褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨

doi:10.12307/2022.759

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (30): 4800-4805.doi: 10.12307/2022.759

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨

申恩谱1，黄霸2，刘丹平1，綦惠3，吴志文1，李贝贝1

1锦州医科大学附属第一医院，辽宁省锦州市 121000；2中国科学院大学重庆医院，重庆市 400013；3北京市创伤骨科研究所，北京积水潭医院，北京市 100035

收稿日期:2021-07-20 接受日期:2021-09-13 出版日期:2022-10-28 发布日期:2022-03-29
通讯作者: 刘丹平，博士，主任医师，教授，锦州医科大学附属第一医院，辽宁省锦州市 121000 綦惠，博士，副研究员，北京市创伤骨科研究所，北京积水潭医院，北京市 100035
作者简介:申恩谱，男，1994年生，锦州医科大学在读硕士，主要从事骨质疏松基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81572140)，项目负责人：刘丹平；北京市属医学科研院所公益发展改革试点项目(第三批，京医研2019-9)，项目参与人：綦惠

Exosomes derived from melatonin-modified bone marrow mesenchymal stem cells promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

Shen Enpu1, Huang Ba2, Liu Danping1, Qi Hui3, Wu Zhiwen1, Li Beibei1

1First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China; 2Chongqing People’s Hospital, University of Chinese Academy of Sciences, Chongqing 400013, China; 3Beijing Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China

Received:2021-07-20 Accepted:2021-09-13 Online:2022-10-28 Published:2022-03-29
Contact: Liu Danping, MD, Chief physician, Professor, First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China Qi Hui, MD, Associate researcher, Beijing Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China
About author:Shen Enpu, Master candidate, First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81572140 (to LDP); Pilot Project for Public Welfare Development and Reform of Beijing Municipal Medical Research Institute (Third Batch), No. 2019-9 (to QH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨质疏松：是一种以骨量减少、骨微结构改变为主要特征的全身性代谢疾病，该研究主要探索一种防治骨质疏松的潜在新方法。
外泌体：是一种直径30-150 nm的微小囊泡，该研究中SD大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体粒径为40-100 nm，CD9、CD63及CD81呈阳性表达。

背景：骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构改变为主要特征的全身性代谢疾病，现有的药物治疗效果有限且不良反应明显，而骨髓间充质干细胞来源外泌体因其非免疫原性等优势，有望成为治疗骨质疏松的新方法。
目的：探讨褪黑素预处理骨髓间充质干细胞后提取的外泌体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及作用机制，分析其作为无细胞方式促进成骨治疗骨质疏松的可行性。
方法：采用全骨髓贴壁法分离大鼠原代骨髓间充质干细胞并鉴定；超高速离心法提取骨髓间充质干细胞中的外泌体(NC-Exos)和褪黑素预处理骨髓间充质干细胞中的外泌体(MT-Exos)并鉴定；共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞对外泌体的摄取情况。骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基中培养，分别以MT-Exos和NC-Exos处理骨髓间充质干细胞，以PBS处理骨髓间充质干细胞为空白对照组。采用碱性磷酸酶活性、茜素红染色评估各组骨髓间充质干细胞成骨分化效果，Western blot和RT-qPCR分别检测各组骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2的蛋白和mRNA表达；Western blot检测骨髓间充质干细胞中Wnt1和β-catenin的蛋白表达。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞呈典型纺锤样形态且具备三系分化能力；外泌体的直径大多数小于150 nm，且均表达外泌体特异性标记蛋白CD9、CD63和CD81，能够被骨髓间充质干细胞摄取；②成骨诱导7 d后，相较于NC-Exos处理组，MT-Exos处理组显示出更高的碱性磷酸酶活性(P < 0.01)，碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2的蛋白和mRNA表达(P < 0.05)，Wnt1、β-catenin蛋白表达(P < 0.001)；③成骨诱导14 d后，相较于NC-Exos处理组，MT-Exos处理组显示出更多的红色钙结节；④上述实验结果表明，MT-Exos通过激活Wnt1/β-catenin信号通路显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-3751-895X (申恩谱)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 外泌体, 褪黑素, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Osteoporosis is the most prevailing bone disease, which is characterized by the decrease in bone mass and deterioration of bone microarchitecture. Current treatments, although being used clinically for a long time, still have many side effects. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes are expected to become a new method for the treatment of osteoporosis due to their non-immunogenicity and other advantages.
OBJECTIVE: To explore the effects of exosomes derived from melatonin (MT)-modified bone marrow mesenchymal stem cells on the osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells and to analyze its feasibility as a cell-free method to promote osteogenic treatment of osteoporosis.
METHODS: Primary bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and characterized by whole bone marrow adherent method. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells (NC-Exos) and MT pretreated bone marrow mesenchymal stem cells (MT-Exos) were extracted by ultracentrifuge and identified. The uptaking of exsomes into bone marrow mesenchymal stem cells was observed under a confocal microscope. Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in osteogenic induction medium. Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with MT-Exos and NC-Exos, separately. Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with PBS as a blank control group. Alkaline phosphatase activity and alizarin red S staining were employed to evaluate the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in each group. The mRNA and protein expression levels of alkaline phosphatase and Runt related transcription factor 2 were measured through RT-PCR and western blot assay, respectively. Western blot assay was utilized to detect the protein expression of Wnt1 and β-catenin in bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells had a typical spindle-like morphology and had the ability to differentiate into three lines. The majority of exosomes was smaller than 150 nm in diameter and expressed CD9, CD63, and CD81. Exosomes were taken up by bone marrow mesenchymal stem cells. (2) At 7 days after osteoinduction, compared with the NC-Exos group, MT-Exos group presented higher alkaline phosphatase activity (P < 0.01), mRNA and protein expression of alkaline phosphatase and Runt related transcription factor 2 (P < 0.05), and Wnt1 and β-catenin protein expression (P < 0.001). (3) At 14 days after osteoinduction, compared with the NC-Exos group, MT-Exos group showed more red calcium nodules. (4) The present study has demonstrated that MT-Exos have the ability to promote osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by activating Wnt1/β-catenin signaling pathway.

Key words: exosome, melatonin, bone marrow mesenchymal stem cells, osteogenesis, signaling pathway

中图分类号:

申恩谱, 黄霸, 刘丹平, 綦惠, 吴志文, 李贝贝. 褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4800-4805.

Shen Enpu, Huang Ba, Liu Danping, Qi Hui, Wu Zhiwen, Li Beibei. Exosomes derived from melatonin-modified bone marrow mesenchymal stem cells promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(30): 4800-4805.

图/表（结果） 6

2.1 BMSCs的分离培养及鉴定结果大鼠BMSCs贴壁后使用显微镜观察可见其呈梭形或纺锤状，见图1A。成骨诱导14 d后，茜素红染色可观察到多个红色的钙化结节，见图1B；成脂诱导21 d后，油红O染色可观察到细胞内有红色脂滴形成，见图1C；成软骨诱导21 d后，甲苯胺蓝染色可观察到胞浆呈蓝色，见图1D。以上结果证明，分离提取的细胞符合BMSCs的特征。

2.2 BMSCs外泌体的分离与鉴定结果通过粒径分析发现，提取的外泌体直径在40-100 nm之间，见图2A。透射电镜下观察外泌体呈球形，见图2B。Western blot结果显示外泌体表面标志物CD9、CD63、CD81的表达呈阳性，见图2C。综合以上实验结果，可以证明提取物为大鼠BMSCs来源外泌体。

2.3 外泌体摄取情况外泌体通过内吞作用将蛋白质、mRNA等物质传递到靶细胞，从而实现信号传输和信号应答。用DiI标记外泌体(红色)，Hoechst33342标记BMSCs细胞核(蓝色)，Phalloidin复染细胞骨架(绿色)，共聚焦显微镜观察显示外泌体能够被BMSCs摄取，且主要聚集在BMSCs的核周区域，见图3。

2.4 BMSCs来源外泌体促进BMSCs成骨分化将BMSCs在成骨诱导培养基中成骨诱导7 d，与对照组相比，NC-Exos和MT-Exos均可显著提高碱性磷酸酶活性，而MT-Exos对于升高碱性磷酸酶活性的作用更强，且差异有显著性意义(P < 0.05，n=3)，见图4A。成骨诱导14 d后，茜素红染色结果表明，MT-Exos组有更多的钙化结节形成，而NC-Exos组则相对较少，见图4B。

2.5 BMSCs来源外泌体促进BMSCs成骨特异性基因和蛋白表达 Western blot结果显示，在MT-Exos的持续刺激下，成骨特异性Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶的蛋白表达明显增强，且其作用显著强于NC-Exos(Runt相关转录因子2：P < 0.05，碱性磷酸酶：P < 0.01，n=3)，见图5A。
RT-qPCR结果表明，与对照组相比，MT-Exos组Runt相关转录因子2及碱性磷酸酶的mRNA表达水平显著提高(P < 0.001)，且其作用显著强于NC-Exos组(P < 0.01，n=3)，见图5B。

2.6 MT-Exos通过激活Wnt1/β-catenin通路增强BMSCs成骨分化能力上述实验结果表明，与NC-Exos相比，MT-Exos促进BMSCs成骨分化的效果更加明显。为探究这一现象的潜在机制，验证了Wnt1/β-catenin信号通路关键蛋白的表达情况，Wnt1及β-catenin在MT-Exos组中的表达水平明显高于NC-Exos组，见图6，差异有显著性意义(Wnt1：P < 0.05，β-catenin：P < 0.01，n=3)。

参考文献

[1] LI T, JIANG S, LU C, et al. Melatonin: Another avenue for treating osteoporosis? J Pineal Res. 2019;66(2):e12548.
[2] 张智海,张智若,刘忠厚,等.中国大陆地区以-2.0SD为诊断标准的骨质疏松症发病率回顾性研究[J].中国骨质疏松杂志,2016, 22(1):1-8.
[3] COSMAN F, DE BEUR SJ, LEBOFF MS, et al. Clinician’s Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporos Int. 2014; 25(10):2359-2381.
[4] DAS S, CROCKETT JC. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug Des Devel Ther. 2013;7:435-448.
[5] AGHEBATI-MALEKI L, DOLATI S, ZANDI R, et al. Prospect of mesenchymal stem cells in therapy of osteoporosis: A review. J Cell Physiol. 2019;234(6): 8570-8578.
[6] ZUO R, LIU M, WANG Y, et al. Correction to: BM-MSC-derived exosomes alleviate radiation-induced bone loss by restoring the function of recipient BM-MSCs and activating Wnt/beta-catenin signaling. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):33.
[7] LUO ZW, LI FX, LIU YW, et al. Aptamer-functionalized exosomes from bone marrow stromal cells target bone to promote bone regeneration. Nanoscale. 2019;11(43):20884-20892.
[8] ZHANG L, YU D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1871(2):455-468.
[9] MA ZJ, YANG JJ, LU YB, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: Toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine. World J Stem Cells. 2020;12(8):814-840.
[10] INGATO D, LEE JU, SIM SJ, et al. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. J Control Release. 2016;241:174-185.
[11] 綦惠,黄霸,杰永生,等.干细胞外泌体对骨质疏松大鼠骨生成的影响[J].中国矫形外科杂志,2021,29(8):726-730.
[12] HARDELAND R. Aging, Melatonin, and the Pro- and Anti-Inflammatory Networks. Int J Mol Sci. 2019;20(5):1223.
[13] LIU W, YU M, XIE D, et al. Melatonin-stimulated MSC-derived exosomes improve diabetic wound healing through regulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the PTEN/AKT pathway. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):259.
[14] ZHANG L, SU P, XU C, et al. Melatonin inhibits adipogenesis and enhances osteogenesis of human mesenchymal stem cells by suppressing PPARγ expression and enhancing Runx2 expression. J Pineal Res. 2010;49(4):364-372.
[15] AMSTRUP AK, SIKJAER T, MOSEKILDE L, et al. Melatonin and the skeleton. Osteoporos Int. 2013;24(12):2919-2927.
[16] 肖大伟,刘丹平,田大川,等.突变型低氧诱导因子-1α修饰骨髓间充质干细胞来源的外泌体联合软骨再生支架治疗家兔早期软骨缺损[J].中华实验外科杂志,2018,35(5):888-891.
[17] HUANG B, SU Y, SHEN E, et al. Extracellular vesicles from GPNMB-modified bone marrow mesenchymal stem cells attenuate bone loss in an ovariectomized rat model. Life Sci. 2021;272:119208.
[18] MIANEHSAZ E, MIRZAEI HR, MAHJOUBIN-TEHRAN M, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a new therapeutic approach to osteoarthritis? Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):340.
[19] BHATTI FU, MEHMOOD A, LATIEF N, et al. Vitamin E protects rat mesenchymal stem cells against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in vitro and improves their therapeutic potential in surgically-induced rat model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2017; 25(2):321-331.
[20] QAZI TH, MOONEY DJ, DUDA GN, et al. Biomaterials that promote cell-cell interactions enhance the paracrine function of MSCs. Biomaterials. 2017;140:103-114.
[21] LIU Z, GAN L, ZHANG T, et al. Melatonin alleviates adipose inflammation through elevating α-ketoglutarate and diverting adipose-derived exosomes to macrophages in mice. J Pineal Res. 2018;64(1). doi: 10.1111/jpi.12455.
[22] HUANG P, WANG L, LI Q, et al. Atorvastatin enhances the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells-derived exosomes in acute myocardial infarction via up-regulating long non-coding RNA H19. Cardiovasc Res. 2020;116(2):353-367.
[23] SATOMURA K, TOBIUME S, TOKUYAMA R, et al. Melatonin at pharmacological doses enhances human osteoblastic differentiation in vitro and promotes mouse cortical bone formation in vivo. J Pineal Res. 2007;42(3):231-239.
[24] RADIO NM, DOCTOR JS, WITT-ENDERBY PA. Melatonin enhances alkaline phosphatase activity in differentiating human adult mesenchymal stem cells grown in osteogenic medium via MT2 melatonin receptors and the MEK/ERK (1/2) signaling cascade. J Pineal Res. 2006;40(4):332-342.
[25] LIANG B, LIANG JM, DING JN, et al. Dimethyloxaloylglycine-stimulated human bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes enhance bone regeneration through angiogenesis by targeting the AKT/mTOR pathway. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):335.
[26] BARON R, KNEISSEL M. WNT signaling in bone homeostasis and disease: from human mutations to treatments. Nat Med. 2013;19(2):179-192.

引言

骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构改变为主要特征，导致骨脆性及骨折风险增加的系统性骨骼疾病[1]。流行病学调查显示，中国已有1.4亿人患有骨质疏松[2]，骨质疏松继发骨折给家庭和社会带来沉重的负担。临床上治疗骨质疏松的药物主要分为骨吸收抑制剂以及促合成类药物两大类[3-4]：前者如降钙素类、雌激素类等，主要通过抑制骨吸收、延缓骨丢失来发挥作用，而对已丢失的骨组织无作用；后者如甲状旁腺素类似物(特立帕肽)，通过增强骨合成、提高骨密度来改善骨质量。尽管抗吸收药物和促合成代谢类药物被用于骨质疏松的治疗，但这些药物疗效有限且长期服用会产生严重的不良反应。因此，探索新的治疗手段对骨质疏松的防治具有非常重要的意义。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有旺盛的增殖能力和多向分化潜能，在骨稳态维持中起着重要的作用。骨稳态是通过平衡破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成来维持的，当这种平衡由于骨吸收增加和(或)骨形成不足而被破坏时，就会发生严重的骨量流失。以往研究已证实将BMSCs注射至骨质疏松动物模型可显著缓解骨丢失，促进骨合成[5]。然而，BMSCs注射疗法存在着移植效率低下、免疫排斥和致瘤风险[6]。越来越多的研究表明，旁分泌在间充质干细胞的生物学行为中发挥重要作用，间充质干细胞发挥作用的同时分泌多种细胞因子，而在众多的旁分泌因子中，细胞外囊泡一方面参与细胞间的通讯、调节多种生理和病理过程，另一方面还具有疾病诊断和治疗潜能，因此受到众多研究者关注。外泌体已被确定为旁分泌作用的主要介质[7]，是一种由多种细胞分泌的脂质双分子层膜性囊泡，其直径为30-150 nm，其中包含有蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等物质[8]。BMSCs源性外泌体具有与间充质干细胞类似的组织修复能力[9]，并且外泌体独特的脂质双分子层结构能够保护携带的RNA和蛋白质等生物活性分子，减缓其降解速度，从而确保这些生物活性分子在细胞间稳定传递[10]。在之前的研究中也已证实，BMSCs来源外泌体能够促进骨生成[11]。

褪黑素(melatonin，MT)是一种主要由松果体产生的内源性神经激素，能够发挥免疫调节、抗炎、细胞保护、抗氧化功能和骨稳态调节作用[12-13]。在体外，褪黑素通过促进BMSCs向成骨细胞方向分化来改善骨形成[14]。此外，褪黑素被认为会减少核因子κB受体活化因子配体的合成，阻止进一步的骨吸收[15]。已有许多研究表明经过预处理(物理干预、低氧培养、药物刺激)的间充质干细胞生物活性得到显著增强。但是干细胞疗法存在免疫原性、致瘤性等问题，而间充质干细胞来源外泌体不仅具有与间充质干细胞类似的组织修复能力，同时也可以避免干细胞疗法存在的问题。因此，该研究探讨了褪黑素预处理BMSCs后提取的外泌体(MT-Exos)对BMSCs成骨分化能力的影响及其可能机制，分析MT-Exos作为新的无细胞方法在骨质疏松治疗中的潜力，为骨质疏松治疗提供了新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年7月在锦州医科大学附属第一医院辽宁省医学组织工程重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物清洁级SD雄性大鼠15只，2周龄，体质量30-40 g，由锦州医科大学SPF级动物中心提供，用于原代BMSCs的提取。
1.3.2 实验试剂褪黑素(Invitrogen，美国)；α-MEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；磷酸盐缓冲液(索莱宝，中国)；成骨诱导培养基(赛业生物，中国)；CD9、CD63、CD81抗体(Santa Cruz，美国)；DiI(Sigma-Aldrich，美国)；Hoechst 33342(碧云天，中国)；Phalloidin染料(Invitrogen，美国)；碱性磷酸酶试剂盒(碧云天，中国)；反转录试剂盒(TaKaRa，日本)。
1.3.3 实验仪器倒置普通光学显微镜(Leica，德国)；电泳仪(伯乐，美国)；qPCR反应仪(Eppendorf，德国)；恒温细胞培养箱(海尔公司，中国)；台式微量超速离心机(Thermo Scientific公司，美国)；HITACHI CP100WX超速离心机(HITACHI公司，日本)；Zetasizer Nano ZS纳米粒径分析仪(Malvern，英国)。
1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs分离培养及鉴定参考已发表的文章[16]，将SD大鼠行异氟烷吸入麻醉后脱颈处死，无菌条件下，备皮消毒，分离完整的后肢，剔除胫骨和股骨附着的肌肉组织，将胫骨、股骨骨髓腔用α-MEM培养液反复冲洗至骨髓腔发白，10 mL离心管收集灌洗液，用细胞筛网去除其他组织，1 200×g离心3 min，去除上清，用5 mL含体积分数为10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-MEM培养液重悬混匀，将细胞悬液接种于培养皿，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中常规培养，48 h后半量换液，96 h后再次换液观察细胞生长情况，每两三天传代，待细胞融合度达80%-90%用0.25%胰酶消化，按1∶2传代。传至第4代细胞用于后续实验。倒置显微镜观察BMSCs形态并拍照记录。为了验证BMSCs三系分化特征(成骨、成脂、成软骨)，将生长良好的BMSCs接种于明胶包被的12孔板中(3×105个/孔)，待细胞融合度达到50%-60%时，分别进行成骨、成脂和成软骨诱导，然后视细胞的生长情况及形态变化，分别进行茜素红染色、油红O染色、阿尔新蓝染色并拍照记录。

1.4.2 外泌体的分离与鉴定参考已发表的文章[17]，用去除外泌体的α-MEM完全培养基培养BMSCs，在培养基中加入褪黑素(100 μmol/L)，48 h后收集培养液。将收集的培养液以10 000×g离心20 min，收集上清液，在超速离心机中 100 000×g离心70 min；弃去上清，用PBS重悬，用0.22 µm滤器过滤，收集滤液再在100 000×g下离心70 min，用少量PBS重悬收集到较为纯净的外泌体并于-80 ℃保存备用。透射电镜观察外泌体形态：取5 µL悬液于镍碳合金网上静置10 min后置于室温风干箱中风干，然后以草酸铀负染液负染10 min，PBS反复洗膜5次，室温干燥后在电压80 kV透射电镜下观察。纳米粒子跟踪分析检测外泌体粒径，Western blot法检测外泌体的特异性蛋白CD9、CD63、CD81的表达。
1.4.3 BMSCs摄取外泌体按照DiI使用说明书，将外泌体用红色荧光染料DiI标记，100 000×g离心70 min除去未结合染料。将第4代BMSCs接种于共聚焦培养皿中(1×105个)培养12 h后，将DiI标记的外泌体与生长良好的BMSCs在37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中共培养4 h，培养结束后PBS反复洗涤3次，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，细胞固定后用Hoechst33342室温复染细胞核，鬼笔环肽(Phalloidin)室温复染细胞骨架，共聚焦显微镜观察结果并拍照记录。
1.4.4 碱性磷酸酶活性检测取生长良好的第4代BMSCs接种于明胶包被的12孔板中(3×105个/孔)，待细胞融合度达到50%-60%时，将常规培养基更换为成骨诱导培养基，同时分别给予NC-Exos(100 mg/L)及MT-Exos(100 mg/L)处理，对照组给予同体积PBS处理，每2 d更换成骨诱导培养基，同时加入上述浓度MT-Exos和NC-Exos，成骨诱导7 d后， 40 g/L多聚甲醛固定15 min，按照BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒说明书，配置BCIP/NBT染色工作液，避光孵育，显微镜下观察以控制染色时间。ImageJ软件分析染色阳性面积。
1.4.5 茜素红染色成骨诱导14 d，40 g/L多聚甲醛固定 15 min，PBS洗3次，将PBS完全吸干净后慢慢加入茜素红染色液，染色30 min，显微镜下观察并拍照，ImageJ软件分析染色阳性面积。
1.4.6 Western blot检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2蛋白表达成骨诱导7 d后收集细胞，加入细胞裂解液提取蛋白，4 ℃，12 000×g离心25 min，收集上清液，使用BCA蛋白质检测试剂盒测定蛋白浓度，按样品体积的20%加入蛋白上样缓冲液(5×)，并将样品在干浴锅中加热10 min使蛋白变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，恒压80 V电泳30 min后调为200 V恒压电泳1 h，转膜1 h，结束后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入碱性磷酸酶(1∶500)、Runt相关转录因子2(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，隔日用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗室温孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，ECL化学发光底物试剂盒进行曝光显影，使用 ImageJ 软件计算每个条带的灰度值。
1.4.7 RT-qPCR检测碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2 mRNA表达成骨诱导7 d后收集细胞，按总RNA小量抽提试剂盒(双柱型)说明书提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，置于-80 ℃冰箱保存备用。RT-qPCR分析各组碱性磷酸酶及Runt相关转录因子2的基因表达，用2-∆∆CT法确定各基因的相对表达量。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①原代BMSCs形态与鉴定；②外泌体提取及摄取鉴定；③MT-Exos对BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶活性的影响；④MT-Exos对BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2的蛋白及mRNA表达的影响。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行分析，实验数据以x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着人口老龄化加剧，骨质疏松作为一种全身性慢性疾病，公共医疗的负担日益加重。近年来，人们认为间充质干细胞作为一种具有多向分化潜能的干细胞，是细胞治疗的绝佳选择，但其具体潜在作用机制尚不清楚。越来越多证据表明，旁分泌可能是间充质干细胞在组织修复中发挥作用的主要机制[18]，而外泌体作为间充质干细胞旁分泌的一种重要形式，在细胞间信号通讯中发挥重要作用[7]。

许多研究证实，经过预处理(物理干预、低氧培养、药物刺激)的间充质干细胞生物学活性得到显著增强。例如，经维生素E预处理的间充质干细胞，其软骨基质中蛋白多糖水平增加，进而软骨分化能力增强[19]。已有的研究表明，预处理间充质干细胞可增强其旁分泌功能，尤其是增强其外泌体的治疗潜能[20-21]。HUANG等[22]实验表明，经过阿托伐他汀预处理间充质干细胞，可上调间充质干细胞及其外泌体中的lncRNA H19水平，通过抑制炎症因子的分泌、增加血管内皮生长因子的释放，增强间充质干细胞参与的心脏保护作用；LIU等[13]研究发现褪黑素预处理间充质干细胞来源外泌体可通过靶向PTEN/AKT信号通路，调节巨噬细胞极化，从而改善糖尿病创口愈合。

褪黑素是1958年由AARON发现的一种调节昼夜节律、参与广泛生理过程的吲哚类激素(N-乙酰基-5-甲基色胺)[12]。在哺乳动物中，黑暗时褪黑素主要由松果体分泌，夜间暴露在光线下可能会降低血液褪黑激素浓度[1]。研究表明，除松果体外，褪黑素在骨髓及其他许多组织中均有合成，并且其在骨髓中合成的浓度是夜间血液中的2倍[1]。褪黑素作为一种哺乳动物体内广泛分布的激素，在炎症反应、成骨等生物学活动中都发挥重要作用。褪黑素不仅能影响BMSCs的体外活性，还能影响其分化能力，尤其是成骨能力[14]。褪黑素能够促进间充质干细胞成骨分化，同时抑制间充质干细胞成脂分化，并且在药理学浓度范围内以剂量依赖性规律增加碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白等成骨细胞增殖和分化标志物的表达[23]。RADIO等[24]发现在成骨诱导培养基中加入褪黑素，能够通过调节MT2受体及MEK/ERK信号通路提高BMSCs中碱性磷酸酶的表达。因此，当前很多研究者和临床医生都认为，褪黑素可能成为治疗骨质疏松的潜在候选药物。

该研究分析了MT-Exos对BMSCs成骨分化能力的影响。通过实验发现，相较于NC-Exos，MT-Exos能够更好地增强BMSCs成骨分化能力。LIANG等[25]研究也发现，二甲基草酰甘氨酸预处理人BMSCs提取的外泌体可以通过靶向AKT/mTOR信号通路促进骨再生。采用NC-Exos及MT-Exos作用于BMSCs后，MT-Exos组碱性磷酸酶活性升高、矿化结节的形成明显增多；成骨分化过程中的重要转录因子Runt相关转录因子2的表达明显增强；另一方面，RT-qPCR结果也证实了MT-Exos 能够靶向调节BMSCs的生物活性，使其成骨分化能力显著增强。该实验结果表明，经过褪黑素预处理BMSCs后获得的外泌体相较于直接获取的外泌体，能够进一步增强BMSCs成骨分化的能力。此外，对MT-Exos促进BMSCs成骨分化作用的潜在机制做了进一步的探讨。ZUO等[6]通过研究发现，BMSCs来源外泌体能够通过激活Wnt/β-catenin信号通路，延缓骨质疏松进程。经典Wnt/β-catenin信号通路激活后，Wnt蛋白能够上调下游蛋白β-catenin的表达，从而促进BMSCs成骨分化。不仅如此，Wnt信号对所有类型的骨细胞都至关重要，成人骨骼主要包含3种细胞类型：成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞。经典Wnt信号通路不仅能够促进间充质干细胞成骨分化，还能直接影响破骨细胞，从而调节成骨与骨吸收间的平衡[26]。应用Western blot评估Wnt1/β-catenin信号通路在MT-Exos促进BMSCs成骨分化中的作用，结果表明，相对于未经预处理获得的外泌体，Wnt1蛋白及其下游蛋白β-catenin的表达在MT-Exos的刺激下明显增强。

虽然在体外实验中证实了MT-Exos对BMSCs成骨分化的作用，但体内环境相比体外更为复杂，MT-Exos在体内的作用效果尚不确定。因此，后续还会进行动物实验，进一步分析MT-Exos对骨质疏松动物模型的治疗作用。另外，外泌体经过褪黑素预处理后，其包裹的生物活性物质产生的变化也需进一步探索。

通过以上实验结果表明，MT-Exos能够促进BMSCs成骨分化，推测其在体内将延缓骨质疏松进程，其潜在机制可能是Wnt1/β-catenin信号通路的激活。该研究为骨质疏松的防治提供了新思路，找到了一种潜在的治疗骨质疏松的新方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨

Exosomes derived from melatonin-modified bone marrow mesenchymal stem cells promote osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[4]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[5]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[6]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[7]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[8]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[9]	郭嘉, 丁琼桦, 刘泽, 吕思懿, 周泉程, 高玉花, 白春雨. 间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1093-1101.
[10]	吴玮玥, 郭晓东, 包崇云. 工程化外泌体在骨修复再生中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1102-1106.
[11]	周洪琴, 吴丹丹, 杨琨, 刘琪. 传递特定miRNA的外泌体可调控成骨并促进成血管[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1107-1112.
[12]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[13]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[14]	刘进, 李振, 郝慧琴, 王泽, 赵彩虹, 芦文静. 二妙散水提物调控胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 688-693.
[15]	李嘉骏, 夏天, 刘佳敏, 陈锋, 陈豪特, 卓映宏, 吴炜锋. 淫羊藿苷调控成骨信号相关通路治疗激素性股骨头缺血性坏死的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 780-785.