2.1   差异表达基因筛选结果   将6个样本的测序原始数据归一化并转换为log10值，总体数据分布用箱形图和曲线图表示，见图1A、B，样品相关性用热图表示，见图1C，6组数据归一化处理后集中趋势较好，变异性较小，R2均大于0.6，表明数据拟合程度的较好，可靠性高。将原始数据归一化并转换为log2值，根据矫正后的P < 0.05和|log2 FC(fold change)|≥1作为标准筛选差异基因并用热图表示，见图2。与健康对照组相比，疾病组中共获得差异lncRNA 127个，差异mRNA 921个，见表1。











2.2   富集分析结果   基因本体论富集分析的结果显示差异mRNA参与有丝分裂细胞周期、细胞对 DNA 损伤刺激的反应、负调控细胞增殖、甲基化、成骨分化、酒精代谢过程、干细胞增殖等生物学过程，见图3。



京都基因和基因组百科全书通路富集分析显示差异mRNA参与调节嘌呤代谢、嘧啶代谢、甘油脂代谢等多种代谢途径，同时还可能参与核酸切除修复、细胞凋亡、DNA复制、p53信号通路等，见图4。



2.3   lncRNA靶基因预测结果    对lncRNA进行靶基因预测发现有10个lncRNA可以找到205个miRNA，并通过FunRich3.1.3查找到5 184个mRNA靶点。
2.4   ceRNA网络构建结果   预测的5 184个mRNA与作者所鉴定的921个mRNA有258个交集基因，最后仅保留lncRNA与mRNA表达呈正相关的RNA构建ceRNA网络，见图5，包括3个lncRNA(SNHG3、MUC19、LINC00476)、5个miRNA(hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-135a-5p)和11个mRNA(PEX5、ACTR3B、CHMP4B、CSMD1、MTRF1、ZNF3、HTR7、NR5A2、SYT14、CASK、ING5)，见表2。

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酒精性股骨头坏死主要是由饮酒引起的股骨头局部骨骼组织缺血坏死，以髋关节疼痛、功能活动障碍、跛行等为主要症状，如果得不到及时有效治疗会进展为股骨头塌陷，严重影响患者的生活质量，最终大多数患者需要进行髋关节置换来恢复关节的功能活动[1]。虽然酒精性股骨头坏死的主要致病因素是长期大量饮酒，但是其中的具体致病机制尚不明确。
近年来，研究发现lncRNA和miRNA可作为成骨分化的关键调控因子在股骨头坏死中发挥重要作用。lncRNAs参与了骨髓间充质干细胞成骨分化的调节，其异常表达会影响骨髓间充质干细胞的成骨分化，从而导致骨科疾病的发生发展[2]。miRNAs在不同的生理过程中起着至关重要的作用，参与了破骨细胞的形成、分化、凋亡和再吸收等过程，在调节骨骼发育方面发挥着关键作用[3]。最新研究发现lncRNA可以通过靶向miRNA调节mRNA的表达，进而影响靶基因的功能表达，这类lncRNA被称为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)[4]，因此对lncRNA、miRNA和mRNA之间联系的深刻理解将极大地增进对股骨头坏死发生发展分子机制的了解，ceRNA网络分析可能为骨骼疾病的创新性诊断和治疗提供新的研究思路[5]。目前lncRNA在酒精性股骨头坏死中的表达模式及生物学功能尚不明确，探索酒精性股骨头坏死的ceRNA网络调控机制有助于人们找到预防和治疗酒精性股骨头坏死的新方法。研究将通过转录组测序探索酒精性股骨头坏死患者血液与健康人血液之间的基因表达差异并构建ceRNA网络，为进一步揭示酒精性股骨头坏死的发病机制及治疗方法奠定理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   转录组学实验。
1.2   时间及地点   实验于2020年8-12月在广西中医药大学第一附属医院分子实验室完成。
1.3   对象   于2020年8-12月从广西中医药大学第一附属医院骨二科招募3例酒精性股骨头坏死患者和3名健康志愿者。所有参与者均为中国汉族男性，彼此之间没有血缘关系，均签署了试验方案知情同意书，并且该研究方案已经过广西中医药大学第一附属医院伦理审查委员会批准。
酒精性股骨头坏死患者纳入标准：①符合成人股骨头坏死的诊断标准(中国成人股骨头坏死临床诊疗指南2020)[6]；②饮酒时间达5年以上；③年龄在20-50岁之间。
酒精性股骨头坏死患者排除标准：①有与酒精性股骨头坏死无关的慢性基础疾病；有乙型肝炎、梅毒等传染性疾病；②属于激素性股骨头坏死、创伤性股骨头坏死或特发性股骨头坏死；③长期服用其他影响骨代谢的药物。
健康对照组纳入标准：①没有严重疾病或激素使用史的健康个体；②没有酒精性股骨头坏死；③既往有饮酒史；④年龄20-50岁之间。
1.4   方法   
1.4.1   外周血RNA提取及测序  抽取3例酒精性股骨头坏死患者和3名健康志愿者的外周静脉血进行基因表达谱测序。将两组患者的血清样品在4 ℃下13 000×g离心5 min，以消除沉淀和细胞碎片。使用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion-1561)提取总RNA，NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)评估RNA纯度和定量。RNA的完整性通过Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies，USA)进行评估。使用Ribo-Zero Gold试剂盒(Illumina，San Diego，USA)从总RNA中去除核糖体RNA，然后使用NEBNext® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit(NEB，USA)生成文库，使用Agilent 2100生物分析仪进行定量后，使用Illumina HiSeq X 10平台对文库进行测序。 
1.4.2   差异表达基因分析   使用R中的“ edgeR”包通过倍数变化过滤(|log2FC|>1和P < 0.05)鉴定差异表达的lncRNA和mRNA。差异表达的RNA图谱通过log2转化进行归一化。使用R中的“heatmap”包对差异基因图谱进行可视化。
1.4.3   富集分析   使用R中的“ org. hg .eg.db”包获得每个差异基因的Entrez-ID后，进行基因本体论富集分析和京都基因和基因组百科全书通路富集分析，并使用“ggplot2”R包可视化结果。
1.4.4   lncRNA靶基因预测   使用miRcode(http://www.mircode.org/)来预测与差异lncRNA相关的miRNA，然后使用FunRich 3.1.3软件(http://www.funrich.org)进行miRNA靶基因的预测。
1.4.5   构建ceRNA网络   基于ceRNA理论，lncRNA可以通过上调或下调miRNA来调控mRNA的表达，lncRNA与mRNA表达呈同向变化[7]。使用R包将最后预测出的mRNA与差异mRNA取交集，并且仅保留与差异lncRNA表达值呈正相关的mRNA，使用Cytoscape 3.8.0(https://cytoscape.org/)来构建相关的lncRNA-miRNA–mRNA ceRNA网络。 
1.5   主要观察指标   所有受试者外周血基因测序筛选结果。

脂肪细胞肥大增生、骨细胞脂质沉积、骨细胞脂肪变性、骨髓坏死、骨小梁变薄稀疏是酒精性股骨头坏死早期发生的组织病理学改变之一，其病理机制与血供受损、脂质代谢异常、干细胞成骨能力减弱、细胞凋亡、基因多态性等因素有关[8]。目前临床上常用的诊断和治疗股骨头坏死的方法大多存在着一定的局限性，难以进行早期诊断，各种治疗方法远期疗效难以预测。随着生物技术的发展，越来越多的研究开始关注利用干细胞疗法、基因疗法等方式诊治股骨头坏死[9-10]。
此次研究对3例酒精性股骨头坏死患者和3名健康志愿者的外周血进行转录组测序，鉴定出具有表达差异的lncRNA 127个，差异mRNA 921个(倍数变化≥2.0并且FDR≤0.05)，运用生物信息学技术对筛选出的差异mRNA进行富集分析，发现其富集在细胞分化、增殖、凋亡、甲基化、核酸剪切修复及酒精代谢、嘌呤代谢等多种代谢途径，表明细胞分化、表观遗传修饰及多种代谢途径的异常可能在酒精性股骨头坏死的发生发展中发挥作用。随后构建了ceRNA网络，包括3个lncRNA、5个miRNA和11个mRNA，通过该网络可以推断出lncRNA SNHG3、MUC19、LINC00476可能分别通过竞争性地与hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-135a-5p结合影响mRNA PEX5、ACTR3B、CHMP4B、CSMD1、MTRF1、ZNF3、HTR7、NR5A2、SYT14、CASK、ING5的功能表达，表明lncRNA通过miRNA介导的lncRNA-mRNA相互作用调节基因表达的潜在机制，可能在酒精性股骨头坏死的发病中发挥作用。
PEX5是过氧化物酶体相关基因之一，对维持哺乳动物细胞中的过氧化物酶体稳态具有重要意义，PPAR-γ是骨中脂肪生成的重要调节剂，下调 PPAR-γ可有效抑制骨髓间充质干细胞的脂肪分化并促进成骨分化，对股骨头坏死的发生发挥保护作用[11]。研究发现PEX5的降解或去除会导致过氧化物酶体的降解或自噬[12]，表明PEX5在维持PPAR-γ的正常功能中发挥作用。此次研究疾病组中的PEX5呈高表达状态，可能会增强PPAR-γ促进骨髓间充质干细胞成脂分化的能力。
CHMP4B是转运复合体Ⅲ(ESCRT-Ⅲ)所需的内体分类的核心成员，可降低小胶质细胞的坏死水平，改善神经炎症，促进神经功能恢复[13]。股骨头坏死的进行性神经退行性变过程常伴随着慢性炎症反应，包括表达促炎细胞因子的小胶质细胞和星形胶质细胞的活化[14]。此次研究中CHMP4B在疾病组呈高表达，表明酒精性股骨头坏死疾病进展的同时可能也伴随着坏死灶的修复。同时有研究发现，具有调节骨形成作用的FOXO1参与调节了CHMP4B的抗坏死作用，能在各种病理状态下减轻细胞损伤，降低活性氧水平并抑制细胞凋亡，促进CHMP4B的表达[15]。然而，FOXO1在成骨分化过程中的具体作用机制尚不明确[16]，进一步研究FOXO1对CHMP4B的调节作用有利于阐明FOXO1和CHMP4B在骨损伤修复过程中的具体机制。
NR5A2是多种癌症中的致癌基因，其基因中的单核苷酸多态性与癌症风险增加有关，如肝细胞癌[17]、非小细胞肺癌[18]、骨肉瘤等[19]。NR5A2是与进化相关的转录因子，参与维持胚胎干细胞的干细胞性和多能性，同时也是线粒体谷氨酰胺酶2的调节剂，通过增加线粒体质量和促进脂质、氨基酸、葡萄糖利用来刺激线粒体能量代谢[20]。NR5A2是T淋巴细胞活化诱导增殖的一个关键调节因子，能调节T细胞介导的免疫反应，靶向NR5A2不仅可用于减缓增殖，还可抑制肿瘤坏死因子α诱导的炎症和凋亡[21]。RIANCHO等[22]研究发现NR5A2在骨中表达并参与调节成骨细胞中的基因表达，其等位基因变异可能有助于解释遗传对骨量的影响，NR5A2可能成为治疗炎症性疾病和代谢性疾病的新兴治疗靶点[23]。
HTR7属于G蛋白偶联受体家族，与昼夜节律、焦虑、抑郁、精神分裂症、伤害感受和记忆有关，因为它具有多种生物学功能和可成药位点，许多转录因子可以与其启动子结合，是研究最多的药理学靶点之一[24]。WEI等[25-26]研究发现HTR7拮抗剂可以阻断5-羟色胺促进促炎细胞因子产生的作用，表明HTR7表达增加可能与炎症细胞因子水平的降低有关，在炎症中有潜在的治疗价值。有学者通过进行酒精依赖患者全基因组关联研究发现，HTR7中的两个变体rs7916403和rs2800143分别与酒精依赖易感性相关，HTR7多态性与酒精依赖之间有显著的隐性遗传效应[27]。但目前这种相关性的研究仍停留在精神疾病领域，对于因饮用酒精而导致的其他疾病领域(如酒精性股骨头坏死等)尚缺乏进一步的研究论证。
ING5属于生长抑制蛋白家族成员，在调节组蛋白乙酰化中发挥关键作用[28]。ING5蛋白与干细胞分化机制有关，涉及多种细胞功能，包括细胞周期调节、细胞凋亡和染色质重塑[29]。在间充质干细胞中，ING5过表达会使这些细胞形成更大的球体并保持自我更新的能力，这表明它们的干细胞样特征增加，而ING5的敲低则会导致其干细胞样特征减弱[30]。ING5已被鉴定为许多癌症中的肿瘤抑制因子，众多研究表明ING5的表达与肿瘤大小和淋巴结转移呈负相关，可以通过PI3K/AKT/MAPK、Akt/NF-κB、Smad等信号通路参与调节多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，在骨肉瘤细胞中ING的过表达可以通过激活Smad通路诱导细胞凋亡[31-33]，并且ING5水平受到miR-24、miR-193等多种miRNA的调节[34-35]，可能是治疗多种疾病的潜在治疗靶点。
SYT14属于SYT家族成员之一，SYT是丰富的、进化上保守的完整膜蛋白，在调节神经和内分泌系统的胞外分泌中发挥重要作用[36]。SYT能将钙水平变化与各种生物过程联系起来，如神经传递和激素反应性等，因此SYT14是神经发育和儿童异常发育的一个关键候选基因[37]。CASK是一种来自膜相关鸟苷酸激酶蛋白家族的支架蛋白，在神经元系统中发挥着重要作用，参与调节细胞增殖、细胞骨架重塑和细胞转移，其过表达与癌症的发生有关[38]。CASK的消耗通过激活细胞凋亡和JNK/c-Jun通路介导的自噬细胞死亡来增强肝细胞癌的化学敏感性[39]；此外，CASK还是胰岛素分泌过程中一种重要的调节剂[40]。ZNF代表了人类基因组中最大的转录因子家族，也是编码转录因子的基因家族中扩展最快的基因家族，具有最丰富的靶序列多样性，能通过其锌指基序的不同组合识别众多不同靶标[41]，参与多种生物过程，包括分化、发育、代谢、细胞凋亡、自噬和干性维持等。在过去的几十年里，越来越多的证据支持ZNF在癌症发生、进展和转移中的关键作用[42]，然而尚缺乏其在股骨头坏死中的相关研究。
CSMD1、MTRF1及ACTR3B都具有编码蛋白、识别基因位点、调节可变剪切的功能，对于进一步研究酒精性股骨头坏死的表观遗传特点及基因多态性具有重要的参考意义。CSMD1基因位于染色体8p23区域，跨越2 MB的DNA区域，CSMD1蛋白位于细胞膜上，是一种跨膜蛋白，主要由14个CUB结构域和14个sushi结构域组成，可能含有酪氨酸磷酸化位点，在神经元和上皮组织中均有表达，被证实与睾丸发育、补体调节、精神分裂症及癌症进展等多种过程相关[43]。MTRF1是一种脊椎动物特异性线粒体蛋白，作为RF家族中最长的蛋白质，是目前研究最多的非经典释放因子，然而其具体功能目前尚不明确。MTRF1拥有参与肽酰-tRNA水解和终止密码子识别的规范域，可能负责解码非标准线粒体终止密码子(AGG和AGA)，参与终止许多脊椎动物线粒体的开放阅读框[44]。MTRF1还可能是一个与脊椎动物线粒体核糖体共同进化的特定因子，以促使其适应新的rRNA结构[45]。ACTR3B可以编码肌动蛋白相关蛋白，可能在肌动蛋白细胞骨架中起重要作用[46]。
此次研究鉴定筛选出的关键基因目前在酒精性股骨头坏死相关机制中的研究报道较少，对后续的基础研究有一定的参考价值和较强的研究发展空间，有待各研究团队进一步的探索。此次研究通过ceRNA网络分析初步构建了酒精性股骨头坏死中的ceRNA调控网络图谱，同时发现了NR5A2、HTR7、ING5等具有较强成药性的治疗靶点，为基因疗法提供了新的研究思路和方向，筛选出了研究酒精性股骨头坏死新的候选生物标志物。
然而研究也存在有一些不足：首先，用于测序分析的酒精性股骨头坏死样本量很小，缺乏广泛的代表性；其次，筛选出的lncRNA和mRNA缺乏实验验证；最后，虽然成功构建了lncRNA、miRNA和mRNA 的ceRNA 网络，但其中具体的调控机制仍需要进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
竞争性内源RNA(ceRNA)网络：指lncRNA、circRNA、假基因等竞争性地与miRNA结合，从而调控mRNA功能表达的特殊调控机制。
生物标志物：是一种可衡量疾病发生或存在程度的指标，可作为确认生物体是否发生或存在某种特定疾病的依据。生物标志物可以是特定的细胞、分子或基因、基因产物、酶或激素等。生物标志物有助于疾病的早期诊断、疾病预防、药物靶标识别、药物反应等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

研究通过转录组测序筛选酒精性股骨头坏死患者与健康人外周血中差异表达的mRNA和lncRNA，并通过在线数据库分别进行lncRNA的miRNA靶点预测以及miRNA的mRNA靶点预测，再将差异mRNA与预测mRNA进行映射，构建lncRNA-miRNA-mRNA竞争性内源RNA(ceRNA)调控网络，对其中的关键基因进行探讨，有利于筛选酒精性股骨头坏死的潜在生物标志物，为后续进一步的机制研究奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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