m6A相关基因在激素性股骨头坏死中的生物信息学分析

doi:10.12307/2024.698

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (36): 5811-5816.doi: 10.12307/2024.698

• 植入物相关大数据分析 Implant related big data analysis • 上一篇下一篇

m6A相关基因在激素性股骨头坏死中的生物信息学分析

令狐熙涛1，桂佳琦2，梁卓智2，瓦庆德1，黄帅2

1遵义医科大学第二附属医院骨外科，贵州省遵义市 563000；2广州医科大学附属第二医院骨科，广东省广州市 510260

收稿日期:2023-10-23 接受日期:2023-12-04 出版日期:2024-12-28 发布日期:2024-02-27
通讯作者: 黄帅，博士，副主任医师，副教授，博士生导师，广州医科大学附属第二医院骨科，广东省广州市 510260
作者简介:令狐熙涛，男，1995年生，贵州省遵义市人，汉族，2021年遵义医科大学毕业，硕士，医师，主要从事骨软组织修复及骨转移瘤发病机制研究。
基金资助:
广州市科技计划项目(2023A03J0405)，项目负责人：黄帅；贵州省科技计划项目(黔科合基础一ZK[2021]重点007)，项目负责人：瓦庆德

Bioinformatics analysis of m6A-associated genes in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

Linghu Xitao1, Gui Jiaqi2, Liang Zhuozhi2, Wa Qingde1, Huang Shuai2

1Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China

Received:2023-10-23 Accepted:2023-12-04 Online:2024-12-28 Published:2024-02-27
Contact: Huang Shuai, PhD, Associate chief physician, Associate professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, Guangdong Province, China
About author:Linghu Xitao, Master, Physician, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
Guangzhou Science and Technology Planning Project, No. 2023A03J0405 (to HS); a Project of Guizhou Science and Technology Plan, No. Qian Kehe Foundation-ZK[2021] 007 (to WQD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

激素性股骨头坏死：是一类因长期或过量服用激素类药物后导致骨质减少及股骨头塌陷的疾病，激素性股骨头坏死患者的临床表现主要为髋关节疼痛及功能障碍。
m6A：是指在N6-腺嘌呤位点上发生的甲基化修饰，在调控干细胞成骨分化、内皮细胞血管分化、成骨细胞与破骨细胞稳态中具有重要作用。

背景：m6A修饰与股骨头坏死的发生发展相关，但在激素性股骨头坏死中的作用尚不清楚。

目的：基于GEO数据库，采用生物信息学方法分析激素性股骨头坏死中表达差异的m6A基因及互作miRNAs，探寻其潜在发病机制。
方法：在GEO数据库中检索并下载与激素性股骨头坏死相关的mRNA表达谱数据集(GSE123568)，通过R软件对数据集进行差异基因筛选及GO功能、KEGG通路富集分析。识别差异基因中的m6A差异表达基因(m6A-DEGs)并对其进行GO功能与KEGG通路富集分析，比较m6A-DEGs的表达量并分析它们之间的相关性。最后通过Cytoscape构建m6A-DEGs的PPI互作网络及筛选核心基因。使用TargetScan，miRTarBase和miRBD数据库预测m6A-DEGs相关的潜在miRNAs，同时使用ChIPBase及hTFtarget数据库预测7个核心基因潜在转录因子，然后分别构建m6A-miRNA与转录因子m6A调控网络。最后使用数据集GSE74089验证7个核心m6A-DEGs的表达水平。

结果与结论：①从数据集中共筛选出2 460个差异表达的基因，其中1 455个上调，1 005个下调。②从数据集中筛选出了14个m6A-DEGs，包括3个下调和11个上调基因，m6A-DEGs在激素性股骨头坏死中的表达具有显著差异(P < 0.05)，Spearman分析表明它们之间具有一定相关性。③m6A-DEGs的GO和KEGG富集分析主要集中在骨髓细胞分化与发育、免疫受体与细胞因子受体活性、破骨细胞分化、AMPK与白细胞介素17信号通路。④m6A-DEGs前7个核心基因包括YTHDF3，YTHDF1，YTHDF2，ALKBH5，METTL3，HNRNPA2B1及HNRNPC，它们在miRTarBase，miRDB和TargetScan数据库中共有44个miRNA重叠，在ChIPBase及hTFtarget数据库中共有79个重叠转录因子。⑤在GSE74089数据集中有6个核心m6A-DEGs的表达水平与GSE123568数据集一致。⑥结果证实，根据生物信息学方法筛选的7个m6A-DEGs可能通过调控多个miRNA、转录因子和AMPK及白细胞介素17信号通路表达，进而影响激素性股骨头坏死中骨髓细胞分化发育与破骨细胞分化，为进一步深入研究激素性股骨头坏死的发病机制和靶向治疗提供了数据支持和研究方向。

https://orcid.org/0000-0003-2588-5506 (令狐熙涛)；https://orcid.org/0000-0001-8308-4710 (黄帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, m6A甲基化, 微小RNA, 转录因子, 生物信息学, 差异基因, 基因调控网络, 核心基因

Abstract: BACKGROUND: m6A modification has been confirmed to play an important role in the occurrence and development of osteonecrosis of the femoral head; however, the role of m6A modification patterns in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head remains unknown.
OBJECTIVE: Bioinformatics analysis was performed based on the Gene Expression Omnibus (GEO) database to analyze the differential expression of the m6A gene in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, predict the downstream targeted miRNAs, and investigate the potential pathogenesis.
METHODS: Expressing profiles of mRNA data of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were downloaded from GEO database (GSE123568). Differentially expressed genes (DEGs), Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed using the R software. After obtaining these differentially methylated m6A genes (m6A-DEGs), we analyzed GO function and KEGG pathway enrichment and compared the correlation among the m6A-DEGs typing according to gene expression. The protein-protein interaction network and core gene subnetwork of m6A-DEGs were constructed using Cytoscape software. The m6A-DEGs-associated potential miRNAs were predicted using the TargetScan, miRTarBase, and miRBD databases. Simultaneously, ChIPBase and hTFtarget databases were used to predict potential transcription factors of seven core genes, then m6A-miRNA and transcription factor-m6A regulatory networks were constructed separately. Finally, the expression levels of the seven core m6A-DEGs were verified by using the GSE74089 dataset.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 2 460 common DEGs were screened out from datasets, among which 1 455 genes were upregulated and 1 005 genes were downregulated. (2) A total of 14 m6A-DEGs were identified in the datasets. Among them, 11 m6A-DEGs were up-regulated and 3 m6A-DEGs were down-regulated. Differential gene expression was considered significant for m6A-DEGs in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (P < 0.05). Spearman correlation analysis showed a significant correlation between m6A-DEGs. (3) GO and KEGG enrichment analysis showed that m6A-DEGs were mainly enriched in myeloid cell differentiation and development, immune and cytokine receptor activity, osteoclast differentiation, AMPK signaling pathway and interleukin-17 signaling pathway. (4) The seven core genes of m6A-DEGs contained YTHDF3, YTHDF1, YTHDF2, ALKBH5, METTL3, HNRNPA2B1, and HNRNPC. A total of 44 miRNAs overlapping were detected in the miRTarBase, miRDB, and TargetScan databases. Totally 79 transcription factors overlapping were found in the ChIPBase and hTFtarget databases. (5) The expression levels of six core m6A-DEGs in the GSE74089 dataset were consistent with those in the GSE123568 dataset. (6) These findings confirm that the seven m6A-DEGs identified through bioinformatics techniques play a regulatory role in the expression of various miRNAs, transcription factors, AMPK, and interleukin-17 signaling pathways, and these genes have a significant impact on the differentiation and development of bone marrow cells as well as osteoclast differentiation in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. Consequently, these findings offer data support and establish a research direction for future investigations into the pathogenesis and targeted therapeutic strategies for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.

Key words: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, m6A methylation, microRNA, transcription factor, bioinformatics, differentially expressed gene, gene regulatory network, core gene

中图分类号:

令狐熙涛, 桂佳琦, 梁卓智, 瓦庆德, 黄帅. m6A相关基因在激素性股骨头坏死中的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(36): 5811-5816.

Linghu Xitao, Gui Jiaqi, Liang Zhuozhi, Wa Qingde, Huang Shuai. Bioinformatics analysis of m6A-associated genes in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(36): 5811-5816.

图/表（结果） 9

2.1 激素性股骨头坏死中DEGs分析结果 GEO数据库下载的30例激素性股骨头坏死患者和10例非激素性股骨头坏死患者样本的mRNA表达数据中共筛选出2 460个DEGs，其中1 455个上调，1 005个下调。DEGs的热图及火山图结果见图1A，B。DEGs中有14个基因与m6A相关基因共表达，见图1C。

2.2 DEGs的GO功能富集及KEGG通路富集分析结果对差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果进行筛选，富集结果中BP，CC，MF及KEGG通路分别有307，44，18，15条。其中BP主要富集在细胞因子产生的正向调节、骨髓细胞分化、髓细胞发育、活性氧代谢过程、骨髓细胞稳态等条目，CC主要富集在分泌颗粒膜、特定颗粒、富含ficolin-1的颗粒、内吞囊泡、细胞质囊泡腔、富含ficolin-1的颗粒管腔等条目，MF主要富集在免疫受体活性、细胞因子受体活性、C-C趋化因子受体活性、氧化还原酶活性、趋化因子受体及趋化因子结合等条目，见图2A，B。KEGG通路富集结果显示，DEGs主要与破骨细胞分化(P < 0.001)、趋化因子信号通路(P < 0.001)及核转录因子κB信号通路(P < 0.05)等有关。

2.3 激素性股骨头坏死中m6A-DEGs的分析结果从激素性股骨头坏死表达谱数据中提取了14个共表达m6A基因的表达谱数据并统计分析，结果显示14个基因的表达较对照组具有显著性意义，见图3A，B，其中METTL3，RBM15，RBM15B，YTHDF2，HNRNPC，HNRNPA2B1，IGFBP2，ELAVL1的P < 0.05，FMR1，YTHDF3，YTHDF1及CBLL1的P < 0.01，YTHDC2及ALKBH5的P < 0.001，见表2。

2.4 m6A-DEGs基因相关性及GO/KEGG通路富集分析结果对上述14个激素性股骨头坏死中表达差异的m6A-DEGs进行了Spearman相关性分析，结果显示14个m6A-DEGs存在一定的相关性，其中正相关性最高的是YTHDC2与HNRNPA2B1 (Cor=0.929)，负相关性最高的是HNRNPC与ALKBH5(Cor=-0.672)，见图4A。此外，对14个m6A-DEGs基因进行了GO/KEGG通路富集分析，共富集到生物学过程245个条目、细胞组分17个条目、分子功能41个条目和KEGG 通路10个条目。GO分析结果中BP主要包括了mRNA代谢过程的调控、mRNA稳定性调控、RNA稳定性调节、骨髓细胞分化、骨髓细胞发育，CC主要包括了分泌颗粒膜、特殊颗粒、富含ficolin-1的颗粒，MF主要包括了模式识别受体活性剂、免疫受体活性、细胞因子受体活性，KEGG包括了IL-17信号通路、AMPK信号通路等，结果见图4B，C及表3。

2.5 m6A-DEGs基因PPI网络及TF-m6A-miRNA预测分析结果将14个m6A-DEGs基因导入在线工具STRING中，根据score分数> 0.04进行筛选，将在线结果导入Cytoscape软件中绘制PPI 网络图，该网络图包括14个节点和85条交互关系，见图5A。使用Degree算法筛选出连接关系前7个基因作为核心基因：YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，ALKBH5，HNRNPA2B1，HNRNPC及METTL3(Degree度值均为13)，见图5B。利用miRTarBase，miRDB，TargetScan数据库预测7个核心基因潜在的miRNA并作交集分析，在3个数据库中共筛选出44个miRNA，交集基因可视化结果见图5C。利用ChIPBase及hTFtarget数据库预测7个核心基因潜在转录因子并作交集分析，共筛选出79个TF，交集结果可视化结果见图5D。

2.6 核心m6A-DEGs基因互作蛋白分析结果使用GENEMANIA数据库构建了激素性股骨头坏死中与核心m6A-DEGs基因相互作用的潜在蛋白质作用网络，互相蛋白中发现了如WTAP，METTL4等其他m6A基因外，还发现了ZC3H7A，RIDA，RALYL，NSUN2，MTMR7，MFGE8，EIF3J，DGCR8和ALKBH8等基因，见图6A。互作蛋白富集分析发现主要与RNA修饰、信使核糖核酸稳定性调节、信使核糖核酸分解代谢过程正调控、RNA稳定性调节有关，见图6B。

2.7 m6A-DEGs在外部数据集中的表达验证结果为了验证实验筛选出的7个核心m6A-DEGs基因表达的准确性，从股骨头坏死数据集GSE74089中提取了7个核心m6A-DEGs的表达数据并构建了箱线图，结果表明GSE74089样本中YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，HNRNPA2B1，HNRNPC及METTL3的表达量与GSE123568表达量一致，均较正常对照组明显升高(P < 0.05)，而GSE74089样本中ALKBH5的表达量较对照组没有差异，结果如图7所示。

参考文献

[1] FUKUSHIMA W, FUJIOKA M, KUBO T, et al. Nationwide epidemiologic survey of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. Clin Orthop Relat Res. 2010;468(10): 2715-2724.
[2] GUERADO E, CASO E. The physiopathology of avascular necrosis of the femoral head: an update. Injury. 2016;47 Suppl 6:S16-S26.
[3] YUE J, YU H, LIU P, et al. Preliminary study of icariin indicating prevention of steroid-induced osteonecrosis of femoral head by regulating abnormal expression of miRNA-335 and protecting the functions of bone microvascular endothelial cells in rats. Gene. 2021;766:145128.
[4] HUANG C, WEN Z, NIU J, et al. Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head: novel insight into the roles of bone endothelial cells in pathogenesis and treatment. Front Cell Dev Biol. 2021;9:777697.
[5] GUAN Q, LIN H, MIAO L, et al. Functions, mechanisms, and therapeutic implications of METTL14 in human cancer. J Hematol Oncol. 2022;15(1):13.
[6] 陈伟坚,张罡瑜,林天烨,等.RNA m6A甲基化修饰参与及调控骨科相关疾病[J].中国组织工程研究,2021,25(26):4236-4242.
[7] XU Y, YE S, ZHANG N, et al. The FTO/miR-181b-3p/ARL5B signaling pathway regulates cell migration and invasion in breast cancer. Cancer Commun (Lond). 2020;40(10):484-500.
[8] CHENG C, ZHANG H, ZHENG J, et al. METTL14 benefits the mesenchymal stem cells in patients with steroid-associated osteonecrosis of the femoral head by regulating the m6A level of PTPN6. Aging (Albany NY). 2021;13(24):25903-25919.
[9] WANG Y, ZHANG Y, LU H, et al. Integrative analysis of cellular autophagy-related genes in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. Am J Transl Res. 2023; 15(9):5850-5872.
[10] CHAI JL, LU BW, DU HT, et al. Pyroptosis-related potential diagnostic biomarkers in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. BMC Musculoskelet Disord. 2023;24(1):609.
[11] LU H, FAN Y, YAN Q, et al. Identification and validation of ferroptosis-related biomarkers in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. Int Immunopharmacol. 2023;124(Pt A):110906.
[12] ZHOU R, PARK JW, CHUN RF, et al. Concerted effects of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 to control vitamin D-directed gene transcription and RNA splicing in human bone cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(2):606-618.
[13] WEN JR, TAN Z, LIN WM, et al. Role of m (6)A Reader YTHDC2 in differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2021;52(3):402-408.
[14] BAI J, ZHANG W, ZHOU C, et al. MFG-E8 promotes osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells through GSK3beta/beta-catenin signaling pathway. FASEB J. 2023;37(6):e22950.
[15] CHOI YJ, JEONG S, YOON KA, et al. Deficiency of DGCR8 increases bone formation through downregulation of miR-22 expression. Bone. 2017;103:287-294.
[16] 恽波,周灵杰,凡进,等.GIT1通过Notch信号通路促进骨髓细胞向破骨细胞分化[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2016,36(9):1036-1040.
[17] JIANG Y, ZHANG Y, CHEN W, et al. Correction to: achyranthes bidentata extract exerts osteoprotective effects on steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in rats by regulating RANKL/RANK/OPG signaling. J Transl Med. 2021;19(1):208.
[18] LIU Y, SHAN H, ZONG Y, et al. IKKe in osteoclast inhibits the progression of methylprednisolone-induced osteonecrosis. Int J Biol Sci. 2021;17(5):1353-1360.
[19] WANG N, WANG L, YANG J, et al. Quercetin promotes osteogenic differentiation and antioxidant responses of mouse bone mesenchymal stem cells through activation of the AMPK/SIRT1 signaling pathway. Phytother Res. 2021. doi:10.1002/ptr.7010.LA.
[20] JIANG T, XIA C, CHEN X, et al. Melatonin promotes the BMP9-induced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by activating the AMPK/beta-catenin signalling pathway. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):408.
[21] KIM HJ, SEO SJ, KIM JY, et al. IL-17 promotes osteoblast differentiation, bone regeneration, and remodeling in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2020;524(4): 1044-1050.
[22] SUN J, DENG Y, SHI J, et al. MicroRNA‑542‑3p represses OTUB1 expression to inhibit migration and invasion of esophageal cancer cells. Mol Med Rep. 2020;21(1):35-42.
[23] ZHANG HM, KUANG S, XIONG X, et al. Transcription factor and microRNA co-regulatory loops: important regulatory motifs in biological processes and diseases. Brief Bioinform. 2015;16(1):45-58.
[24] TONG W, WENZE G, LIBING H, et al. Exploration of shared TF-miRNA‒mRNA and mRNA-RBP-pseudogene networks in type 2 diabetes mellitus and breast cancer. Front Immunol. 2022;13:915017.
[25] XIAO Z, ZHOU M, JI X, et al. Research progress of microRNA-21 in femoral head necrosis: a review. Asian J Surg. 2023;46(7):3003-3004.
[26] CUI Y, HUANG T, ZHANG Z, et al. The potential effect of BMSCs with miR-27a in improving steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. Sci Rep. 2022;12(1):21051.
[27] ZHUANG Y, CHENG M, LI M, et al. Small extracellular vesicles derived from hypoxic mesenchymal stem cells promote vascularized bone regeneration through the miR-210-3p/EFNA3/PI3K pathway. Acta Biomater. 2022;150:413-426.
[28] CHEN Y, YU H, ZHU D, et al. miR-136-3p targets PTEN to regulate vascularization and bone formation and ameliorates alcohol-induced osteopenia. FASEB J. 2020; 34(4):5348-5362.
[29] NAN K, ZHANG Y, ZHANG X, et al. Exosomes from miRNA-378-modified adipose-derived stem cells prevent glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head by enhancing angiogenesis and osteogenesis via targeting miR-378 negatively regulated suppressor of fused (Sufu). Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):331.
[30] LI G, LIU H, ZHANG X, et al. The protective effects of microRNA-26a in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by repressing EZH2. Cell Cycle. 2020; 19(5):551-566.
[31] CHEN Y, TANG B, JIANG W, et al. miR-486-5p attenuates steroid-induced adipogenesis and osteonecrosis of the femoral head via TBX2/P21 axis. Stem Cells. 2023;41(7):711-723.
[32] KONG L, ZUO R, WANG M, et al. Silencing microRNA-137-3p, which Targets RUNX2 and CXCL12 prevents steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by facilitating osteogenesis and angiogenesis. Int J Biol Sci. 2020;16(4):655-670.
[33] LIMLAWAN P, MARGER L, DURUAL S, et al. Delivery of microRNA-302a-3p by APTES modified hydroxyapatite nanoparticles to promote osteogenic differentiation in vitro. BDJ Open. 2023;9(1):8.
[34] YUAN X, SHI L, GUO Y, et al. METTL3 regulates ossification of the posterior longitudinal ligament via the lncRNA XIST/miR-302a-3p/USP8 axis. Front Cell Dev Biol. 2021;9:629895.
[35] 杨礼庆,董成建,朱姝.成骨分化与修复调控转录因子Runx2在股骨头坏死组织中的表达:非随机平行对照临床观察试验方案[J].中国组织工程研究, 2016,20(17):24529-24534.
[36] LIU DD, ZHANG CY, LIU Y, et al. RUNX2 regulates osteoblast differentiation via the BMP4 signaling pathway. J Dent Res. 2022;101(10):1227-1237.
[37] WANG FS, CHEN YS, KO JY, et al. Bromodomain protein BRD4 accelerates glucocorticoid dysregulation of bone mass and marrow adiposis by modulating H3K9 and Foxp1. Cells. 2020;9(6):1500.
[38] TAI P, WUH, VAN WIJNEN AJ, et al. Genome-wide DNase hypersensitivity, and occupancy of RUNX2 and CTCF reveal a highly dynamic gene regulome during MC3T3 pre-osteoblast differentiation. PLoS One. 2017;12(11):e188056.
[39] YU S, GUO J, SUN Z, et al. BMP2-dependent gene regulatory network analysis reveals Klf4 as a novel transcription factor of osteoblast differentiation. Cell Death Dis. 2021;12(2):197.

引言

股骨头坏死是一种以髋关节软骨下骨微骨折和股骨头塌陷为特征的退行性疾病，约60%的无症状患者可迅速进展到髋关节功能障碍，其中过量或滥用类固醇类药物是股骨头坏死的直接危险因素之一[1-2]。大量的研究表明激素性股骨头坏死的发病机制与微循环受损、成骨分化和脂肪分化不平衡、脂肪栓塞、凝血障碍和髓内压力变化相关，同时激素性股骨头坏死是多因素、多环节及多基因共同调节的复杂过程，导致目前对激素性股骨头坏死的发病机制仍存不足且尚未发现有效的预测标记物。因此，识别激素性股骨头坏死中新的潜在靶基因对探索激素性股骨头坏死的发病机制和指导治疗具有重要意义[3-4]。
基因修饰对调节RNA表达和维持生物学功能至关重要，其中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine，m6A)修饰是mRNA最常见和最丰富的修饰方式之一，参与基因转录后修饰过程[5]。m6A甲基化广泛参与RNA的剪接、翻译、衰变和折叠等过程，在干细胞定向分化、组织修复过程中发挥关键作用，当m6A甲基化异常时常会导致胚胎发育及组织分化异常[6-7]。研究发现，METTL14等m6A甲基转移酶可通过激活Wnt信号通路，从而影响激素性股骨头坏死中骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化、调控骨髓间充质干细胞成骨分化和成脂分化平衡等过程[8]，但目前有关激素性股骨头坏死与m6A相关性及分子机制的研究尚未见报道，由m6A基因介导的转录因子(transcription factor，TF)-miRNA分子调控网络尚不清楚。
基于此，实验将利用生物信息分析技术对GEO数据库中的激素性股骨头坏死表达谱进行分析，筛选出m6A-差异表达的基因(differentially expressed genes，DEGs)并构建了TF-m6A-miRNA网络，分析激素性股骨头坏死中具有潜在调控功能的m6A基因及其作用靶点和信号通路，为揭示激素性股骨头坏死的发病机制和靶向治疗提供新的理论参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息学分析结合外部数据集比较验证，组间比较采用Student’s t-test检验。
1.2 时间及地点实验于2023年6月至2023年10月在遵义医科大学第二附属医院骨外科和广州医科大学附属第二医院骨科完成。

1.3 资料从基因表达综合数据库GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中检索与激素性股骨头坏死相关的mRNA表达谱数据集，符合研究目的并最终使用的数据集编号为GSE123568，检测平台为GPL15207 (Affymetrix Human Gene Expression Array)，数据来源于中国中医科学院中药研究所(提交日期：2018-12-10)。该数据集共有40例样本，其中30例为使用类固醇后发生股骨头坏死患者的外周血清样本(男13例，女17例)，10例为非激素性股骨头坏死患者的外周血清样本(男7例，女3例)。文章所用数据集均从公共数据库GEO下载，GEO公共数据库允许研究人员出于科学目的进行进一步分析。实验中使用的软件及数据库见表1。

1.4 方法
1.4.1 差异表达基因分析使用R软件中的“sva R”包对数据集的批次效应进行矫正，然后使用R软件中的“limma”R包对激素性股骨头坏死组和对照组之间的DEGs进行分析。DEGs筛选阈值标准为|Log2FC|> 0.5和P.adj < 0.05，通过R软件中的“ggplot2”和“pheatmap”R包对所有DEGs绘制火山图和热图。
1.4.2 GO及KEGG富集分析使用R软件中的“clusterProfiler”“EnrichPlot”
R包对DEGs进行基因本体论(GO)中的生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞成分(cellular component，CC)进行分析，同时用R软件中的“clusterProfiler”“EnrichPlot”R包对DEGs进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，最后使用R软件中的“ggplot2”包进行可视化。
1.4.3 m6A-DEGs识别与构建PPI互作网络从DEGs中提取27个m6A相关基因的数据，包括9个Writers(METTL3，METTL14，METTL16，WTAP，VIRMA，ZC3H13，ZCCHC4，RBM15，RBM15B，CBLL1)，15个Readers(YTHDC1，YTHDC2，YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，HNRNPC，FMR1，LRPPRC，HNRNPA2B，IGFBP1，IGFBP2，IGFBP3，RBMX，ELAVL1，IGF2BP1)，3个Erasers(FTO，ALKBH5，ALKBH3)，使用“ggplots”包对m6A-DEGs进行可视化并构建热图，基因表达量差异使用Mann-Whitney U检验，P < 0.05代表差异具有显著性意义。此外，将提取到的m6A-DEGs导入STRING数据库构建PPI网络图，然后使用Cytoscape软件对m6A-DEGs进行分子相互作用可视化，并利用“度(Degree)”算法对m6A-DEGs进行排序以筛选出前50%的基因作为核心基因。
1.4.4 核心m6A-DEGs互作蛋白质分析将7个核心m6A-DEGs基因导入GeneMANIA数据库中，然后绘制同心二分类图，根据互作基因GO功能富集功能结果，勾选前5位富集结果为网络图节点着色。
1.4.5 核心m6A-DEGs潜在miRNA及TF预测及可视化分析利用miRTarBase，miRDB及TargetScan数据库预测7个核心m6A-DEGs潜在的miRNAs并作交集分析，同样使用ChIPBase和hTFtarget数据库预测7个核心m6A-DEGs潜在的TFs并作交集分析，预测交集结果分别使用Cytoscape软件进行可视化。
1.4.6 核心m6A-DEGs的外部数据集验证从GEO数据库中下载股骨头坏死数据集GSE74089表达谱数据，该数据集基于平台GPL13497(Expression profiling by array)共纳入了8例患者样本，包括4例股骨头坏死患者的软骨样本和4例健康人群股骨头软骨样本，通过分析7个核心m6A-DEGs 在GSE74089的表达量并构建箱线图，然后与GSE123568中的表达数据进行交叉验证。
1.5 主要观察指标 DEGs基因数量、DEGs基因GO/KEGG富集结果、DEGs基因中m6A相关基因的表达量及GO/KEGG富集结果、Degree算法筛选核心m6A基因、在线数据库筛选并构建TF-m6A-miRNA调控网络
1.6 统计学分析文章中所有数据的统计分析均使用R软件(4.2.3版)完成，文中数值均符合正态分布，计量数据以x±s表示，组间比较采用Student’s t-test(双尾t检验)，所有假设以α=0.05为检验水准，当P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

目前研究表明股骨头坏死的发病机制主要包括脂质代谢紊乱、骨髓内高压、血管内凝血障碍、骨细胞凋亡等，导致其临床治疗极富挑战[9]。激素性股骨头坏死常因长期和超剂量使用糖皮质激素药物导致，通常认为长期使用糖皮质激素会导致股骨头血供受损、骨细胞和骨髓成分死亡，进而导致结构改变、股骨头塌陷和关节功能障碍，但激素性股骨头坏死的确切发病机制仍不清楚[10-11]。目前，随着基因芯片及全基因组测序等技术的快速发展，基因组学已广泛运用于阐述疾病的基因调控机制，实验利用生物信息学技术从数据集GSE123568中鉴定了差异表达的m6A相关基因并构建了TF-mRNA-miRNA网络，初步探讨了m6A修饰在激素性股骨头坏死中的作用机制。
m6A修饰是疾病发生和发展的重要调控因子，但m6A在激素性股骨头坏死中的研究较少，探索m6A在激素性股骨头坏死中的表达模式及作用将有助于了解激素性股骨头坏死的发生发展。实验筛选出了7个核心m6A基因包括YTHDF3，YTHDF1，YTHDF2，ALKBH5，METTL3，HNRNPA2B1及HNRNPC，7个核心m6A基因与骨骼重塑过程密切相关，如ALKBH5通过去甲基化作用促进CYP1B1降解缓解间充质干细胞衰老和延缓骨关节炎进展，METTL3可预防雌激素缺乏引起的骨质疏松、HNRNPC对维生素D激素1，25-二羟维生素D的转录具有显著的抑制作用、敲除YTHDC2能促进人骨髓间充质干细胞成骨分化并抑制成脂分化[12-13]。为进一步挖掘与激素性股骨头坏死发生发展有关的靶点，实验使用GENEMANIA数据库构建了激素性股骨头坏死中与核心m6A差异基因的互作网络，除了互作到WTAP及METTL4等其他m6A基因外，还发现了部分与骨骼重塑过程中细胞血管分化相关的基因，如表皮生长因子8(MFGE8)作为一种破骨细胞稳态调节因子可抑制炎性骨丢失[14]、DiGeorge综合征关键区基因8(DGCR8)依赖性miRNA对破骨细胞骨代谢至关重要[15]，其他互作的基因在骨代谢及激素性股骨头坏死尚未见研究，但与核心基因的密切相关性可作为进一步研究的靶点。
m6A核心基因的GO和KEGG分析主要富集在细胞因子产生的正向调节、骨髓细胞分化与发育、免疫受体活性、破骨细胞分化过程及AMPK与白细胞介素17信号通路，成骨细胞及破骨细胞分化、内皮细胞血管生成基因的甲基化修饰与骨骼重塑过程密切相关，如GIT1缺失可能通过上调Notch信号通路的表达来抑制骨髓细胞向破骨细胞分化从而对类固醇诱导的股骨头坏死产生保护作用[16]，敲除破骨细胞中的IKKe可抑制甲强龙诱导的股骨头坏死进展[17-18]。AMPK信号通路在骨骼代谢过程中发挥重要调控作用，与破骨细胞和成骨细胞的增殖分化等密切相关，WANG等[19]研究发现，AMPK蛋白的磷酸化可通过诱导自噬促进骨髓间充质干细胞的成骨分化和抗氧化反应，JIANG等[20]发现在褪黑素促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化过程中与AMPK/β-catenin信号通路激活相关，白细胞介素17在体外也可刺激成骨细胞分化、增殖、矿化和破骨细胞生成[21]。综上GO与KEGG结果，表明7个核心m6A基因与骨细胞分化密切相关，它们在激素性股骨头坏死中的发生发展中具有潜在的调控作用。
激素性股骨头坏死的发生发展由多个基因组成的网络共同调控，研究发现TF和miRNA 在基因网络中以循环形式发挥协同调控作用，TF通过与靶基因启动子区域结合来调节靶基因转录，miRNA作为一种非编码 RNA通过抑制mRNA翻译或降解来抑制靶基因表达，最近的研究表明由二者构成的TF-mRNA-miRNA网络细胞的发育、增殖、分化、代谢和凋亡等多个生理过程中发挥着重要作用[22-24]。已有研究发现多个miRNA在骨骼重塑过程中参与调控血管生成、破骨细胞和成骨细胞分化[25-26]，如miR-210-3p可促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和骨再生过程中的新血管重建[27]，miR-136-3p以PTEN为靶点调节骨形成并改善乙醇引起的骨质流失[28]，miRNA也参与调控在类固醇诱导的股骨头坏死过程的发生发展，如miRNA-26a通过抑制EZH2可以抑制激素性股骨头坏死的发展、miR-486-5p通过TBX2/P21轴减弱类固醇诱导的脂肪生成和股骨头坏死[29-31]。实验通过3个miRNA预测数据库miRTarBase，miRDB及TargetScan筛选出了44个重叠miRNA，其中如miRNA-137-3p通过靶向Runx2和CXCL12促进成骨和血管生成以改善激素性股骨头坏死[32]，miR-302a-3p可促进成骨细胞成骨分化及通过靶向m6A基因中的METTL3调节初级韧带纤维的成骨分化[33-34]。转录因子参与调控基因表达，在骨相关疾病如股骨头坏死中，大量的研究已证实Runt相关转录因子2作为特异性转录因子可增强间充质干细胞成骨分化以用于治疗修复骨缺损及骨坏死[35-36]。实验中共识别了7个关键m6A基因的79转录因子，其中FOXA1，BRD4，MAZ，CTCF，E2F1，EP300，ERG，ETS1，FLI1，GABPA，HDAC1及KLF4等转录因子调控基因数量最多。BRD4通过调节H3K9和Foxp1发挥缓解糖皮质激素对骨质流失和骨髓脂肪化的加速作用[37]，染色质相关转录因子CTCF与RUNX2是骨发育过程中必需的控制基因[38]，KLF4是控制 Sp7+谱系成骨细胞分化的新型转录因子[39]。因此，实验推测上述miRNA和TF可能参与干细胞成骨分化以修复骨缺损，它们有望成为激素性股骨头坏死潜在的潜力靶点。
实验通过生物信息学分析方法共筛选出激素性股骨头坏死中7个核心m6A-DEGs并构建了TF-m6A-miRNA调控网络，尽管筛选的7个m6A基因、TF及miRNA可能是影响激素性股骨头坏死发进展的调控基因。但该研究存在一定的局限性：首先，GEO数据库中关于激素性股骨头坏死的数据集偏少，实验中使用的验证数据集GSE74089数据集为股骨头坏死数据，这可能使分析结果的相互验证受到一定影响；其次，实验尚未在体内外进一步验证上述核心m6A-DEG基因的诊断价值、潜在作用及机制，因此在后续的研究中将在临床样本中检测上述基因的表达模式并通过分子生物学实验在体内外探索m6A调控影响激素性股骨头坏死发展的生物学过程。
综上所述，此次研究使用生物信息学方法对GEO数据集分析后共筛选出了7个与激素性股骨头坏死相关的m6A基因，通过功能分析表明它们与骨髓细胞的分化、发育等密切相关，此外还构建了多个TF与miRNA组成的TF-mRNA-miRNA调控网络，为进一步深入探讨m6A修饰在激素性股骨头坏死中的作用机制及治疗靶点提供了研究方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

m6A相关基因在激素性股骨头坏死中的生物信息学分析

Bioinformatics analysis of m6A-associated genes in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	盛思琪, 谢琳, 赵翔宇, 姜怡邓, 吴凯, 熊建团, 杨安宁, 郝银菊, 焦运. miR-144-3p参与高蛋氨酸饮食诱导Cbs+/-小鼠的肝细胞自噬[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1289-1294.
[2]	胡智星, 李群, 杨超, 王潇潇, 方罗昌婷, 侯吴琼, 林娜, 陈卫衡, 刘春芳, 林雅. 不同因素影响激素性股骨头坏死家兔模型成模效果的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 976-984.
[3]	卜献忠, 卜保献, 许伟, 张驰, 张翼升, 钟远鸣, 李智斐, 唐福波, 麦威, 周劲衍. 急性期神经根型颈椎病患者的血清差异蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 535-541.
[4]	兰垚, 陈浏阳, 宋文慧. 椎间盘退变伴氧化应激关键生物标志物：生物信息学和机器学习算法的识别[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5591-5597.
[5]	唐路路, 潘晓佳, 赖英桃, 王力. 铁死亡对压疮的调控机制：生物信息学分析及实验结果验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5656-5661.
[6]	陆晓铃, 刘斌, 徐斌. 类风湿关节炎脂肪酸代谢相关基因的生物信息学鉴定与验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5116-5121.
[7]	陈冠廷, 张琳琪, 王希茜, 陈旭. 自噬及铁死亡相关靶点与慢性肾病肾功能损伤的进展：生物信息学分析及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(32): 5122-5129.
[8]	张弛可, 王飞清, 吴丹, 杨波, 成金阳, 陈娟, 唐东昕, 刘洋, 李艳菊. 急性髓系白血病细胞条件培养液对间充质干细胞的生物学影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4995-5002.
[9]	吴齐翔, 房辰雨, 张蕾. 炎症环境下白细胞介素1β增强间充质干细胞的迁移及黏附能力[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 5048-5054.
[10]	袁平, 王志华, 王伟舟, 王文通, 何飞. 外泌体微小RNA与骨关节疾病：作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 5063-5069.
[11]	胡玲莉, 李娜, 李京阳, 张二云, 陈钰, 顾颖. 非编码RNA和外泌体在妊娠期糖尿病发生机制中的作用及早期诊断价值[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 5070-5077.
[12]	熊洋, 周世博, 俞兴, 毕连涌, 杨济洲, 王逢贤, 曲弋, 杨永栋, 赵丁岩, 赵赫, 仇子叶, 姜国正. 获得性异位骨化的分子生物学机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(30): 4881-4888.
[13]	翟生, 艾克热木江•阿尔肯, 张峥, 日夏提•帕尔哈提, 郝飞虎. circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4455-4460.
[14]	李树栋, 梁学振, 骆帝, 李嘉程, 阎博昭, 李刚. 绝经后骨质疏松症潜在铁死亡及细胞焦亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4511-4515.
[15]	陈相汕, 刘桦, 孙伟康, 李华南. m6A甲基化调控骨代谢防治骨质疏松症的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4572-4577.