兴

Pathogenesis of intestinal acute graft-versus-host disease after haploid hematopoietic stem cell transplantation

Yu Manya1, Kong Fansheng2, Zhang Jie2, Xu Jie2, Cui Xing2

1College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2Department of Hematology, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011, Shandong Province, China

Received:2021-11-18 Accepted:2021-12-16 Online:2022-10-28 Published:2022-03-29
Contact: Cui Xing, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250011, Shandong Province, China
About author:Yu Manya, Master candidate, College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
General Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81774080 (to CX); Taishan Scholars Young Expert Talent Project, No. tsqn201812145 (to CX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
急性移植物抗宿主病：是异基因造血干细胞移植的常见并发症，肠道是其常发生的部位之一，其发病过程包括3个阶段，其中炎性细胞因子的释放、T细胞的增殖和分化占据主导地位。全身类固醇治疗是急性移植物抗宿主病的一线治疗方案，但部分患者对此无效，导致该病死亡率高，患者生活质量差，研究其发病和进展机制有助于新药物的研发，提高临床疗效。
长链非编码RNA：是一类长度超过200个核苷酸，几乎不编码蛋白质的RNA转录本，通过表观遗传调控、基因印迹、转录激活、mRNA修饰、核运输、蛋白活性激活等途径，参与多种疾病的进展。研究表明，长链非编码RNA与T细胞介导的免疫反应关系密切。

背景：肠道急性移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植后最常见的危及生命的并发症之一，由供体免疫活性T细胞攻击健康受体组织导致，目前治疗方案效果不佳。长链非编码RNA参与免疫反应等多种生物学过程，但在肠道急性移植物抗宿主病中的作用尚不清楚，有待进一步研究。
目的：构建肠道急性移植物抗宿主病差异长链非编码RNA和mRNA表达谱，预测其可能的作用及机制。
方法：采集4例单倍体造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病患者和4名健康志愿者的外周血单个核细胞进行高通量测序，并对差异mRNA进行GO和KEGG富集分析。根据基因表达信号值的动态变化，构建差异长链非编码RNA-mRNA共表达网络，基于长链非编码RNA对下游靶基因不同的调节机制，分别预测其通过顺式或反式调控及经由竞争性内源RNA机制调控的靶基因，使用Cytoscape构建基因互作网络，通过对靶基因的功能分析预测差异长链非编码RNA可能的作用及相关机制。
结果与结论：肠道急性移植物抗宿主病患者的外周血单个核细胞中有1 311个长链非编码RNA和3 283个mRNA差异表达，GO和KEGG结果提示这些差异mRNA主要富集在白细胞介素18、白细胞介素1介导的信号通路、转录因子AP-1复合物、巨核细胞分化和肿瘤坏死因子信号通路，这与肠道炎性反应及与骨髓造血能力关系密切。差异长链非编码RNA顺式及反式调控的靶基因包括一些炎症相关分子，如ZEB2、CDK6、CEACAM1、CXCL1等，经由竞争性内源RNA机制调控的通路主要有PI3K/Akt通路和Notch通路，这与T细胞的活化以及肠道干细胞的稳态相关。结果表明，差异长链非编码RNA可能通过调控炎症相关因子的表达，影响T细胞介导的免疫反应及肠道干细胞的稳态，在肠道急性移植物抗宿主病的发病及进展中发挥重要作用，可能成为诊断及治疗的新靶点。
缩略语：长链非编码RNA：long non-coding RNA，lncRNA

https://orcid.org/0000-0002-8771-5898 (崔兴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 急性移植物抗宿主病, 肠道, lncRNA, mRNA, 竞争性内源RNA, 顺式调控, 反式调控

Abstract: BACKGROUND: Acute graft-versus-host disease is one of the most common life-threatening complications of allogeneic hematopoietic stem cell, caused by the attack of donor immunoreactive T cells on healthy recipient tissue. The current treatment plan is not effective. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are involved in many biological processes such as immune response, but their roles in acute graft-versus-host disease remain unclear and need to be further studied.
OBJECTIVE: To construct profiles of differentially expressed lncRNAs and differentially expressed mRNAs of intestinal acute graft-versus-host disease and predict their possible roles and mechanisms.
METHODS: Peripheral blood mononuclear cells from four patients with intestinal acute graft-versus-host disease after haploidentical hematopoietic stem cell transplantation and four healthy volunteers were collected for high-throughput sequencing. GO and KEGG enrichment analyses were performed on the differentially expressed mRNAs. According to the dynamic change of gene expression signal value, the differential lncRNA-mRNA co-expression network was constructed. Based on the different regulatory mechanisms of lncRNA on downstream target genes, the target genes regulated by cis or trans regulation and competitive endogenous RNA mechanisms were predicted, respectively. Cytoscape was used to construct the gene interaction networks. The possible effects and related mechanisms of differentially expressed lncRNAs were predicted through functional analysis of their target genes.
RESULTS AND CONCLUSION: There are 1 311 lncRNAs and 3 283 mRNAs differentially expressed in the peripheral blood mononuclear cells of patients with intestinal acute graft-versus-host disease. GO and KEGG analyses indicated that these differentially expressed mRNAs were involved in interleukin-18 or interleukin-1 mediated signaling pathway, AP-1 complex, megakaryocyte differentiation, and tumor necrosis factor signaling pathway, which were closely related to intestinal inflammatory response and hematopoietic ability of bone marrow. Cis-and trans-regulated genes of differentially expressed lncRNAs include some inflammation-related molecules, such as ZEB2, CDK6, CEACAM1, and CXCL1. The pathways regulated by differentially expressed lncRNAs via competitive endogenous RNA mechanism mainly include PI3K/Akt pathway and Notch pathway, which are related to the activation of T cells and the homeostasis of intestinal stem cells. It is concluded that differentially expressed lncRNAs are essential in the pathogenesis and progression of intestinal acute graft-versus-host disease via regulating the expression of inflammation-related molecules, T cell-mediated immune response, and the homeostasis of intestinal stem cells, and may become novel targets for the diagnosis and treatment of intestinal acute graft-versus-host disease.

Key words: acute graft-versus-host disease, intestine, lncRNA, mRNA, competitive endogenous RNA, cis-regulation, trans-regulation

中图分类号:

于漫亚, 孔凡盛, 张杰, 徐杰, 崔兴. 单倍体造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病的发病机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4806-4811.

Yu Manya, Kong Fansheng, Zhang Jie, Xu Jie, Cui Xing. Pathogenesis of intestinal acute graft-versus-host disease after haploid hematopoietic stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(30): 4806-4811.

图/表（结果） 8

2.1 差异lncRNA和mRNA的筛选以|log2FC|>1且校正后的P值< 0.05(Q值)为阈值，筛选并鉴定出1 311个差异表达的lncRNA和3 283个差异mRNA，聚类分析图展示了每个样本中差异基因的表达概况，见图1A。与健康志愿者相比，肠道急性移植物抗宿主病患者表达上调的lncRNA有726个，下调的有585个；表达上调的mRNA有1 836个，下调的有1 447个，见图1B。从中获得差异表达最显著的上调及下调的lncRNA和mRNA各10个，其相关信息见表1及表2。

2.2 GO分析和KEGG分析 GO注释提示差异表达的mRNA参与的生物学过程主要有白细胞介素18介导的信号通路、血小板衍生生长因子受体信号通路、一氧化氮合酶生物合成过程、巨核细胞分化、白细胞介素1介导的信号通路等；涉及的分子功能包括花生四烯酸结合、二十碳四烯酸结合、着丝粒DNA结合、组蛋白丝氨酸激酶活性、后期促进复合物结合；细胞组分有着丝粒、Ndc80复合物、转录因子AP-1复合物，见图2A。通过KEGG富集分析，发现差异mRNA主要参与肿瘤坏死因子信号通路、原发性免疫缺陷、p53信号通路、Notch信号通路等，见图2B。

2.3 lncRNA-mRNA共表达网络构建为了进一步研究lncRNA与mRNA之间的潜在联系，构建了差异lncRNA与差异mRNA共表达网络。以相关性系数> 0.9或< -0.9，且P < 0.05为标准，共筛选出210 052个共表达的基因对，相关性最显著前500个基因对，见图3。

2.4 LncRNA的顺式及反式调控 LncRNA可以通过顺式及反式调控作用，分别调节与其位于同一染色体上的邻近基因和位于其他染色体上的基因的表达。作者预测了差异lncRNA的顺式及反式调控靶点，结果显示共有751个顺式调控靶点及5 277个反式调控靶点，其中104个靶点既能被顺式调控又能被反式调控。基于lncRNA-mRNA的共表达分析，筛选了10对相关性最显著差异lncRNA及其靶基因，见表3。

2.5 差异lncRNA的ceRNA网络构建及功能分析定位于细胞质中的lncRNA可以通过竞争性结合miRNA来调节mRNA的表达，通过整合差异lncRNA和差异mRNA的数据，并预测与lncRNA和mRNA相互作用的miRNA，根据总最大结合能的大小，对前500个结合能最大的lncRNA-miRNA-mRNA构建了ceRNA网络，见图4，其中包括177个mRNA，7个miRNA和62个lncRNA。

对mRNA进行GO和KEGG富集分析，结果提示其主要参与的生物学过程有淋巴管形态发生边缘区、B细胞分化、肥大细胞趋化性等；细胞组分包括囊泡、Smc5-Smc6复合体、有丝分裂纺锤体极等；发挥的分子功能有血管内皮生长因子受体1、蛋白偶联5-羟色胺受体结合、cAMP反应元件结合，蛋白结合转录因子结合蛋白质结合等；参与PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、谷氨酸能突触、原发性免疫缺陷、Rap1信号通路、Notch信号通路，见图5。

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引言

急性移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植的一种可致死性并发症，由供者免疫活性细胞识别并攻击受者组织引起，主要表现为皮肤、胃肠道和肝脏的炎性反应[1-2]。异基因造血干细胞移植是治愈血液系统恶性疾病、骨髓衰竭和先天性代谢紊乱的有效方法。然而，急性移植物抗宿主病作为异基因造血干细胞移植的严重并发症之一，大约15%的患者会因此致命[3-4]。类固醇激素是急性移植物抗宿主病的一线治疗方案，但对类固醇激素耐药的急性移植物抗宿主病患者的预后不佳，长期死亡率可达90%[1]，因此探究急性移植物抗宿主病治疗的潜在靶点以寻求更加有效的治疗方式具有重要的意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在基因功能和调控的各个层面都发挥着重要作用，其下游调节机制错综复杂，涉及转录、翻译、蛋白质修饰多个层面。根据lncRNA的亚细胞定位，细胞核内的lncRNA顺式或反式调控基因表达是其发挥作用的主要机制，而胞浆中的lncRNA主要通过海绵吸附miRNA以调节下游靶基因的表达[5]。相关研究发现，lncRNA参与调节免疫反应等多种生物学过程，如lnc-ITSN1-2经由miR-125a/IL-23R轴，促进炎症性肠病中CD4+T细胞活化；linc-MAF-4通过与染色质修饰剂LSD1和Ezh2结合抑制Th2的极化，lnc-Smad3则通过抑制转化生长因子β介导的Smad3表达，参与iTreg细胞的诱导[6-8]。但lncRNA在肠道急性移植物抗宿主病中的作用尚不清楚，而外周血单个核细胞产生的白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α在移植物抗宿主病的发生中起着重要作用[9]，因此该研究对肠道急性移植物抗宿主病患者的外周血单个核细胞进行全转录组测序，筛选了差异表达的lncRNA和mRNA，并基于上述机制对差异lncRNA发挥的作用及相关机制进行预测，为肠道急性移植物抗宿主病的诊断及治疗提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计外周血临床样本实验。使用edgeR包对组间基因表达进行差异分析，计算得到P值后进行多重假设检验校正，校正后的P值被称为Q值。同时，根据FPKM值计算差异表达倍数。
1.2 时间及地点实验于2020年4-7月在山东中医药大学附属医院实验室和上海鲸舟基因科技有限公司完成。
1.3 对象随机选取4例2019年在山东中医药大学附属医院进行单倍体造血干细胞移植后发生肠道急性移植物抗宿主病的患者为研究对象(男2例，女2例，年龄9-53岁)，招募4名健康志愿者为对照组(男3例，女1例，年龄23-25岁)。采集所有参与者外周血，用肝素抗凝，加入等体积PBS溶液(美国Sigma公司)稀释后，缓慢加至等体积Ficoll溶液(美国Sigma公司)表面，2 000 r/min离心20 min，吸出白色环状细胞层，PBS清洗后得到外周血单个核细胞，添加TRIzol (美国Thermo Fisher公司)分离RNA，将样本储存在-80 ℃冰箱中，直至使用。该研究得到山东中医药大学附属医院伦理委员会的批准(2019-037号)，所有参与者均已签署知情同意书。
1.4 方法
1.4.1 高通量测序所有样本均送至上海市鲸舟基因科技有限公司进行全转录组测序，测序前使用安捷伦2100生物分析仪(美国Agilent公司)对总RNA质检，并使用RNA完整性数目(RIN)值高于7.0的样本进行测序。然后，根据制造商的说明，使用VAHTS总RNA序列(H/M/R)文库制备试剂盒(中国诺唯赞公司)构建RNA文库。使用Qubit®2.0荧光计和安捷伦2100生物分析仪进行质控，在Illumina NovaSeq 6000平台(美国Illumina公司)上测序。
1.4.2 生物信息学分析利用GO数据库(http://www.geneontology.org)、KEGG数据库 (http://www.genome.jp/kegg/)以及DAVID网站对差异表达的mRNA进行功能注释，用R包ggolot2绘制示意图。
1.4.3 lncRNA-mRNA共表达网络构建依据基因表达信号值的动态变化，对基因间的共表达关系进行计算，得出基因间的表达调控关系及调控方向，利用Cytoscape(v3.8.0)构建基因的表达调控网络。
1.4.4 差异lncRNA靶基因预测及网络构建 LncRNA可以顺式或反式调节基因的表达，在该研究中寻找基因组上位于lncRNA上下游10 kb范围内的mRNA作为lncRNA顺式调控靶基因。顺式调控靶基因预测基于序列互补配对原则，使用blast比对得到与lncRNA互补的mRNA，再利用RNAplex软件(http://www.bioinf.uni-leipzig.de/Software/RNAplex/)计算lncRNA与mRNA互补配对后其热动力学参数值，选择软件阈值范围之上的结果作为lncRNA的靶基因。利用Cytoscape(v3.8.0)构建差异lncRNA的顺式和反式靶点网络。
1.4.5 CeRNA网络构建利用miRanda及TargetScan预测下游miRNA的结合位点和靶mRNA，挑选出差异表达的mRNA，根据总最大结合能的大小，使用Cytoscape(v3.8.0)对前500个结合能最大的lncRNA-miRNA-mRNA构建ceRNA网络。
1.5 主要观察指标与健康志愿者相比，单倍体造血干细胞移植后发生肠道急性移植物抗宿主病患者的外周血单个核细胞中差异表达的lncRNA和mRNA。

讨论

该研究通过全转录组测序检测了单倍体造血干细胞移植后发生肠道急性移植物抗宿主病患者与健康志愿者外周血单个核细胞的lncRNA和mRNA表达谱，并通过生物信息学分析探讨了其可能的功能及机制。作者发现1 311个lncRNA和3 283个mRNA在肠道急性移植物抗宿主病患者中表达显著失调，差异mRNA的生物信息学分析提示，它们主要参与的信号通路有白细胞介素18和白细胞介素1介导的信号通路。白细胞介素18和白细胞介素1均是促炎性细胞因子，在急性移植物抗宿主病患者中，白细胞介素18通过刺激Th1细胞介导的免疫反应，增强供者CD8+T细胞的扩增和细胞毒性[10-11]。而白细胞介素1β可以通过NF-κB、p38、MAPK和ERK途径在炎症诱导的肠上皮细胞中发挥重要作用[12-13]。另外这些差异mRNA多在AP-1复合物中，AP-1是上调免疫与炎性反应相关基因表达水平的主要转录因子，有研究指出抑制AP-1的转录活性可以减轻肠道炎症性疾病的炎性反应，改变CD4+T细胞的分化，起到预防急性移植物抗宿主病的作用[14-15]。除此之外，差异mRNA还参与巨核细胞分化和肿瘤坏死因子信号通路，影响血小板的生成和骨髓造血微环境[16]。研究表明，急性移植物抗宿主病患者的预后与造血功能的恢复关系密切，全血细胞减少常提示着预后不良[17]，因此这些基因的差异表达与肠道急性移植物抗宿主病患者植入不良密切相关，影响移植成功率以及原始疾病的治愈。

近年来，lncRNA在血液恶性疾病、免疫相关疾病中的作用被广泛研究。但到目前为止，这些差异lncRNA在移植后肠道急性移植物抗宿主病中发挥的作用尚不清楚。LncRNA作为非编码RNA，主要通过调控mRNA发挥作用。基于lncRNA-
mRNA共表达分析，结合lncRNA顺式及反式调控靶点预测，筛选出10对相关性最显著的差异lncRNA及其靶基因。研究发现，这些靶基因包括一些炎症相关分子，其中ZEB2和CDK6均可以调控NF-κB信号通路，干预脂多糖诱导的炎症细胞因子分泌以及NF-κB的磷酸化，调节炎症基因的表达[18-19]。

跨膜糖蛋白CEACAM1存在于T细胞中，可以调节T细胞的活化，且与肠道稳态密切相关[20-22]。而趋化因子CXCL1可以损伤肠上皮细胞，导致肠道炎症[23]。供体T细胞活化引起的肠道炎症和组织损伤是肠道急性移植物抗宿主病发生的关键原因，因此这些差异lncRNA可能通过对mRNA的顺式或反式调控作用干预供体T细胞活化，调节肠道炎性反应。

位于细胞质中的lncRNA可以海绵吸附miRNA，通过内源竞争RNA机制调控下游mRNA的表达。作者将网站预测结果与差异lncRNA和差异mRNA的数据相整合，构建了ceRNA网络，并对下游靶基因进行了GO和KEGG富集分析，结果发现差异lncRNA经由ceRNA机制参与PI3K/Akt通路、Notch通路的调控。急性移植物抗宿主病的发生与PI3K/Akt/mTOR信号的过度激活相关[24]。PI3K/Akt/mTOR通路是T细胞活化和发挥作用的关键因素，它的激活可以提高T细胞的生存能力，促进细胞周期进程，调节分化，并控制效应器和记忆表型的获得[25-28]。另有研究发现，PI3K/Akt/mTOR通路可以调节肠道稳态，并在肠道细胞的分化和增殖中发挥着核心作用[29-32]。T细胞中的Notch信号通路是预防急性移植物抗宿主病的新靶点，它可以调节CD4+T细胞反应以及CD8+T细胞的增殖和活化[33-35]。缺乏Notch的T细胞分泌的炎症细胞因子明显减少，但体内增殖正常，调节性T细胞的积累增加[35]。而且，Notch的抑制显著减少了肠道中异体效应T细胞的积累，另外Notch1在肠道干细胞稳态中起着重要作用，而肠道干细胞是肠道损伤修复的关键[36]。以上结果表明，胞浆中差异lncRNA可能通过调控PI3K/Akt通路、Notch通路，影响T细胞的增殖、分化和炎症细胞因子的分泌，干预T细胞激活和肠道干细胞稳态，在移植后肠道炎症和组织损伤的发生以及损伤后的修复中都发挥着重要作用，影响肠道急性移植物抗宿主病的发生和进展。

综上所述，该研究证实了单倍体造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病患者存在lncRNA和mRNA的差异表达，预测差异mRNA主要通过影响炎性反应和骨髓造血能力干预疾病的发生和预后，并基于lncRNA对mRNA的多种调控机制，分析其在细胞核和细胞质中所发挥的不同作用，发现差异lncRNA顺式或反式调控多种炎症相关分子的表达，对差异lncRNA的ceRNA网络构建揭示其通过调控PI3K/Akt通路、Notch通路影响T细胞介导的免疫反应以及肠道干细胞的稳态，为肠道急性移植物抗宿主病的发病机制研究提供了新的思路，为其诊断及治疗提供了潜在靶点。当然，该研究有一定的局限性，由于纳入的样本量有限，因此对差异基因的筛选可能存在偏差；另外该研究仅利用生物信息学预测了差异基因可能发挥的作用，尚需进一步实验验证其功能以及lncRNA的亚细胞定位。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

单倍体造血干细胞移植后肠道急性移植物抗宿主病的发病机制

Pathogenesis of intestinal acute graft-versus-host disease after haploid hematopoietic stem cell transplantation

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