限制性应激对1型糖尿病模型大鼠的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.007

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (11): 1946-1950.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.007

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限制性应激对1型糖尿病模型大鼠的影响

卫光曦，万朝霞，戴红卫，王谋

重庆医科大学附属口腔医院，重庆市口腔疾病与生物医学研究中心，重庆市 400015

收稿日期:2012-06-26 修回日期:2012-07-12 出版日期:2013-03-12 发布日期:2013-03-12
通讯作者: 万朝霞，硕士，副教授，重庆医科大学附属口腔医院，重庆市口腔疾病与生物医学研究中心，重庆市 400015 wzxnancy@yahoo.com.cn
作者简介:卫光曦，男，1983年生，山东省龙口市人，汉族，2008年河北北方学院毕业，主要从事口腔生物力学研究。 weiguangxi_1983@sina.com

Restraint stress effects in type 1 diabetes rats

Wei Guang-xi, Wan Zhao-xia, Dai Hong-wei, Wang Mou

Chongqing Research Center for Oral Diseases and Biomedical Science, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China

Received:2012-06-26 Revised:2012-07-12 Online:2013-03-12 Published:2013-03-12
Contact: Wan Zhao-xia, Master, Associate professor, Chongqing Research Center for Oral Diseases and Biomedical Science, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China wzxnancy@yahoo.com.cn
About author:Wei Guang-xi, Chongqing Research Center for Oral Diseases and Biomedical Science, the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China weiguangxi_1983@sina.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：限制性应激为构建心理应激的一种方法。
目的：建立合适的糖尿病及限制性应激模型，分析限制性应激与1型糖尿病的关系。
方法：选取48只雄性SD大鼠，在腹腔内注射链脲佐菌素构建1型糖尿病大鼠模型。建模成功后将其随机分为2组，实验组施加限制性应激，对照组不施加。于施加限制性应激后的1，2，3和4周分别处死实验组和对照组的大鼠各6只，检测相关应激标识物：促肾上腺皮质激素、皮质酮以及胰高血糖素在血清中的浓度。并定期进行空腹血糖测试。
结果与结论：实验组大鼠在施加限制性应激1周后血糖及胰高血糖素增高显著高于对照组(P < 0.05或 P < 0.001)；血清中促肾上腺皮质激素，皮质酮等应急标识物水平显著高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。说明限制性应激可以升高糖尿病大鼠的血糖水平。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 限制性应激, 1型糖尿病, SD大鼠, 促肾上腺皮质激素, 皮质酮, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: A way to build psychological stress is restraint stress.
OBJECTIVE: To study the relationship of restraint stress and type 1 diabetes.
METHODS: Forty-eight male Sprague-Dawley rats underwent intraperitoneal injection of streptozotocin to rat models of type 1 diabetes mellitus. After the successful modeling, rats were randomly divided into two groups: stress group (the rats were exerted with restraint stress) and control group (no intervention). Six rats from either group were executed at 1, 2, 3 and 4 weeks after exerting stress, and the related stress markers were detected, including the levels of adrenal cortical hormone, corticosterone and glucagon in the serum. Fasting blood glucose was measured regularly in rats.
RESULTS AND CONCLUSION: In the stress group, the levels of glucose and glucagon, after a week of the stress, were higher than those in the control group (P < 0.05 or P < 0.001). Simultaneously, the levels of adrenal cortical hormone and corticosterone in serum were higher in the stress group compared with the control group (P < 0.05 or P < 0.001). These indicate that restraint stress can raise the blood sugar level of diabetic rats.

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, restraint stress, type 1 diabetes mellitus, Sprague-Dawley rats, adrenal cortical hormone, corticosterone, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

卫光曦，万朝霞，戴红卫，王谋. 限制性应激对1型糖尿病模型大鼠的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 1946-1950.

Wei Guang-xi, Wan Zhao-xia, Dai Hong-wei, Wang Mou. Restraint stress effects in type 1 diabetes rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(11): 1946-1950.

图/表（结果） 5

参考文献

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验观察。
时间及地点：实验于2009年3月至2010年9月在重庆医科大学实验动物中心完成(生物安全的防护水平：BSL-2，省级重点实验室)。
材料：6周龄雄性SD大鼠48只，清洁级，体质量(168±8) g，由重庆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(渝)2007-0001。
试剂：
Reagents:

实验方法：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为0.1 mol/L。取柠檬酸(FW:
210.14)2.1 g加入双蒸水100 mL中配成A液；柠檬酸钠(FW:294.10)2.94 g加入双蒸水100 mL中配成B液。然后将A、B液按一定比例混合(1∶1.32)，pH计测定pH值，调节pH=4.2-4.5，即是所需配置链脲佐菌素的柠檬酸缓冲液。
1型糖尿病模型制备：按照65-70 mg/kg标准称取链脲佐菌素，将配好柠檬酸缓冲液以1%的浓度溶解链脲佐菌素。将配好的链脲佐菌素液体即刻对大鼠进行腹腔注射(注射前大鼠需要
禁食不禁水12 h)。注射后3 d测试血糖，血糖高于16.7 mmol/L的大鼠为建模成功。模型不达
标者，3 d后补注链脲佐菌素(以10-20 mg/kg剂量腹腔注射)，待其血糖达标后，将其纳入实验。
限制性应激模型的制备：限制性应激模型就是将大鼠放入自制的制动器中，限制其自由活动，但是同时又不对其进行额外的挤压，并保持大鼠呼吸通畅不能进食、进水，因大鼠是夜间活动的动物，所以每天制动8 h(晚10：00-早6：00)，每早6：00将大鼠放回笼中。
实验动物分组：48只雄性SD大鼠1型糖尿病建模成功后(纳入标准：血糖>16.7 mmol/L)。随机分为2组，每组24只。实验组需要施加限制性应激(8 h/d)，施加的时间选定为每晚的10：00至次日的6：00；对照组不施加限制性应激。两组大鼠在施加应激后第2，3，4，5周随机各取6只处死。处死后的大鼠进行检测应激指标促肾上腺皮质激素、血清皮质酮含量, 同时再处死前每7 d在上午对大鼠进行一次空腹血糖测试。
促肾上腺皮质激素、皮质酮及胰高血糖素的测定：各组大鼠在麻醉后心脏穿刺取血2 mL置于肝素抗凝管， 37 ℃恒温水浴2 h，离心半径16 cm，3 000 r/min离心20 min，取上清液(血浆)，测定促肾上腺皮质激素、皮质酮及胰高血糖素的含量；将血液和血浆标本采用血常规检测及放射免疫分析法分别测定(具体方法根据试剂盒说明书的指示操作)。
主要观察指标：①两组大鼠应激标识物的检测。②两组大鼠血糖及体质量变化。
统计学分析：所得数据均采用SPSS 14.0 统计软件处理，以x(_)±s表示，采用完全随机原则设计组间各指标在不同时间均数比较的t 检验。

讨论

3.1 实验动物筛选 SD大鼠的生物学特性包含：①大鼠是昼伏夜动杂食动物。②喜啃咬，性情较温顺，抗病力强。③大鼠汗腺不发达。④嗅觉灵敏。⑤对噪声敏感。⑥对营养缺乏敏感。⑦对湿度要求严格，相对湿度为40%-70%。⑧大鼠的肝脏再生能力强，如切除60%-70%还能再生。⑨不能呕吐。⑩垂体、肾上腺功能发达，应激反应敏感，行为表现多样^[8]。

SD大鼠上述众多特性显示，该种动物是非常适合构建糖尿病和应激模型的。

3.2 关于构建糖尿病大鼠模型的评价 目前，用链脲佐菌素以构建1型糖尿病性大鼠模型的方法已经比较成熟^[9]。但是作者在实验中发现，在将链脲佐菌素粉剂与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2-4.5)调和后，应该即刻就对大鼠的腹腔进行注射。这样大鼠建模成功的概率比较高。如果在链脲佐菌素粉剂与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调和后15 min以上，其成功的比例就很低。而这与以往提到的在调和后30 min内就注射，有少许出入。作者认为这可能因为链脲佐菌素粉剂不能受潮，如果与缓冲液调和时间过长，则可能会引发链脲佐菌素的失活。

3.3 关于限制性应激大鼠模型的评价 应激是指机体在受到各种因素的刺激时所出现的非特异性的全身反应。任何躯体或心理的刺激，只要到达一定强度，除了引起与刺激因素直接相关的特异性变化外，都可以引起一组与刺激因素的非直接关系的全身非特异反应。这种对各种刺激的非特异性反应称为应激，而刺激因素被称为应激源。而应激源往往来自于环境因素；机体的内在因素；社会心理因素。在这些因素之中，普遍认为社会心理因素对糖尿病患者的影响最大，它可以影响糖尿病患者的血糖水平^[10-11]。而目前实际生活中的绝大多数糖尿病患者往往处于各种负面情绪的影响下，但是他们却没有意识到这种负面情绪可能会进一步使他们的病情恶化。

关于应激可以加重糖尿病的机制问题，许多学者认为。这些负面的社会心理因素会刺激到患者的下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)和交感神经系统。这会导致皮质类固醇，肾上腺素，神经肽Y的释放增多。皮质类固醇作为一种应急激素，它会促发葡萄糖的生成，增强脂解作用，以及减少B细胞的胰岛素的分泌并且降低了机体对胰岛素缺乏的敏感性^[12-13]。在葡萄糖和脂肪的代谢机制上肾上腺素的作用和皮质类固醇相似。而神经肽Y可以通过调节脂解作用，增加脂肪形成可以间接诱导肥胖症及一些代谢综合征。由此可见这些均可导致糖尿病病情的恶化。

在以往的国内外试验中，尝试构建心理应激的方式有很多。例如，冰敷法，剪尾法，高温刺激等不同方式来尝试使实验样本产生并达到预期的心理应激反应^[14-15]。其中由于通过制动来引发的限制性应激在强度，频率，持续的时间等方面便于控制，所以目前被国内外广大学者所采纳。实验所采用的制动器是由作者跟据限制性应激所需要的条件自制的一个制动器^[16]。它在不会过分加压的情况下，可以限制大鼠的自由活动(力量可以调节)，同时不会影响到大鼠饮水和呼吸。在将大鼠从制动器放回笼中后方便对其进行冲洗保持里面环境的清洁，完全符合限制性应激制动的要求。在实验中相较于对照组，实验组的大鼠在施加应激后大鼠血清中促肾上腺皮质激素，皮质酮水平均出现了显著的升高。同时也出现体质量下降的生物适应性变化，表明动物处于应激状态。其内分泌系统对应激刺激发生反应, 进行了适应性调节。同时实验组大鼠的胰高血糖素及空腹血糖也明显高于对照组，由糖尿病引发体质量下降的幅度均大于对照组。这说明在限制性应激状态下，1型糖尿病大鼠的病情进一步恶化了。但是作者实验中发现，在实验的后2周大鼠的应激标识物的浓度，血糖及体质量趋于稳定。这可能是由于频繁的采用相同模式的制动法，导致动物自身产生了相应的适应性调节。从而导致机体对应激刺激的敏感度降低。

综上所述，限制性应激会升高大鼠空腹血糖及胰高血糖素，从而进一步加重大鼠1型糖尿病病变。

基金资助：重庆市教委科学技术研究项目基金资助课题 (KJ090316)。
作者贡献：设计为通讯作者，实施为第一、四作者，评估者为第三作者，盲法评估。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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