Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.39.001

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (39): 6861-6866.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.39.001

• 骨与关节损伤基础实验 basic experiments of bone and joint injury • 下一篇

Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞

李树文¹，武海军²，银和平¹，白明¹，杜志才¹

¹内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；²内蒙古自治区呼和浩特市第一医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010020

出版日期:2013-09-24 发布日期:2013-09-24
通讯作者: 银和平，硕士，教授，主任医师，硕士生导师，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030 nmgyhp0471@126.com
作者简介:李树文★，男，1974年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事脊柱外科的研究。 lswlsw1974@163.com
基金资助:
内蒙古自治区教育厅高等学校科学研究基金项目资助(NJZY13423)*

Isolation and culture of rabbit nucleus pulposus cells in vitro by type Ⅱ collagenase digestion methods plus explant culture method

Li Shu-wen¹, Wu Hai-jun², Yin He-ping¹, Bai Ming¹, Du Zhi-cai¹

¹The Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Hohhot First Hospital, Hohhot 010020, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Online:2013-09-24 Published:2013-09-24
Contact: Yin He-ping, Master, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China nmgyhp0471@126.com
About author:Li Shu-wen★, Master, Associate chief physician, the Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China lswlsw1974@163.com
Supported by:
Science Foundation+ of Universities by Education Ministry of Inner Mongolia Autonomous Region, No. NJZY13423*

摘要/Abstract

摘要：

背景：椎间盘为负重却缺乏血运的组织，在体外培养过程中存在表型丢失问题，因而容易发生退行性改变，但椎间盘退变的机制尚不明确。
目的：探讨兔髓核细胞分离、贴壁培养、扩增和鉴定的方法，并观察髓核细胞在不同代次的生长特性。
方法：应用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合的方法，分离、纯化髓核细胞并进行体外扩增，用倒置显微镜观察各代细胞的形态、生长状况，计数细胞数量，并绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红染色后光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学方法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达情况，并进行细胞鉴定。
结果与结论：成功的实现了兔髓核细胞体外分离、培养及扩增。生长特性观察发现，髓核细胞第1-3代细胞增殖能力强，活力旺盛，但随着传代次数的增加，细胞增殖能力程逐渐下降的趋势。分离培养的髓核细胞阳性表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。体外采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合，可获得高纯度的髓核细胞，培养的髓核细胞呈类圆形或多角形生长，第1-3代细胞生长活性较强。

关键词: 骨关节植入物, 骨关节损伤基础实验, 髓核细胞, Ⅱ型胶原酶消化法, 组织块贴壁法, Ⅱ型胶原, 聚集蛋白聚糖, 体外培养, 细胞增殖, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Intervertebral disc can bear load but lack vessels. Nucleus pulposus cells have the problem of phenotype loss during in vitro culture that can lead to degenerative changes. The mechanism of intervertebral disc degeneration remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the approaches of isolation, adherence culture, amplification and identification of the rabbit nucleus pulposus cells in vitro, to observe the growth characteristics of nucleus pulposus cells in different generations.
METHODS: Type Ⅱ collagenase digestion method plus explants culture method was used to isolate and purify nucleus pulposus cells and then amplify in vitro. The morphology and growth of primary and passaged cells was observed under the inverted microscope, the number of cells was counted and the growth curve was draw. The morphology of the cells was observed under light microscope after hematoxylin-eosin staining, and the expressions of collagen type Ⅱ and aggrecan were examined by immunocytochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: Nucleus pulposus cells of rabbit were isolated, cultured and amplified in vitro successfully. Growth activity was observed, and found that the 1-3 generation nucleus pulposus cells proliferated more rapidly and vigorously. The proliferation of nucleus pulposus cells was decreased while the cell passaged more generations. These isolated and cultured nucleus pulposus cells could positively express the collagen type Ⅱ and aggrecan. In vitro combination of type Ⅱ collagenase digestion method and explants culture method could obtain high purity nucleus pulposus cells, and the cultured nucleus pulposus cells were grew in round or polygonal. The 1-3 generation of cells had strong activity.

Key words: collagen type Ⅱ, microbial collagenase, cells, cultured, proteoglycans

中图分类号:

R318

李树文，武海军，银和平，白明，杜志才. Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(39): 6861-6866.

Li Shu-wen, Wu Hai-jun, Yin He-ping, Bai Ming, Du Zhi-cai. Isolation and culture of rabbit nucleus pulposus cells in vitro by type Ⅱ collagenase digestion methods plus explant culture method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(39): 6861-6866.

图/表（结果） 6

2.1 髓核细胞的分离培养结果 经D-PBS反复冲洗髓核组织呈白色或淡红色。剪成1 mm×1 mm×1 mm的小组织碎块，小组织碎块置于0.25 g/LⅡ型胶原酶37 ℃摇床消化40 min，然后离心后取沉淀组织，均匀地接种于25 cm²培养瓶中，成功的分离髓核细胞。未贴壁的髓核细胞呈圆形，见图1。

2.2 髓核细胞的形态特征 最初消化的髓核细胞需7 d左右时间贴壁，刚贴壁后细胞呈圆形、短梭形、多边形，胞质向外突出，且突出逐渐延伸。10-14 d后80%-90%的细胞融合成细胞团，形状呈火焰状或漩涡状，胞质较多，折光性好，细胞核呈卵圆形、较大，轮廓清楚，可见多个核仁，见图2。

经过传代后的细胞贴壁时间明显缩短，一般24 h左右大部分细胞已贴壁，形态与原代细胞相似，有明显的伪足，有的细胞出现细长或者树根样足突，但大部分细胞呈现短梭形。梭形细胞的突起数量，明显低于类圆形和多角形细胞，并且只有初级突起。髓核细胞传到第4代后，大部分向梭形转化，同时细胞突起变长，胞质含量减少，折光性消失，见图3。

2.3 髓核细胞的生长曲线 通过对第1-5代髓核细胞计数，绘制出髓核细胞的生长曲线呈S形，见图4。传代第1-2天时髓核细胞生长缓慢是细胞的生长滞缓期，到第3-6天时细胞增殖迅速进入快速增长期，从第7天开始细胞进入平台期。随着髓核细胞传代次数的增加，其增殖能逐渐减弱。第1-3代细胞增殖能力最强，到第4代细胞其增殖能力显著减退。

2.4 髓核细胞的鉴定结果 髓核细胞的苏木精-伊红染色结果显示，髓核细胞中央，核蓝染，胞浆呈现淡桃红色，P0代髓核细胞呈类圆形和多角形。P3代髓核细胞呈明显的梭形和多角型，大多以2-4个角为主，P0代髓核细胞呈标准集落样生长，传代后的细胞呈均匀分布的生长，见图5。

甲苯胺蓝染色结果显示，髓核细胞胞质内染色后呈天蓝色，越靠近髓核细胞细胞核聚集蛋白聚糖被染色越深，见图6。

免疫细胞化学染色结果显示，髓核细胞胞质内染色后呈黄褐色，离细胞核越近，Ⅱ型胶原染色越深，见图7。

95%的P0-P1代髓核细胞胞质内表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，保持着类软骨细胞的特性。P0代髓核细胞与P3代髓核细胞聚集蛋白聚糖A值和Ⅱ型胶原A值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，P0、P3代髓核细胞与P4代髓核细胞聚集蛋白聚糖A值和Ⅱ型胶原A值比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞对比观察性实验。

时间及地点：于2012至2013年在内蒙古医科大学分子病理学实验室完成。

材料：

实验动物：3月龄新西兰大白兔3只，由内蒙古农业大学实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

实验方法：

髓核细胞取材：取新西兰大耳白兔，用空气栓塞法处死后，体积分数为70%乙醇浸泡 3 min，常规铺单，从后背沿正中线剪开皮肤，分离、剥开椎旁肌肉，把兔脊柱取出，仔细剥离椎体周围所附着的肌肉及软组织，用D-PBS反复清洗后浸泡5 min，尖刀轻轻切开椎间盘的纤维环，显露出髓核组织，用眼科镊小心夹取胶冻样的髓核组织，放入装有D-PBS的无菌培养皿中。

髓核细胞的分离、培养：无菌环境下，D-PBS反复冲洗标本除去红细胞，用眼科镊及组织剪去除残留的纤维环和终板，将髓核组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的小碎块。小组织碎块置于0.25 g/L Ⅱ型胶原酶的DMEM-LG消化液中，放到37 ℃摇床上消化 40 min后，置于半径10 cm的离心机中 2 000 r/min离心5 min，弃上清，取组织块沉淀均匀接种于25 cm²培养瓶中，加入4 mL LG-DMEM完全培养基(含体积分数20%胎牛血清，LG-DMEM液，青霉素100 mg/L，链霉素100 mg/L)，置于37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度培养箱内培养。细胞在7 d后首次换液，以后每3 d换液1次。倒置相差显微镜下观察原代细胞形态，记录融合至90%的时间，待细胞融合90%后以2.5 g/L胰蛋白酶(含体积分数0.02%EDTA)消化传代，取每代细胞放置装有盖玻片的6孔培养板中培养进行细胞爬片。

绘制髓核细胞的生长曲线：取第1-5代髓核细胞用 2.5 g/L胰蛋白酶消化后加入LG-DMEM细胞培养液，调整细胞浓度至1.0×10⁸ L^-¹，分别在5个24孔培养板里培养，对每个培养板作相应的标记，每孔加细胞悬液0.5 mL。每天从各培养板消化3孔细胞，混匀成细胞悬液，用计算机细胞计数器对细胞悬液计数，并得出均值，以观察时间做为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制髓核细胞生长曲线。

髓核细胞的鉴定：

髓核细胞形态学观察：倒置显微镜下，每日观察髓核细胞的生长、增殖状况和形态特征，并拍片记录。

髓核细胞爬片行常规苏木精-伊红染色法：髓核细胞爬片后D-PBS冲洗5 min×3次。冷丙酮固定15- 20 min，苏木精浸染10 min，体积分数1%盐酸乙醇分化60 s，体积分数0.1%伊红乙醇染色60 s，PBS清洗5 min×3次。体积分数95%乙醇分色至胞浆呈桃红色。中性树胶封固后光学显微镜下观察、拍照。

髓核细胞爬片行甲苯胺蓝染色：细胞爬片后PBS清洗5 min×3次，冷丙酮固定15-20 min，1%的甲苯胺蓝浸染2.0-3.0 h后，乙醇洗去剩余的染液，中性树胶封固后，光镜下观察、拍照，计算机图像分析测定吸光度值(A值)。

髓核细胞爬片免疫组织化学检测Ⅱ型胶原：细胞爬片后PBS清洗5 min×3次，冷丙酮固定15-20 min，加体积分数3%H₂O₂ 7 ℃孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗5 min×3次，滴加Ⅱ型胶原一抗，37 ℃孵育2 h，PBS清洗5 min×3次，滴加辣根过氧物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗5 min×3次，DAB显色 15 min，PBS清洗5 min×3次，苏木精复染1 min，体积分数1%盐酸乙醇分化60 s，中性树脂封固后，光镜下观察、拍照，计算机图像分析测定吸光度值(A值)。

主要观察指标：分离培养与观察髓核细胞大体形态学的变化及髓核细胞中Ⅱ型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖表达的变化。

统计学分析：利用SPSS 13.0统计软件包统计分析，计量资料以x(_)±s表示，采用方差分析进行均数比较，并进行组间比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘内髓核组织由髓核细胞和细胞外基质两大部分组成。细胞外基质的组成成分主要是聚集蛋白聚糖与胶原蛋白，胶原蛋白主要是Ⅱ型胶原白^[8] 。导致椎间盘退变性改变的主要原因复杂，目前认为椎间盘在长时间的超负荷压力、或某种原因的刺激下，其中的髓核细胞数量明显减少正，继之常的基质成分Ⅱ型胶原、蛋白聚糖等发生降解，最终导致椎间盘中组成成分动态平衡的失调^[9-10] 。因此，研究椎间盘退变性疾病首先应从研究髓核细胞开始入手。近年来，组织工程技术发展迅猛，许多研究试图将髓核细胞作为种子细胞来修复退变的椎间盘^[11] 。髓核细胞的体外分离、培养是这一研究的基础，但该细胞分离培养困难。
目前实验研究获取髓核细胞大多采用酶消化法，此方法在消化过程中耗时长，操作繁琐，且会浪费掉未从髓核组织中消化出的细胞导致髓核细胞原代培养周期漫长。有实验研究证明原代髓核细胞培养融合至90%一般需10-20 d^[12-14] 。组织块直接培养法分离、培养简单，未用胶原酶对组织进行消化，虽然对细胞造成损伤较小，但是因胶原酶未对组织进行消化，难以从髓核组织中获得较高纯度的髓核细胞，培养成功率较低，所以很少被用来分离、培养髓核细胞。实验采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合分离、培养获得髓核细胞，使髓核细胞能更好、更快的贴壁生长，最大程度的保留了髓核组织中髓核细胞的数量，同时对髓核组织的消化时间缩短至30-40 min，与传统的消化时间4-6 h相比显著减少，降低了因长时间消化髓核组织对髓核细胞造成的损伤，保证了髓核细胞的活力。而传统的单纯酶消化法分离、培养髓核细胞，因胶原酶长时间的消化对髓核细胞会造成一定的毒性损害，失败率较高；同时培养周期太长，容易造成污染。因此Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合分离、培养髓核细胞是分离、培养椎间盘髓核细胞的理想方法。此方法不仅使原代髓核细胞培养时间大大缩短而且很好的保持了髓核细胞的生物学特性。
实验培养得到的髓核细胞贴壁后形态各异，有明显的伪足，偶有出现细长或者树根样的足突，同时还发现髓核细胞的贴壁速度缓慢，2 d后才刚有少量贴壁的细胞，5- 7 d甚至需要更多的时间大部分细胞才会贴壁，细胞分裂、增殖极为缓慢，生长周期较长，呈集落样生长。原代髓核细胞经传代培养后生长速度明显加快，有研究者认为是由于细胞自身分泌物限制了细胞的生长，经胰蛋白酶消化后，清楚了细胞周围的分泌物，保证了髓核细胞在适宜的环境中生长^[15] 。同大部分软骨样细胞相似，体外分离、培养的髓核细胞随着传代次数的增加，髓核细胞发生着显著的退变，即在传代培养的过程中出现表型的缺失，主要表现为Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖等表达的下降，逐渐从类软骨细胞转化为类纤维样细胞^[16-17] 。倒置显微镜和苏木精-伊红染色观察发现髓核细胞从第4代开始退变，细胞从星形、多角形退变为纤维细胞样的梭形，免疫细胞化学证实聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成显著降低，证明髓核细胞已经开始向成纤维细胞转化。
实验结果证明，贴壁生长的细胞可分为3个时期：潜伏期、对数生长期和停滞期。实验观察第1-5代髓核细胞发现潜伏期在一两天，潜伏期细胞生长缓慢，细胞形态、数量和生长状况无明显变化。第3-6天是对数生长期，该期是髓核细胞活力最旺盛的时期，细胞形态快速变大，数量迅速增加，是被用来进行实验研究的最好时段。7 d后细胞增殖达到最大速度即进入生长平台期。观察第1-5代髓核细胞的生长特性结合髓核细胞的生长曲线证实第1-3代髓核细胞增殖能力最强，从第四五代髓核细胞增殖能力及活性明显下降。Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合分离、培养髓核细胞是一种高效、实用的培养方法，具有操作简便、消化耗时短、细胞活性好、在较短的时间内可获得大量髓核细胞等优点，经传代后的髓核细胞贴壁、生长速度均显著加快，且第1-3代髓核细胞在增殖速度加快的同时，仍很好的保持着类软骨表型不变，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达能力并未减弱；从第3代髓核细胞开始发生退变，向成纤维细胞转化。因此，通过Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合分离、培养的第1-3代髓核细胞可被组织工程用来作为细胞移植治疗或体外研究椎间盘退变性疾病的理想细胞。

Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞

Isolation and culture of rabbit nucleus pulposus cells in vitro by type Ⅱ collagenase digestion methods plus explant culture method

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