铁死亡对压疮的调控机制：生物信息学分析及实验结果验证

doi:10.12307/2024.600

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5656-5661.doi: 10.12307/2024.600

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铁死亡对压疮的调控机制：生物信息学分析及实验结果验证

唐路路1，潘晓佳1，赖英桃2，王力3

1广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405；3广州中医药大学基础医学院，广东省广州市 510006

收稿日期:2023-11-17 接受日期:2023-12-21 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 赖英桃，主任护师，硕士生导师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405 王力，广州中医药大学在读博士，广州中医药大学基础医学院，广东省广州市 510006
作者简介:唐路路，男，1997年生，江苏省南通市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中西医结合大数据分析研究。
基金资助:
广东省中医药局科研项目(20231128)，项目负责人：赖英桃

Regulatory mechanism of ferroptosis on pressure ulcers: bioinformatics analysis and experimental validation

Tang Lulu1, Pan Xiaojia1, Lai Yingtao2, Wang Li3

1The First College of Clinical Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3School of Basic Medical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2023-11-17 Accepted:2023-12-21 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Lai Yingtao, Chief nurse practitioner, Master’s supervisor, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China Wang Li, PhD candidate, School of Basic Medical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Tang Lulu, Master candidate, First Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
Scientific Research Project of Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine, No. 20231128 (to LYT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生物信息学：主要研究基因组、转录组及蛋白质组等高通量生物学数据的分析、挖掘和解释，运用各种算法和工具对生物大数据进行处理和分析，以发现生物体内基因表达、蛋白质结构、代谢途径及信号转导等方面的规律。
铁死亡：是一种铁依赖性的非细胞凋亡形式的细胞死亡，由铁依赖性活性氧堆积和脂质过氧化引起。

背景：铁死亡介导的缺血再灌注损伤对压疮的发生发展起重要作用，可能存在压疮相关的铁死亡生物标志物，但其机制尚未阐明。

目的：通过生物信息学手段探讨压疮的分子机制，寻找压疮过程中铁死亡相关差异基因，为其临床治疗提供新的视角。
方法：使用GEO数据库和FerrDb数据库下载数据集并进行预处理。对单细胞转录组测序数据进行聚类和占比分析、代谢活性和拟时序分析、细胞通讯分析、铁死亡基因集细胞识别和富集分析，确定铁死亡差异基因，并通过动物实验进一步验证。将20只 SD 大鼠随机分为正常组和模型组，每组10只。正常组大鼠不进行任何处理，模型组大鼠采用缺血再灌注循环周期模式制备压疮大鼠模型，采用荧光定量 PCR和免疫印迹检测压疮大鼠创面组织内差异表达基因和蛋白的变化。

结果与结论：①单细胞转录组测序数据聚类划分为6种细胞类型，压疮组2型和3型角质形成细胞占比较高。②不同细胞亚群之间具有明显的代谢异质性和演变轨迹。③2型和3型角质形成细胞在细胞通讯中作用最强，2型角质形成细胞配体-受体强度最佳。④2型角质形成细胞铁死亡得分较高，有显著上调或下调的差异基因，并得到27个GO富集条目、20个KEGG 富集条目和24个铁死亡相关差异基因，以谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)和长链酯酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4)为主。⑤动物实验验证了与正常组相比，模型组大鼠铁死亡抑制蛋白GPX4表达下调，铁死亡促进蛋白ACSL4表达上调。上述结果证实，压疮组织中存在铁死亡，GPX4和ACSL4为调控压疮组织中铁死亡的重要基因。

https://orcid.org/0000-0003-0214-1491(唐路路)；https://orcid.org/0000-0002-6186-836X(赖英桃)；
https://orcid.org/0000-0002-2998-2875(王力)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 生物信息学, 单细胞转录组测序, 压疮, 缺血再灌注, 组织损伤, 慢性创面, 铁死亡, 氧化应激, GPX4, ACSL4

Abstract: BACKGROUND: Ferroptosis-mediated ischemia-reperfusion injury plays a crucial role in the occurrence and progression in pressure ulcers, and there may be pressure ulcer-associated ferroptosis biomarkers, but the mechanism has not been elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the molecular mechanisms underlying pressure ulcers using bioinformatic analysis, with a focus on identifying differentially expressed genes associated with ferroptosis during the process of pressure ulcer formation, thereby providing novel insights into the clinical treatment of pressure ulcers.
METHODS: The single-cell transcriptome sequencing dataset and ferroptosis-related genes were obtained and preprocessed from the Gene Expression Omnibus (GEO) and FerrDb databases. We performed clustering and proportion analyses, metabolic activity and pseudotime analysis, cell communication analysis, ferroptosis gene set cell population identification, and enrichment analysis to determine differentially expressed genes related to ferroptosis. Animal experiments were then conducted for further validation, with 20 Sprague-Dawley rats randomly assigned into a control group and a model group (n=10 per group). The control group received no treatment, while the model group underwent a cycle of ischemia-reperfusion to establish pressure ulcer models. Changes in differentially expressed genes and proteins in the wound tissues of pressure ulcer rats were detected using fluorescent quantitative PCR and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The single-cell transcriptome sequencing data were clustered into six cell types, with a higher proportion of type 2 and type 3 keratinocytes observed in the pressure ulcer group. There was evident metabolic heterogeneity and evolutionary trajectory among cell populations. Type 2 and type 3 keratinocytes exhibited stronger cell communication, while type 2 keratinocytes demonstrating optimal ligand-receptor interactions. Type 2 keratinocytes demonstrated higher scores for ferroptosis, accompanied by significant upregulation or downregulation of specific genes. A total of 27 Gene Ontology enrichments, 20 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichments, and 24 ferroptosis-related differentially expressed genes, including glutathione peroxidase 4 (GPX4) and acyl-CoA synthetase long chain family member 4 (ACSL4), were identified. Animal experiments further confirmed the downregulation of GPX4, the ferroptosis-inhibiting protein, and the upregulation of ACSL4, the ferroptosis-promoting protein, in the model group. Overall, these findings indicate the presence of ferroptosis in pressure ulcer tissue. GPX4 and ACSL4 are important genes regulating ferroptosis in pressure ulcer tissues.

Key words: bioinformatics, single-cell transcriptome sequencing, pressure ulcer, ischemia-reperfusion, tissue injury, chronic wound, ferroptosis, oxidative stress, GPX4, ACSL4

中图分类号:

唐路路, 潘晓佳, 赖英桃, 王力. 铁死亡对压疮的调控机制：生物信息学分析及实验结果验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5656-5661.

Tang Lulu, Pan Xiaojia, Lai Yingtao, Wang Li. Regulatory mechanism of ferroptosis on pressure ulcers: bioinformatics analysis and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5656-5661.

图/表（结果） 6

2.1 研究样本基本信息共纳入数据集GSE137897中的4名健康对照者的未受伤皮肤样本和急性损伤第7天的伤口样本(H1-H4)，以及5例4级脊髓损伤压疮患者的慢性未愈合伤口样本(PU1-PU5)，健康对照者的年龄、性别、种族和身体位置方面与这些压疮患者相匹配。表2展示了样本及对应患者的临床特征和细胞数量。

2.2 单细胞聚类结果和比例分布对数据集进行归一化、降维、批次校正、聚类后，获得了1 170个细胞(每个细胞平均5 223个基因)的压疮单细胞转录组图谱。所有细胞被划分为6种细胞类型，包括黑色素细胞(melanocytes，TYRP1，CDH19，MLANA)、免疫细胞 (immune cells，CD74，PTPRC，CD45)、1型角质形成细胞 (KC_1，KRT1，KRT10，DMKN，CHP2)、2型角质形成细胞 (KC_2，KRT15，IFITM1，CCL2，POSTN，CXCL14)、3型角质形成细胞 (KC_3，KRT17，KRT6A，KRT6B，S100A7，S100A8)、4型角质形成细胞 (KC_4，PBK，CDCA8，COL17A1，ASS1)，注释为6个细胞亚群，见图1A。每个细胞亚群都包含正常完整表皮、正常急性伤口表皮和压疮伤口表皮3种样本类型的细胞，见图1B。热图展示每个细胞亚群中差异表达基因，验证了细胞注释的准确性，见图1C。所有样本含有至少4种细胞类型，包括免疫细胞、2型角质形成细胞、3型角质形成细胞、4型角质形成细胞，同时不同样本在细胞类型占比上的差异较大，见图1D。与正常完整表皮组和正常急性伤口表皮组相比，压疮伤口表皮组2型角质形成细胞和3型角质形成细胞所占比例较高，见图1E。

2.3 细胞亚群的代谢变化和拟时序演变不同细胞亚群之间具有明显的代谢异质性。免疫细胞在重链硫酸软骨素/皮肤素类聚糖生物合成显著表达；角质形成细胞主要富集于组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等相关功能；黑色素细胞富集于初级胆酸生物合成、其他类型的O-聚糖生物合成等功能，见图2A。
此外，细胞轨迹可以分为2个分化阶段，免疫细胞、3型角质形成细胞和4型角质形成细胞主要处在分化的起始位置；1型角质形成细胞和2型角质形成细胞处在分化的中间；黑色素细胞位于拟时序轨迹的末端，见图2B。“CytoTRACE”得分越高表明细胞的分化干性越高，则分化程度越低，结果显示免疫细胞、3型角质形成细胞和4型角质形成细胞具有较高的的干性，验证了拟时序轨迹的分轨过程，见图2C。

2.4 细胞通讯分析结果通过“CellChat” 识别不同细胞类型的差异过表达配体和受体，结果表明2型角质形成细胞和3型角质细胞细胞不仅在细胞联系的数量和细胞连接的强度上表现最佳，见图3A；而且在配受体数量和强度上表现最佳，具有较高的相互作用权重，见图3B。在进一步的配体-受体分析中，发现上游配体2型角质形成细胞对黑色素细胞的细胞间作用最强，PASP/LRP1 是主要的贡献者；下游受体2型角质形成细胞对自身的细胞通讯作用最强，COL18A1/GPC1是主要的贡献者，见图3C。

2.5 铁死亡对压疮的影响通过“Aucell”计算铁死亡基因集在每个细胞的基因中表达情况。结果显示，1型角质形成细胞和2型角质形成细胞的铁死亡得分最高，见图4A。在模型组织细胞中，检测显著上调或下调的2型角质形成细胞差异基因，见图4B。对差异基因进行GO和KEGG富集分析，得到27个GO富集条目和20个KEGG富集条目，见图4C，D。将2型角质形成细胞的差异基因与铁死亡基因集取交集，得到24个铁死亡相关差异基因，见图4E。随后，基于铁死亡差异基因，评估铁死亡抑制蛋白GPX4和铁死亡促进蛋白ACSL4在不同组织中的表达情况。结果显示，与正常完整表皮组相比，正常急性伤口表皮组和压疮伤口表皮组中GPX4表达量下降(P < 0.000 1)，见图4F；与正常完整表皮组和正常急性伤口表皮组相比，压疮伤口表皮组中ACSL4表达量上升 (P < 0.000 1)，见图4G。

2.6 动物实验验证压疮组织中存在铁死亡经荧光定量 PCR 检测发现，与正常组比较，模型组GPX4 mRNA相对表达量显著减少 (P < 0.01)，而 ACSL4 mRNA 相对表达量显著增多 (P < 0.05)，见图5A。经免疫印迹检测，正常组GPX4 蛋白表达较多，而 ACSL4 蛋白表达较少；模型组GPX4 蛋白表达较少，而 ACSL4 蛋白表达较多，见图5B。与正常组比较，模型组GPX4 蛋白相对表达量显著减少 (P < 0.05)，而 ACSL4 蛋白相对表达量显著增多 (P < 0.000 1)，见图5C。

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引言

材料方法

1.1 设计运用单细胞转录组测序，分析细胞类型及比例、细胞代谢及分化、细胞信号通讯、铁死亡基因集细胞识别和富集通路，确定铁死亡差异基因，并进行随机对照动物实验的验证，两样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年3-6月在广州中医药大学第一附属医院与广州中医药大学基础医学院完成。
1.3 资料
1.3.1 生物信息数据库在GEO数据库(Gene Expression Omnibus) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载单细胞转录组谱数据 (数据集编号：GSE137897[18])，该数据集包括来自4名健康受试者的正常完整表皮和正常急性伤口表皮、5例患者压疮伤口表皮3个部位的单细胞测序数据。从 FerrDb 数据库 (http://www.zhounan.org/ferrdb/ current/)中下载铁死亡基因集。
1.3.2 实验动物选取野生型 SPF 级健康雄性SD大鼠20只，6周龄，体质量160-180 g，购于广州中医药大学动物实验中心，许可证号为 SYXK (粤)2018-092。大鼠实验饲养条件为无病原体环境，室温22-24 ℃，湿度50%-60%，光照/暗循环12 h。实验大鼠在上述环境自由进食和饮水适应性喂养1周后进行实验。动物实验方法符合美国国立卫生院颁布的《实验动物管理和使用指南》。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验方案于2023-06-01经广州中医药大学第一附属医院实验动物伦理分委员会批准，批准号：GZTCMF1-2022026。
1.3.3 主要试剂和仪器包括 BCA 蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、GAPDH 抗体、二抗抗兔IgG (碧云天生物)；蛋白 marker (美国Thermo Scientific公司)；Tween-20、ECL发光液(美国Millipore公司)；脱脂奶粉(美国BD公司)；Triz(凯基生物)；Triton、PVDF膜、Reverse Transcription Kit、SYBR Green qPCR Mix (北京全式金公司)；谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)抗体、长链酯酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4)抗体(艾比玛特生物医药有限公司)；抗体稀释液(武汉博士德生物)；PCR 扩增仪(美国Bio-Rad公司)；低温高速离心机(德国eppendorf公司)；电泳仪、Mini PROTEAN 垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)；TS-1摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；实时定量PCR仪(美国ABI公司)；全自动化学发光图像分析仪(上海天能公司)；EP管、冻存管及96孔板(美国Corning公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 单细胞转录组测序分析铁死亡在压疮中的发生发展
单细胞数据预处理和质量控制：利用“Seurat”R 软件包导入和处理原始基因表达矩阵GSE137897。通过采取以下数据质控标准去除低质量细胞：①每个细胞中检测到的基因数量< 4 000；②每个细胞的分子标签(unique molecular indentifier，UMI)数量< 20 000；③线粒体基因含量< 10%。使用 harmony 去除批次效应。将经过上述质控标准后剩余的1 170个细胞的基因表达矩阵标准化为总细胞UMI计数。
单细胞聚类、降维和注释：对预处理后的单细胞转录组测序对象进行主成分分析，并基于高度可变基因前20个主成分可视化进行细胞聚类；通过t分布随机邻居嵌入 (t-distributed stochastic neighbor embedding，
tSNE) 算法对数据进行降维分析；使用 FindAllMarks 函数和双侧 Wilcox 检验成对比较鉴定差异表达基因，筛选条件设定为 P-value < 0.05、log2FC > 0.5和min.pct > 0.5。根据差异基因的表达情况和结合已有文献的标记基因对细胞群进行注释分群。
单细胞代谢活性分析：为了评估不同细胞代谢活性，使用“scMetabolism”R包从单细胞水平对不同细胞群的不同途径代谢活性进行定量和可视化，以确定具有显著差异的代谢通路。
单细胞拟时序分析：为了探究不同细胞在转录调控过程中异步状态，使用“Monocle”和“CytoTRACE”R包构建单细胞分化轨迹。
细胞信号通讯分析：细胞群之间需要通过接收、处理和传递与环境和自身的信号进行信息传递和相互调控。细胞间的信息交流是以配体和其受体间复杂的反应及特定细胞信号通路信号的激活反应为基础。为了定位和研究细胞群之间的配体-受体相互作用，使用“CellChat”R包来推断不同细胞间的交流和通讯[19]。
铁死亡基因集细胞识别和富集分析：使用“AUCell”R 包在单细胞数据中识别具有铁死亡基因集的细胞。AUCell”利用曲线下面积来统计输入基因集的关键子集是否在每个细胞的表达基因中富集，基于排名来估计铁死亡评分。以差异倍数|log2FC| > 0.5，P < 0.05作为条件，筛选压疮组织差异基因。使用“clusterProfiler”R包对差异基因进行基因本体论(gene ontology，GO)、京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia
of Genes and Genomes，KEGG) 富集分析[20]，P < 0.05为差异有显著性意义。将压疮组织差异基因与铁死亡基因集取交集，得到压疮组织铁死亡差异基因，并评估铁死亡相关蛋白GPX4和ACSL4的表达情况。
1.4.2 动物实验验证模型组织中存在铁死亡

分组及建模：采用随机数字表法将20只 SD 大鼠分为正常组10只、模型组10只。正常组大鼠不做任何处理，常规饲养。模型组大鼠构建2期压疮模型。采用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，备皮处理。采用缺血再灌注循环周期模式构建压疮模型，将大鼠背部皮肤沿正中线提起，对称性扣上2片强力磁片(直径15 mm，厚2 mm)，一个循环为2 h缺血期和0.5 h再灌注期，每天进行5个循环，共3 d。缺血期所有实验大鼠单笼饲养，可自由进食、饮水、活动；再灌注期按照组别同笼饲养。第4天为观察期，若创面出现暗红色，创面周围皮肤红肿，不伴有渗血渗液，实验大鼠有明显疼痛表现[21]，表示造模成功。

荧光定量PCR检测：干预4 d后，取组织块充分研磨后提取总 RNA 并检测其浓度，设计引物序列，设置反转录反应体系，RNA反转录为cDNA，实时荧光定量PCR反应，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，循环35次，检测相关mRNA表达情况。引物序列详见表1。

免疫印迹检测：取组织块充分研磨后加入裂解液，应用 BCA 法计算蛋白浓度，行蛋白质定量。然后依次进行蛋白变性、SDS-PAGE 凝胶电泳分离、转膜、封闭后，加入一抗和二抗，漂洗后开始显影，凝胶扫描成像系统进行分析GPX4和ACSL4蛋白的表达情况。
1.5 主要观察指标 ①细胞类型及比例；②细胞代谢及分化；③细胞信号通讯；④铁死亡基因活性和富集分析结果；⑤压疮大鼠创面组织内GPX4和ACSL4的mRNA和蛋白表达。
1.6 统计学分析使用R软件和GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，事后检验采用 LSD-t检验。 P < 0.05 为差异有显著性意义。该研究的统计学方法已经广州中医药大学统计学专家审核。

讨论

压疮是一种临床常见的慢性创面。尽管压疮患者的死亡率较高[22]，但压疮的分子病理尚未明确，阻碍了有效治疗压疮的发展。为此，实验在单细胞水平上生成了人类伤口边缘表皮的细胞图谱，绘制了正常完整表皮、正常急性伤口表皮和压疮伤口表皮之间细胞组成和分子状态的差异。研究发现，在皮肤伤口愈合过程中，角质形成细胞在伤口周围增殖和迁移完成再上皮化，闭合创面并重建组织稳态，这表明角质形成细胞在慢性创面愈合过程中发挥着重要作用[23-26]。对细胞进行聚类和使用细胞标志性基因注释，注释出免疫细胞、黑色素细胞、1型角质形成细胞、2型角质形成细胞、3型角质形成细胞和4型角质形成细胞。将压疮伤口表皮与正常急性伤口表皮进行比较，发现大多数病理变化发生在2型角质形成细胞。对各组中细胞群的比例分布进行分析，发现压疮2型角质形成细胞相较于正常组织组明显减少，这表示2型角质形成细胞可能在压疮中发挥关键作用，这与上述前期研究的结果相一致。进一步对不同细胞亚群进行代谢分析，发现角质形成细胞主要富集于组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等相关功能。拟时序分析也表明了3型角质细胞向2型角质形成细胞的分化，结合代谢途径，发现2型角质形成细胞相较于3型角质形成细胞代谢过程更受抑制。研究证实，在伤口愈合过程，对氨基酸的代谢需求增加，补充适当剂量的氨基酸，尤其是精氨酸，可以在一个或不同阶段促进伤口愈合[27-28]。此外，2型角质形成细胞中 COL18A1和NTF4与配体GCP1和NTRK2广泛表达，这些结果也表明不同配体-受体信号之间的串扰可能是2型角质形成细胞在压疮的重要作用。
研究表明，氧化应激是指机体在遭受各种有害因素刺激下，体内高活性分子如活性氧自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，发生脂质过氧化反应，产生细胞毒性，从而导致组织损伤[29-30]。缺血再灌注是压疮形成最主要的机制，可引起脂质过氧化反应加剧以及细胞内铁超载，导致脂质过氧化产物积累从而发生铁死亡[11，31]。因此，该研究对不同细胞亚群铁死亡状态评分，发现2型角质形成细胞有较高的铁死亡得分，进一步验证了上述发现。对压疮组和正常组织组2型角质形成细胞差异基因进行富集分析，结果发现差异基因参与的生物过程主要为角质形成细胞分化、伤口愈合和皮肤发育，其分子功能主要与钙粘蛋白和肌动蛋白的结合有关。在KEGG富集分析中，差异基因主要参与的信号通路为凋亡通路、 PI3K-Akt 信号通路和白细胞介素17 信号通路。研究表明，在压疮的发生发展过程中，细胞凋亡、炎症反应及新血管生成起着关键作用[32]，富集到的通路均与这些因素相关，表明富集通路的有效性。此外，将差异基因与铁死亡基因集结合取交集，发现了铁死亡相关蛋白 GPX4和ACSL4 为铁死亡差异基因。铁死亡过程中的几个指标，包括谷胱甘肽、GPX4、ACSL4和铁离子，被用来综合评价铁死亡的发生[33]。
GPX4 作为铁死亡的关键调控因子，是一种磷脂氢过氧化物酶，将脂质过氧化物还原为脂质醇，其过程阻止了铁(Fe2+)依赖的有毒脂质活性氧的形成[34-35]。因此，GPX4 的活性对于维持细胞内脂质稳态、防止活性氧积累，从而阻止铁死亡的发生具有重要意义。ACSL4是一种将脂肪酸转化为脂肪酸酰基辅酶A的酶，调节脂质的生物合成。多项研究表明，ACSL4可以促进铁死亡发生，而 GPX4则是起抑制作用[36-38]。该研究中，压疮伤口表皮 GPX4的表达量是降低，而 ACSL4的表达量是升高，符合GPX4抑制铁死亡的发生和 ACSL4促进铁死亡的发生，从单细胞水平揭示了铁死亡在压疮中的发生。为了进一步验证上述结论，实验建立缺血再灌注压疮大鼠模型，探究铁死亡在压疮中的调控作用。一项心肌缺血大鼠模型实验发现心肌组织中 ACSL4 蛋白水平上升，同时 GPX4 水平下降，证实了铁死亡的发生[39]。此次研究结果发现，铁死亡抑制蛋白 GPX4 表达下调，铁死亡促进蛋白ACSL4表达上调，更加说明了压疮组织中存在铁死亡。
综上所述，该研究通过压疮单细胞转录组测序分析了压疮潜在的生理过程，初步构建了压疮单细胞转录组图谱，鉴定了免疫细胞、黑色素细胞和四种角质形成细胞，进一步分析发现2型角质形成细胞在细胞组成比例、细胞代谢、拟时序轨迹和细胞间的通讯较其他细胞在不同组织中都具有更明显的变化。另外，2型角质形成细胞具有更高的铁死亡得分。富集分析发现差异基因主要集中于皮肤发育、角质形成细胞分化等过程和 PI3K-AKT、白细胞介素17 通路。差异基因表达分析筛选了显著上调或下调的基因，发现铁相关蛋白 GPX4和ACSL4 在压疮组织和正常皮肤组织中的表达差异，此外，该实验通过动物实验进一步明确了压疮组织中存在铁死亡，为后续的研究提供指导和方向。但是，此次研究亦存在不足之处，主要是未提出抑制压疮中铁死亡的有效途径，这是日后进一步研究的重点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

铁死亡对压疮的调控机制：生物信息学分析及实验结果验证

Regulatory mechanism of ferroptosis on pressure ulcers: bioinformatics analysis and experimental validation

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