LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化

doi:10.12307/2022.397

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 3951-3955.doi: 10.12307/2022.397

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LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化

黄涛1，贾志强2，赵晓光1，王磊1，方丽萍3，翟文静4，翟莎菲5，周永新1

1西安医学院第一附属医院，陕西省西安市 710077；2河南科技大学第二附属医院，河南省洛阳市 471000；3西安市人民医院，陕西省西安市710068；4西安交通大学第二附属医院，陕西省西安市 710061；5西安医学院口腔医学院，陕西省西安市 710021

收稿日期:2021-01-28 接受日期:2021-04-10 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 周永新，硕士，主治医师，西安医学院第一附属医院，陕西省西安市 710077
作者简介:黄涛，男，1979年生，安徽省合肥市人，2009年西安交通大学毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81801237)，项目参与人：黄涛

LncRNA-HOTAIR can regulate differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts

Huang Tao1, Jia Zhiqiang2, Zhao Xiaoguang1, Wang Lei1, Fang Liping3, Zhai Wenjing4, Zhai Shafei5, Zhou Yongxin1

1First Affiliated Hospital of Xi’an Medical College, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China; 2Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, Henan Province, China; 3Xi’an People’s Hospital, Xi’an 710068, Shaanxi Province, China; 4Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China; 5School of Stomatology, Xi’an Medical College, Xi’an 710021, Shaanxi Province, China

Received:2021-01-28 Accepted:2021-04-10 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Zhou Yongxin, Master, Attending physician, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical College, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China
About author:Huang Tao, Master, Attending physician, First Affiliated Hospital of Xi’an Medical College, Xi’an 710077, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81801237 (to HT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
lncRNA：是一类长度超过200 bp的长链非编码RNA，具有十分广泛的生物学功能。lncRNA较编码RNA有更强的细胞特异性和组织特异性，其表达与多种疾病的发生发展密切相关，且在细胞增殖、凋亡、分化及发育等过程中发挥重要的调节作用。已有研究表明，lncRNA在间充质干细胞成骨分化过程中起表观遗传调控作用。
HOTAIR：是由人类染色体12q13.13位点的HOXC簇基因列阵，以反转录方式调控基因表达。lncRNA HOTAIR在宫颈癌、卵巢癌、冠心病、心肌病和骨关节炎中发挥着重要作用。

背景：已有证据表明，LncRNA-HOTAIR能调节骨髓间充质干细胞中成骨相关基因的表达，但其对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道。
目的：探讨LncRNA-HOTAIR对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：体外培养Lewis大鼠脂肪间充质干细胞，转染lncRNA-NC、lncRNA-HOTAIR mimics、lncRNA-HOTAIR inhibitor并进行成骨诱导，成骨诱导第7天检测碱性磷酸酶活性，成骨诱导第14天进行茜素红染色。成骨诱导第6天，通过RT-PCR及Western blot检测成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥蛋白mRNA和蛋白的表达。
结果与结论：①转染LncRNA-HOTAIR mimic后，脂肪间充质干细胞中碱性磷酸酶活性及钙化程度显著降低，而转染LncRNA-HOTAIR inhibitor后则显著增加(P < 0.05)；②转染LncRNA-HOTAIR mimic后，脂肪间充质干细胞中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素和骨桥蛋白的表达显著降低(P < 0.05)，而转染LncRNA-HOTAIR inhibitor后则显著增加(P < 0.05)；③上述结果表明，LncRNA-HOTAIR能负向调控脂肪间充质干细胞的成骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-2828-3271 (周永新)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪间充质干细胞, LncRNA-HOTAIR, mimic, inhibitor, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Evidence has shown that LncRNA-HOTAIR can regulate the expression of osteogenic related genes in bone marrow mesenchymal stem cells, but its effect on the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of LncRNA-HOTAIR on the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Adipose derived mesenchymal stem cells of Lewis rats were cultured in vitro. LncRNA-NC, lncRNA-HOTAIR mimics, and lncRNA-HOTAIR inhibitor were transfected into adipose derived mesenchymal stem cells and osteogenesis was induced. The alkaline phosphatase activity was detected on the 7th day of osteogenic induction. Alizarin red staining was performed on the 14th day of osteogenic induction. On the 6th day of osteogenic induction, the expression levels of osteogenic-related genes alkaline phosphatase, Runt-related transcription factor 2, osteocalcin, and osteopontin mRNA and protein were detected by RT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After LncRNA-HOTAIR mimic transfection, alkaline phosphatase activity and calcification degree of adipose derived mesenchymal stem cells were significantly decreased, while LncRNA-HOTAIR inhibitor transfection significantly increased (P < 0.05). (2) After LncRNA-HOTAIR mimic transfection, the expression of alkaline phosphatase, Runt-related transcription factor 2, osteocalcin, and osteopontin in adipose derived mesenchymal stem cells decreased significantly (P < 0.05), but increased significantly after LncRNA-HOTAIR inhibitor transfection (P < 0.05). (3) These results suggest that LncRNA-HOTAIR can negatively regulate the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells.

Key words: stem cells, adipose derived mesenchymal stem cells, LncRNA-HOTAIR, mimic, inhibitor, osteogenic differentiation

中图分类号:

黄涛, 贾志强, 赵晓光, 王磊, 方丽萍, 翟文静, 翟莎菲, 周永新. LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3951-3955.

Huang Tao, Jia Zhiqiang, Zhao Xiaoguang, Wang Lei, Fang Liping, Zhai Wenjing, Zhai Shafei, Zhou Yongxin. LncRNA-HOTAIR can regulate differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3951-3955.

图/表（结果） 4

2.1 脂肪间充质干细胞的形态原代细胞为小圆形且细胞大小不均匀；培养48 h后，细胞生出触角，此时细胞为三角形或梭形；当细胞生长至80%融合时进行传代，此时细胞呈纤维样生长且具有方向性，细胞形态基本一致；当细胞传至第3代时，基本为梭形，细胞大小均一，呈漩涡状排列，且增殖速度较快，见图1。
2.2 脂肪间充质干细胞的鉴定结果流式细胞仪检测第3代脂肪间充质干细胞表面标志物的表达，CD29和CD44的阳性率分别为99.4%和97.6%，CD45的阳性率为3.66%，说明脂肪间充质干细胞纯度较高，见图2。

2.3 脂肪间充质干细胞成骨分化过程中lncRNA-HOTAIR、Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素 mRNA表达水平的变化与第0天相比，脂肪间充质干细胞成骨诱导第3，7，14，21天lncRNA-HOTAIR mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)，Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)；与第3天相比，第7，14，21天细胞中lncRNA-HOTAIR mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)，Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)；与第7天相比，第14，21天细胞中lncRNA-HOTAIR mRNA表达水平显著降低(P < 0.05)，Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素mRNA表达水平显著升高(P < 0.05)；与第14天相比，第21天细胞中lncRNA-HOTAIR及成骨相关基因的mRNA表达差异无显著性意义，见图3。

2.4 lncRNA-HOTAIR对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响转染48 h后，lncRNA-HOTAIR mimics组细胞lncRNA-HOTAIR表达显著高于lncRNA-NC组(P < 0.05)，lncRNA-HOTAIR inhibitor组细胞lncRNA-HOTAIR表达显著低于lncRNA-NC组(P < 0.05)，见图4A。在成骨诱导第7天，lncRNA-HOTAIR mimics组细胞碱性磷酸酶活性显著低于lncRNA-NC组(P < 0.05)，lncRNA-HOTAIR inhibitor组细胞碱性磷酸酶活性显著高于lncRNA-NC组(P < 0.05)，见图4B。在成骨诱导第14天，3组细胞均可见不同程度暗红色钙结节沉积，lncRNA-HOTAIR mimics组钙结节的大小、数目及颜色深度均显著低于lncRNA-NC组(P < 0.05)，而lncRNA-HOTAIR inhibitor组则显著高于lncRNA-NC组(P < 0.05)，见图4C。

2.5 各组脂肪间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙素的表达与lncRNA-NC组相比，lncRNA-HOTAIR mimics组细胞中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙素的mRNA及蛋白表达水平显著降低，而lncRNA-HOTAIR inhibitor组的表达水平显著升高(P < 0.05)，见图5。

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引言

间充质干细胞来源于中胚层，存在于人体多种组织中，因其具有免疫调节、分泌生长因子、组织再生、促进血管形成等特点，对骨创伤修复具有潜在的治疗意义[1-3]。骨髓间充质干细胞是构建组织工程种子细胞的重要来源之一，但由于骨髓间充质干细胞存在来源受限、提取受限及数量受限等弊端，使其应用受到了很大的限制[4]。
近年来，脂肪间充质干细胞分离及鉴定技术日趋成熟。脂肪组织具有取材容易、创伤面积小、间充质干细胞提取数量多等优点，使其成为组织工程领域的研究热点[5-6]。LncRNA是一类长度超过200 bp的长链非编码RNA，具有十分广泛的生物学功能。已有研究表明，lncRNA较编码RNA有更强的细胞特异性和组织特异性，其表达与多种疾病的发生发展密切相关，且对细胞增殖、凋亡、分化及发育等过程发挥重要的调节作用[7-8]。近来，通过lncRNA调节间充质干细胞定向分化的研究受到广泛关注。HUANG等[9]研究发现，lncRNA H19过表达能显著增强间充质干细胞的成骨能力。XIAO等[10]研究发现，lncRNA MALAT1能促进成骨细胞特异性标志物碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白的表达。HOTAIR由12号染色体12q13.13上HOXC基因反义链转录，主要调控同源框基因D(HOXD)[11-12]。已有研究表明，lncRNA HOTAIR在宫颈癌、卵巢癌、冠心病、心肌病和骨关节炎中发挥着重要作用[13-16]。该研究探讨lncRNA HOTAIR在脂肪间充质干细胞成骨分化中的调节作用，以期为明确lncRNA HOTAIR调控脂肪间充质干细胞成骨分化的机制及其治疗骨损伤提供科学依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞生物学实验，组间比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2018年7月至2020年12月在西安医学院第一附属医院形态学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄雄性Lewis大鼠20只，体质量为80-100 g，购买于上海加科生物科技有限公司。
1.3.2 实验主要试剂 DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；Trizol试剂、Lipofectamine 3000转染试剂(美国Invitrogen公司)；SYBR Green PCR Master Mix(美国Life Technologies公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京全式金公司)；lncRNA-HOTAIR mimics、lncRNA-HOTAIR inhibitor、lncRNA-NC(上海GenePharam公司)；碱性磷酸酶抗体、Runt相关转录因子2抗体、骨钙素抗体、骨桥蛋白抗体、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗(美国Abcam公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪间充质干细胞分离和培养取大鼠腹股沟处脂肪垫，加入0.1%胶原酶Ⅰ，于37 ℃水浴中消化50 min，1 000 r/min离心8 min，加入细胞裂解缓冲液于37 ℃孵育10 min，弃去上清液，用DMEM/F12培养液重悬细胞，之后将其接种至培养瓶内，当细胞生长至70%-80%融合时传代。

1.4.2 细胞表面分子标志物的检测取培养扩增后的第3代脂肪间充质干细胞，当细胞长至70%-80%融合时，用2.5 mL胰酶消化，1 000 r/min离心5 min后收集细胞沉淀，PBS洗涤2次并重悬细胞，制成细胞浓度为5×109 L-1的单细胞悬液，将其加入到Eppendorf管中，每管1×106个细胞，分别加入2 μL CD29、CD44、CD45抗体及同型对照，4 ℃条件下孵育60 min，上流式细胞仪检测，Cell-Quest软件分析。

1.4.3 细胞转染当第3代脂肪间充质干细胞长至70%-80%融合时，按照Lipofectamine 3000制造商说明书，将lncRNA-HOTAIR mimics、lncRNA-HOTAIR inhibitor和lncRNA-NC转染至细胞中，转染24 h后通过RT-PCR检测转染效率。
1.4.4 成骨诱导将转染48 h后的各组脂肪间充质干细胞按2×105个/cm2的密度接种于6孔板中，加入DMEM培养基。当细胞长至70%-80%融合时，用成骨诱导培养液进行诱导分化，每3 d换1次成骨诱导培养液。
1.4.5 碱性磷酸酶活性检测成骨诱导第7天收集各组细胞，通过酶标法检测碱性磷酸酶活性。用细胞裂解液充分裂解收集的细胞，PBS洗涤3次，12 000 r/min离心10 min，离心后取上清液，按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在波长520 nm处测定吸光度值。
1.4.6 茜素红染色成骨诱导第14天收集各组细胞，PBS洗涤2次，在常温条件下用40 g/L多聚甲醛固定30 min，除去固定液，PBS洗涤3次，加入茜素红染液染色5 min，PBS洗涤3次，在倒置显微镜下观察。
1.4.7 Real-time PCR(RT-PCR)检测脂肪间充质干细胞成骨诱导第0，3，7，14，21天，以及转染后各组脂肪间充质干细胞成骨诱导第6天，通过Trizol法提取细胞中的总RNA，用分光光度计测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。PCR体系(10 μL)：SYBR Premix Ex Taq 5 μL、ROX Reference Dye II 0.2 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、cDNA样本0.1 μL、加ddH2O至10 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

1.4.8 Western blot检测成骨诱导第6天收集各组细胞，PBS洗涤，通过BCA法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳将蛋白转至硝酸纤维素膜上，TBST洗涤后用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入Runt相关转录因子2(1∶200)、碱性磷酸酶(1∶400)、骨桥蛋白(1∶1 500)、骨钙素(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，加入二抗(1∶3 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，ECL显影。
1.5 主要观察指标 ①脂肪间充质干细胞的钙化程度及细胞表面钙盐沉积情况；②脂肪间充质干细胞中lncRNA-HOTAIR、Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素的基因表达；③脂肪间充质干细胞中Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素的蛋白表达。
1.6 统计学分析所有数据均通过SPSS 21.0软件进行统计分析，实验结果以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，临床修复骨缺损主要采用骨移植和非生物材料移植的方法。然而，由于骨移植存在来源有限、供体部位术后疼痛、供体骨外形不符等问题，并未在临床上推广；人工骨替代物也因其具有机械性差、生物相容性低、在体内难降解等局限性，未被广泛应用[17-19]。组织工程技术成为解决骨缺损的最新研究手段，而种子细胞的优化和选择一直是该领域的研究热点。脂肪间充质干细胞是一种具有多向分化潜能和自我更新能力的干细胞，且具有来源广、易获取、机体损伤小、能反复提取等特点[20-21]。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪间充质干细胞中的趋化因子受体表达更高，这能促进细胞的迁移和归巢，更有利于骨损伤的修复，且自身来源的脂肪间充质干细胞几乎没有免疫原性，是理想的种子细胞[22-23]。
已有研究显示，lncRNA是一种可参与包括细胞分化转录、RNA衰变、表观遗传调控等多种生物学过程的非编码RNA[24]。HUYNH等[25]发现，lncRNA是骨质疏松和骨关节炎等骨骼相关疾病的潜在生物标志物和治疗靶点。YOSHIOKA等[26]研究表明，lncRNA在间充质干细胞成骨分化过程中起表观遗传调控作用。毕凤江等[27]通过实验发现，过表达lncRNA HOTAIR能降低骨髓间充质干细胞中成骨相关基因的表达，而敲减lncRNA HOTAIR能升高成骨相关基因的表达。该研究结果显示：在脂肪间充质干细胞成骨分化过程中，lncRNA HOTAIR的表达水平降低，lncRNA HOTAIR负向调控脂肪间充质干细胞的成骨分化。
碱性磷酸酶是脂肪间充质干细胞成骨分化早期的重要标志物之一，其在脂肪间充质干细胞钙化过程中起十分重要的作用，可直接决定细胞的钙化情况[28]。脂肪间充质干细胞中碱性磷酸酶的表达水平能直观反映其早期成骨分化情况。骨钙素是一种非胶原蛋白，在骨基质矿化过程中由成骨细胞合成，其表达水平可有效反映细胞的成骨活动[29-30]。骨桥蛋白是一种分泌型糖基化磷酸化蛋白，在细胞黏附和基质矿化过程中扮演重要角色，可作为成骨细胞分化的重要标志[31-32]。Runt相关转录因子2是Runt家族成员之一，能诱导间充质细胞向成骨细胞分化，有证据表明其可增加细胞中骨钙素及Ⅰ型胶原蛋白等成骨基因的表达[33-35]。该研究结果显示，转染lncRNA HOTAIR mimics后脂肪间充质干细胞中成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥蛋白 mRNA及蛋白表达水平显著降低；相反，转染lncRNA HOTAIR inhibitor会促进脂肪间充质干细胞中成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素、骨桥蛋白 mRNA及蛋白的表达。这一结果说明，lncRNA HOTAIR可以抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化能力。
综上所述，lncRNA HOTAIR可负向调控脂肪间充质干细胞内成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素及骨桥蛋白的表达，为骨缺损修复提供了有效的干预靶点，但其具体的作用机制还需进一步的深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

LncRNA-HOTAIR可调节脂肪间充质干细胞向成骨细胞的分化

LncRNA-HOTAIR can regulate differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts

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