面向组织工程化软组织的制造技术及增材制造

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，组织工程支架的制造方法众多，特别是增材制造技术因其独特的累积成型原理，为复杂软组织支架的高精度制造提供了高效、可靠的制造技术，也推动了大缺损软组织修复研究。
目的：总结近年来关于面向软组织支架的制造方法，对其进行简要的综述，并探讨其存在的问题与前景。
方法：应用计算机检索PubMed数据库及中国知网数据库2010年1月至2013年9月关于软组织支架的制造方法的文章，英文检索词为“additive manufacturing，microfabrication，vascular tissue engineering，muscle tissue engineering，cartilage tissue engineering，stereolithography，3D printing，biodegradable hydrogel”, 中文检索词为“增材制造，微制造，血管组织工程，肌肉组织工程，软骨组织工程，光固化快速成型，三维打印技术，可降解水凝胶”。
结果与结论：软组织大块缺损支架的制造，已由简单平面结构向复杂三维转变，并考虑到软组织内部血管的作用，在制造过程中将软组织支架材料与细胞、生长因子结合，达到解决支架内部血管化的问题。增材制造技术为复杂形状的软组织活性支架的高精度制造提供了新的方法。水凝胶/细胞的构建是软组织支架的关键，而与之相关的高精度增材制造技术原理和制造工艺，以及水凝胶、细胞与生长因子的组装方法则是突破这一关键的核心技术。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 组织工程, 支架, 增材制造, 软组织, 综述, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, many manufacturing techniques have been recently developed for soft tissue engineering scaffolds. Especially additive manufacturing with a unique material accumulated forming principle can be feasible and reliable to manufacture the highly precise scaffolds with gradient structures and multi-materials for large soft tissue defect repairing.
OBJECTIVE: To summarize scaffolds manufacturing technologies in the soft tissue engineering applications developed in recent years and to predict the direction of development.
METHODS: A retrieval was performed for the literature about the manufacturing methods of soft tissue scaffolds using key words of “additive manufacturing, microfabrication, vascular tissue engineering, muscle tissue engineering, cartilage tissue engineering, stereolithography, 3D printing, biodegradable hydrogel” in English and Chinese, which were published between January 2010 and September 2013 in PubMed Database and China National Knowledge Infrastructure (CNKI) Database.
RESULTS AND CONCLUSION: For large soft tissue defects repairing, structure design of the scaffolds has been shifted from a simple planar structure to a more complex three-dimensional structure, and integration of scaffold structure, materials and cells, and growth factors during the manufacturing procedure can be used to obtain the resolution of vascularization. Additive manufacturings become one of the most promising approaches for the ideal soft tissue scaffolds with gradient and complex structure and multi-materials. In particular, the hydrogel/cell composite scaffolds fabrication, a hot but promising approach to develop the soft tissue engineering will be made progress by the accurate principles and processes of the hydrogel additive manufacturing combined with the introduction of living cells and growth factors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, tissue engineering, stents, review

中图分类号:

R318

连芩，李涤尘，陈成，张维杰，刘亚雄，贺健康，靳忠民. 面向组织工程化软组织的制造技术及增材制造[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1263-1269.

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图/表（结果） 2

2.1 软组织的需求

2.1.1 软组织的生物学要求人体软组织主要有血管、肌肉、软骨、内脏(肝胆等)组织，不同的组织具有不同的生物学要求。软组织不仅单位体积内细胞含量高，新陈代谢中营养供给和氧气、废物运输要求高，而且针对软组织本身在体内所完成的功能，需要满足一定的生物活性功能，不同的组织也具有不同的生物学要求。例如骨骼肌具有收缩性和兴奋性，接收到刺激后通过收缩牵动骨骼来实现运动功能，所以骨骼肌实现其功能就需要满足一定的力学强度要求，同时还要求在受到刺激或信号作用下会实现收缩功能；血管是血液流通的通道，在血液运输过程中，血管除满足强度外，还必须有一定的扩张性和弹性，能够承担血液流通压力^[13]。在研究不同软组织中还需要基于自身细胞的生长、增殖、分化观察其生物学特征，利用种子细胞来满足生物学要求。

组织工程软组织支架不仅要模拟实现自然软组织的功能，还需要支架本身能够达到软组织本身的生物学要求。通过移植组织工程化支架本身与周围软组织的结合，带血管的软组织要求支架还需要与周围血管结合，能够实现血管化对周围结构输送氧气和营养物质及排出代谢废物。此外，支架还需要满足细胞亲和性要求，避免免疫排斥反应，能够促进细胞在支架上的生长、增殖、分化；支架还需要具有一定的含水量及渗透率，给细胞生长提供三维空间等^[14]。

2.1.2 生物力学模型软组织根据其功能特性，需要一定的结构及其材料属性实现软组织在体内的功能。通过借助Micro-CT、核磁共振(MRI)医学影像技术扫描获得软组织的形状，经过切片、组织学染色等获得组织内部结构，获得整体的解剖学结构，再利用力学测试系统，获得软组织的力学参数，从而建立软组织的生物力学模型，根据软组织特征优化模型数据来实现支架的参数化制造。生物力学模型建立，可以从力学角度分析模型本身结构与力学的关系，可以解决其结构在加工过程中的力学问题。人体组织器官的快速建模技术，例如建立在分形理论基础上的肝脏血管树模型^[15]，结构复杂，不仅成形难度高，而且难以用于多材料结构成型的有限元功能化分析和工艺优化；肌肉组织生物力学研究尽管已经从Hill三元模型发展到磁力控制下形成细胞膜片的三维本构模型^[16]，受薄层人工组织及其组装方式的限制，还未用于软组织及其血管化的人工干预下的重建组织性能的评估与预测。

2.1.3 组织工程材料理想的组织工程支架材料具有良好的生物相容性、一定的机械性能、降解速度可调性、无毒性、孔隙率、细胞亲和性、可加工性及重复性等特征^[17]。高分子水凝胶是一种含水的具有一定机械强度的材料，具有一定的孔隙率，其多孔的内部结构能够模拟细胞生长的微环境，为细胞在支架中提供三维空间，促进细胞在类自然环境下生长、爬行、分化等^[18]。高分子水凝胶的三维网络结构和黏弹性特征与生物体内由生物大分子构成的细胞外基质环境特征具有相似的特点，使得水凝胶可以作为生物医用材料，基于水凝胶和细胞制备的组织工程血管化支架在软组织支架广泛应用^{[7, 10, 19]}。在组织工程材料的发展过程中，高分子水凝胶的出现，使得软组织器官修复在材料方面得到支持，通过有效利用水凝胶制备软组织支架来达到组织修复的目的。

2.2 制造技术

2.2.1 去细胞支架国内外在大块人工组织制造方法上，目前已形成为整体、片层、片层组装等3个层次上制造血管化支架的研究趋势。去除自然组织中的细胞，保留细胞外基质的去细胞支架^[20-22]，是典型的整体式人工组织。美国匹兹堡大学和德克萨斯大学等对受损肌肉组织的研究证明，大块肌肉组织缺损造成肌肉体积明显减小，移植的去细胞支架能够诱导宿主的肌细胞迁移和血管网形成，再生出肌肉组织，肌肉缺损修复效果见图1所示^{[3, 23]}；但在修复过程中发现，只有去细胞支架与骨髓间充质干细胞复合后移植的条件下，才能重建骨骼肌收缩功能^[23]。这也说明了在制造支架的同时，细胞因素的影响也不能忽略。

在整体人工支架与细胞复合构建人工软组织的研究中，多孔细胞质基质与转化生长因子β2，成纤维细胞生长因子2等生长因子复合，能够促进骨髓间充质干细胞的生长、黏附与分化，可促进软骨的修复^[24]。法国拉瓦尔大学Bourget等^[25]从人体中提取成纤维细胞培养，细胞培养产生细胞基质并形成组织片，组织片有表面渗透压形成自组装细胞质基质支架，再将平滑肌细胞种植在支架上来获得组织工程血管网，并通过卷曲的方式获

得三维立体带血管的三维支架。解放军北京军事医学科学院将基因改造细胞及其他细胞与胶原复合，制造出血管化人工心脏组织^[26]；哈尔滨医科大学附属第二医院使用胶原制造出心肌补片，并将人骨髓间充质干细胞与管内皮细胞生长因子种植于补片上，该支架可以改善内皮细胞的存活并促进血管网络的新生^[27]。尽管多因子封装和多细胞共培养技术可有效促进人工支架血管化的形成，但是新生血管网的随意结构很难与宿主组织的血管网对接长合，进而造成大块软组织植入血管化困难，直接影响了支架与宿主组织后期的长合及组织功能重建。

2.2.2 微制造技术组织工程支架制造方法中，静电纺丝技术提供了导向极性纤维微薄层支架^[28-31]，例如使用纺丝方法制备具有极性方向的导电纳米纤维，使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物与导电的PANi混合，纺丝获得不同浓度的纳米纤维并将成纤维细胞种植在支架上，获得组织工程肌肉支架。微制造技术提供了构建具有三维预定仿生血管网的方法。西安交通大学使用冷冻干燥法制造了琼脂糖/胶原多孔支架，通过改变温度和pH值控制支架的孔隙结构及性能，获得具有三维微孔道结构支架，其微孔道结构可以使细胞铺展^[32]。解放军医学院在体外构建预血管化的片状工程化肝组织，将生长因子、细胞与基质材料混合培养制造出片状，并植入大鼠肝脏表面，使构建物与肝脏尽快建立血液联通^[33]。哈佛医学院和剑桥大学等利用光固化掩膜法制造出具有凹槽结构的明胶凝胶/细胞，该方法目前仅制造出了一层流道结构，还难以用之制造出具有复杂血管网络的类组织器官^[34]。台湾大学Wang等^[35]使用立体光刻技术，首先在硅板上或PDMS表面光刻出设计机构做为实验模具，在硅橡胶板上涂覆一层修饰RGDS/YIGSR肽链的聚乳酸-羟基乙酸共聚物薄膜，形成了带有微管道的支架，在支架上种植小鼠C2C12细胞获得具有定向生长的肌肉支架；美国西维吉尼亚大学使用微制造方式制造圆柱微流道仿生血管管道结构，模拟流体动态仿生获得微血管流动参数模型，利用双层PDMS基板和AZ P4620光刻胶模具制造出圆柱型仿生管道，虽然在制造过程中由于升温融化光刻胶模具会导致管道表面出现孔隙，但该技术可制造出不同厚度的微流道，用以形成连续的微细血管腔和脉管网络^[36]；美国伊利诺伊大学使用微制造技术制造藻酸盐类水凝胶支架，并且在表面种植成纤维细胞，支架上的成纤维细胞能够增殖，并且出现血管内皮生长因子的表达^[37]；通过微制造技术制造微管道来形成组织工程的血管化，东京大学使用微制造技术对心肌细胞和神经元细胞共培养，在培养系统上增加电刺激实验，实现在微结构中的多细胞共培养^[38]。微制造技术通常制造单层薄片结构，多层制造工艺困难，复杂的叠加黏合工艺的层间结合能力有限，层面功能涂层对细胞生长亦有抑制作用，而且由于组织薄片机械性能差，造成微结构保型困难，组装后立体网络的结构和连续性难以保证，营养扩散受限而出现坏死。

去细胞支架能够采用自然组织的细胞基质，该支架具有良好的生物相容性，但是去细胞支架细胞质基质的机械强度不足，且去细胞的过程中一旦发生蛋白质残余，会导致免疫排斥反应，因而其应用有限；微制造技术通过制造纤维微薄层，通过卷裹、叠加等方法只能维持其三维结构，不能模拟自然组织的形状，在制造三维支架方法上仍存在技术上的不足，同时微流道制造实现血管化的工艺研究也因其结构及制造方法的限制，支架血管化的效果差。然而，近年来在生物医学应用方面发展迅速的增材制造技术，利用水凝胶可为高效制造复杂形状的仿生结构三维支架提供有效的途径。

2.3 增材制造技术增材制造技术是将预设计的复杂结构件，经过计算机技术离散化为面、线、点数据作为结构单元，在控制材料实现结构单元有序堆积、累加过程，直接加工成型为立体结构。增材制造的方法有多种，较为成熟的成型方法主要有光固化成型、熔融沉积法、选择性激光烧结法、三维打印技术、分层实体制造法等，这些方法在金属、陶瓷、复合物等材料机械加工及生物组织工程的应用中具有无可替代的优势。其中，主要应用于生物医学方面的增材制造技术包括主要有光固化成型技术、三维打印技术、熔融沉积技术等。

光固化成型、三维打印技术等增材制造技术，是应用于生物医学领域中的人工组织制造技术的重要手段^[39-42]。光固化成型、三维打印技术等增材制造技术利用CAD先对组织具体结构进行造型，然后根据其内部微小的结构造模，在常温下将种子细胞及生物活性因子加入到生物可降解材料中并进行分层制造，制造出一种类细胞质基质的微环境，这种微环境是通过增材制造出的细胞载体框架来实现的，对细胞的黏附增殖及功能化具有一定的促进作用，最终实现组织工程化支架制造及组织修复的目的。目前已发展形成了左旋聚乳酸，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，PPF/DEF等以高分子聚合物为主、多材料递变结构的制造工艺。同时，随着水凝胶、细胞和生长因子的复合技术在临床上的不断取得成功^[43-44]，基于水凝胶材料的人工组织支架增材制造正在成为新的研究热点。

西安交通大学利用自行开发的光固化成型机制造出复杂外形结构的大块聚乙二醇水凝胶支架，形成了光固化水凝胶支架的结构精度控制方法与理论^[10]。西安交通大学边卫国等^[45]使用快速成型技术制造出宏微观一体化成型的多孔生物陶瓷支架，该多孔支架便于周围组织的长入，并促进骨组织的血管化，细胞实验中兔骨髓干细胞在骨支架与软骨支架内可良好的黏附、增殖，细胞形态逐步成熟，证明以快速成型技术为基础的骨支架及软骨支架制造工艺具有良好的生物安全性。清华大学颜永年等^[46-47]提出基于离散堆积快速成形原理和溶胶/凝胶转变机制的细胞直接三维受控组装等技术，在计算机控制下，将基质材料与细胞准确的定位和运输，直接装配成型，形成具有特定空间排列的带细胞的复杂三维结构。所开发的低温沉积技术将溶液挤压到低温环境中，冷冻凝固，同时出现相分离形成微孔，随着冷冻干燥使得溶剂挥发，留下梯度孔隙结构的支架，该多孔的梯度结构有利于新生组织长入。英国谢菲尔德大学Gill和Claeyssens^[48]采用微光固化原型技术利用可降解高分子材料造出可调节物理性质的支架，并研究不同成分材料的光固化成型工艺。美因茨大学和荷兰特文特大学Seck等^[49]采用高分辨率的光固化快速成型方法，利用可降解的聚乙二醇和聚D，L-乳酸制造出三维水凝胶支架，多孔支架和非多孔支架具有较高的机械性能。二十四面体的多孔支架具有良好的孔隙连接性和机械性，该结构表现出良好的细胞亲和性，细胞在材料上能够很好黏附和分化。

在快速成型组织工程支架制造过程中，细胞与支架一体化制造成为制造的难点，要考虑到细胞与支架材料的组装、材料成胶方式及影响细胞在体外成活率的因素等问题。因此，在体外实现活细胞支架的制造，能够实现血管化的功能。目前，已有研究细胞与支架一体化制造的方法，例如伊利诺伊大学使用光固化成型方式^{[7, 9-10]}，使用的不同分子质量的聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶与细胞及生长因子混合，研究其加工工艺过程，制造出单细胞单材料三维活细胞支架和多细胞多材料的三维活细胞支架，并通过细胞的成活率等来评价支架材料及制造方法。匹兹堡大学医学院使用投影光固化成型技术采用水凝胶制造活细胞支架^[19]，将聚乙二醇双丙烯酸酯与人体脂肪干细胞及不同浓度的光引发剂混合，观察细胞生长的影响因素，该方法有效制造了大块多孔的软组织三维活细胞支架。但是三维支架对细胞的生长有一定的限制，同时针对大块软组织支架的血管化问题，也没有提出可靠的解决方法。

三维打印技术已被应用到生物制造和医学领域，2009年美国ganovo公司首次使用三维打印技术制造出人造血管^[50]，2010年澳大利亚Invetech公司和美国Organovo公司合作尝试以活体细胞为打印人体的组织和器官^[51]。美国南加利福尼亚医科大学和密歇根大学以琼脂糖为支撑，利用三维打印装置将细胞混合液滴(300-500 μm) 与其混合打印，制造出管径<3 mm的血管分支网^[52]。哈佛大学医学院制造了可用于复合细胞的胶原水凝胶逐层打印设备，其制造支架见图2所示^[53]。该设备制造主要问题是受限于胶原水凝胶成胶速度缓慢，导致水凝胶制造时间过长，从而影响水凝胶内部细胞的活性，因而难以满足人工软组织需求。宾夕法尼亚大学和麻省理工大学等利用牺牲材料的方法制造血管支架^[54]。首先利用三维打印机打印出多糖的管状网络结构作为消失模，在消失模外层涂覆一层聚乳酸-羟基乙酸共聚物，防止多糖管状网络溶解时液体渗透到外部影响外部基质环境。将制造好的多糖管状网络放入模具，把包埋细胞的水凝胶或高分子材料倒入模具中，材料固化，从而完成细胞和多糖管状网络在生物材料中的包埋，然后溶解排出多糖网络，最终实现带有血管结构的活细胞三维支架。增材制造能够实现宏微观结构成形，与其他制造方法结合能够更大程度上满足软组织支架的制造要求。

然而目前水凝胶与细胞复合增材制造的成形机制论仍存在不足，例如对三维打印技术，成型精度的首要影响因素是细胞液滴的黏弹性和表面张力^[40]。其次是支架材料的应用研究亟待进行。目前使用的琼脂糖、胶原等水凝胶强度不高，在短期内新生细胞外基质难以维持人工组织结构。而近年来用于开发抗撕裂、高细胞量人工软组织的高强度水凝胶的发展^[55-59]，如双网络水凝胶^[60]，如果能利用其光固化成型特性，使其制造方式与高精度成型的光固化原型技术结合，将解决微制造技术

中叠层困难和强度不足的问题，形成连续的空间血管网；或者使用带磁性的水凝胶，通过磁性材料来解决强度问题，促进细胞在水凝胶中的生长过程，从而实现大块软组织三维活细胞支架构建；但是，目前其相关的成型原理和结构精度研究几乎仍是空白。综上所述，光固化增材制造和三维打印技术具有结合功能化结构设计和多细胞/多材料复合制造的优势。发展高强度、高细胞量水凝胶的精确成型光固化增材制造技术及三维打印技术，正在成为人工组织支架制造及其血管化制造的重要手段和研究热点。

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引言

目前中国对捐献人体器官的需求比例高达150∶1，即150例患者等待一位捐赠者的器官，远高于世界卫生组织20∶1的统计比例^[1]，因此，依赖人体组织器官捐献进行器官移植替换已经不能满足临床医疗的需求。美国食品与药品管理局指出当前人工组织与器官的潜在市场高达4 000亿美元，正在形成向新兴产业发展态势，并推动着移植技术和再生医学的发展。以支架、细胞、生长因子为体系构建的组织工程，是再生医学研究的重要研究内容，但支架却因结构复杂成为研究难点。增材制造技术能够快速而精确地制造出任何复杂形状结构件，为传统方法难以完成的支架制造提供了新的手段，由此也形成了新的交叉研究方向“生物制造”^[2-3]。

现代医学已经能够完成几乎全部的人体组织与器官替换移植，如肌肉、血管、皮肤、肝脏等各种器官等软组织和骨头等硬组织。但无论是使用人体自然还是组织工程化组织器官，针对大块组织器官移植，血管化成为移植能否成功的关键，即移植组织内部是否拥有与宿主血管系统对接吻合并遍布整个组织、畅通的血管网^[4]。这是由于四通八达的血管网是人体维持新陈代谢的主要方式，通过全身血液循环，完成氧气、营养物质的供给和代谢废物的排出，例如氧扩散距离约为150 μm，如果仅依赖扩散作用，远离血管超过200 μm的细胞则难以存活。特别是大块软组织内部存在的大密度细胞，不仅要求其内部具有灌注血液的连通脉管系统，还需要推动血液流动的作用力，例如来自心脏(心肌)和动脉(平滑肌)的肌肉收缩，而平滑肌只存在于成熟血管的管壁膜，因此血管化的大块软组织必然是带血管的软组织系统。

文章面向组织工程化软组织，总结目前现有的软组织制造方法。细胞片技术和去细胞支架技术的发展，分别从细胞和支架的角度提供了再造功能性带血管软组织支架的基本条件。微制造技术提供了在薄片组织内预先制造连续微细血管网的方法^[5-6]，但层间结合和薄层微结构保型困难，使得多层叠加黏合形成大块软组织支架的工艺复杂且微观结构连续性差。光固化快速成型技术和三维打印等增材制造技术^[7-12]，借助其精细结构快速制造的优势，结合图像、CAD/CAE功能化仿生结构设计和水凝胶/细胞复合工艺，正在为血管化大块软组织研究提供新的制造手段，相关的精确成型原理和装备亟待研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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